专利名称：一种采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)按照血清型可分为猪圆环病毒I型(简称PCV1)和猪圆环病毒II型(简称PCV2)两种，其中PCVl不具致病性，但能产生血清抗体，PCV2则能对猪只具有较强的易感性，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸疾病综合征(PRDC)、猪皮肤和肾病综合征(PDNS)等多种疾病的主要病原，PCV有7个开放阅读框(ORF)，其中0RF2编码病毒的Cap蛋白，构成病毒的核衣壳。PCVl和PCV2的Cap蛋白 上存在共同的抗原决定簇，但两者之间没有抗原交叉性，所以通常采用致病性PCV2的0RF2替代PCVl的0RF2，构建嵌合型猪圆环病毒PCV1-2，用于防治断奶仔猪多系统衰竭综合症。然而PCV是ー种DNA病毒，病毒变异率低，生物学特性比较特殊，它在细胞上增殖滴度很低，且不引起细胞病变，在研制灭活疫苗和弱毒疫苗的难度很大。目前，国内的猪圆环病毒疫苗大部分依靠传统的转瓶培养法エ艺生产，少量依靠微载体悬浮培养エ艺生产。其中，传统的转瓶培养法是将细胞种从液氮罐中取出来，用培养瓶复苏，待细胞长满培养瓶后，用胰蛋白酶消化细胞，分传成几个培养瓶，依次类推，待培养瓶数量够多时，用胰蛋白酶消化，将消化好的细胞转移到转瓶中生长。细胞在转瓶上长满后，再用胰蛋白酶消化，分传成几个转瓶，这些转瓶可以再传代为多个转瓶，或者接种病毒，接毒后的转瓶经过一段时间后收获病毒。为了提高病毒侵染效率，在接种病毒的同时会添加主要成分为氨基葡萄糖的孵育剂，促进病毒对细胞的侵染，以缩短病毒培养时间。这种エ艺过程简单，可以通过不断地细胞传代，可规模性地复制放大，但是需要不断地分传，操作繁琐，生产劳动强度大，效率低。而使用的培养瓶和转瓶多，占地多，耗能大，在分传时易污染，病毒毒价低，生产的疫苗不同批次间差异明显，所获得的病毒液中细胞碎片、蛋白等杂质较多，后期处理工艺复杂，容易导致疫苗质量稳定性差。微载体悬浮培养エ艺是近年来新兴的细胞生产方式，是在培养容器的培养液中加入对细胞无害的微载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时在培养过程中通过持续搅动使微载体始終保持悬浮状态，使细胞能够与之充分接触。虽然与传统的转瓶培养法エ艺相比，占地少，耗能小，用人少，生产规模更容易扩大，病毒毒价较高，产品质量稳定等优点，但是其生产エ艺存在以下问题①存在细胞与微载体的接触概率和相融性问题，细胞种接种不易均匀；②病毒接种时需排空细胞生长液，在换液时会损失微载体；③微载体颗粒小，难以将其孔隙内的细胞碎片等杂质清洗干净，因此不能回收利用，只能一次性使用，而微载体价格昂贵，造成生产成本高细胞在微载体上的生长状态为伸展形态，接近平面结构，接种病毒后，细胞死亡过程是同步的，即绝大多数的细胞死亡时间接近，而且为了提高病毒侵染效率，在细胞培养液中需要添加主要成分为氨基葡萄糖的孵育剂，促进病毒对细胞的侵染，因此仅能一次性收获病毒。例如40L反应器应用微载体悬浮培养エ艺只能收获30到40L的病毒液，没有达到反应器灌注エ艺的最大生产效率，收获的病毒液体积少，致使生产成本较高。在转瓶培养エ艺和微载体悬浮培养エ艺中，在宿主细胞培养好后，需要用无菌PBS溶液清洗宿主细胞I至2遍，排出PBS溶液后再补加细胞维持液。其目的是清除残余血清、细胞碎片、蛋白等杂质，但是这ー过程对于宿主细胞有损害作用，并会残留少量PBS溶液，由于该溶液只有清洗作用，非宿主细胞生长代谢的必须物，它的存在会影响细胞維持液的浓度，直接影响到细胞生产病毒的效率。NBS篮式生物反应器是美国NBS公司产品，是目前世界上先进的动、植物细胞培养系统，使用时载体填装于载体篮内，搅拌桨从载体篮中间圆孔穿过，其独具特色的篮式搅拌桨不同于其他搅拌桨，使气体交換在搅拌桨中间进行，不与细胞接触，搅拌产生的剪切力影响可以忽略不计。NBS篮式生物反应器解决了剪切力、通气对细胞伤害的问题，为细胞生长提供了良好的生长环境，同时又可以满足细胞生长的各种物质营养的需求，有利于高密度、大規模细胞培养。载体采用NBS公司专用载片Fibra Disk。Fibra Disk内部具有网格状结 构，这些网格状结构构成载体的亲水性三维多孔隙，可以为细胞生长提供很高的生长面积/容积比，如IgFibra disk载体可提供1200cm2的生长面积,增强细胞的贴附能力，促进细胞快速扩增。虽然NBS篮式生物反应器在细胞培养方面已有应用，然而，不同的细胞和病毒对培养环境、培养的エ艺条件都有不同的要求，只有在条件适宜时，培养所得的细胞或病毒的数量多、活性好，而且病毒毒价高。因此在具体应用时，仍需要针对所培养的目标细胞或病毒的培养条件进行摸索。
本发明的目的是提供一种采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法，该方法简单易行，能够极大的降低生产成本，減少宿主细胞的污染概率，明显提高猪圆环病毒抗原的単位毒价，増大批次发酵的病毒液抗原收获量。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的ー种采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法，其包括以下步骤 (1)宿主细胞种的制备 采用常规细胞培养方法培养宿主细胞； (2)篮式反应器接种前的准备 在篮式反应器的载体篮内装入篮式反应器专用的Fibra Disk载体，加入PBS溶液，使载体能够全部浸泡在该PBS溶液液中，做灭菌处理； (3)宿主细胞扩大培养
在向所述反应器内接种步骤(I)所得宿主细胞前，排出反应器内的PBS溶液，加入细胞生长液，先按宿主细胞扩大培养的条件设定好篮式反应器的各项參数，包括温度、溶解氧(DO)、PH和搅拌速率，直到各參数稳定后，再将步骤(I)所得宿主细胞接种至篮式反应器内，让宿主细胞在浸泡于细胞生长液中的Fibra Disk载体上吸附生长，当培养至细胞耗糖量稳定时，接种病毒；
(4)病毒增殖培养
将所述反应器内的细胞生长液排空，补充与排出的细胞生长液等体积的细胞维持液后，接种猪圆环病毒，接毒后36 48h,进行第一次收取病毒液,在收获病毒液后，再向反应器内加入与已收取的病毒液等体积的细胞维持液，对病毒再次进行繁殖复制并收获，如此循环反复多次，直至检测到要收获的病毒液中的细胞耗糖量降至O. 5g/L/天以下时，收获本批次最后一次猪圆环病毒液。本发明人研究发现，在NBS篮式生物反应器上可设定适合宿主细胞繁殖的环境条件，而Fibra Disk载体内部具有亲水性三维多孔隙，为宿主细胞提供较高的生长面积/容积比，宿主 细胞附着在Fibra Disk载体上就能大量繁殖，相比现有技术其数量得以大大的扩增。由于单个宿主细胞的生长形态呈球状，且宿主细胞数量多，因此多个细胞就会聚集成葡萄串状，贴附在载体内部的纤维束上，形成立体结构。而猪圆环病毒是ー种细胞外分泌型病毒，在病毒复制扩增的过程中，病毒是由内至外逐层侵蚀宿主细胞，使宿主细胞逐步死亡，而非同步死亡，即在一部分宿主细胞死亡的同时，另一部份宿主细胞仍存活并在复制病毒，正是因为这样，才具备了可再次收获病毒的可能，并使本发明的多次繁殖收获的病毒制备方法得以实现。接种病毒后，最开始病毒的产量是缓慢增加的，若过早收获病毒含量低，处理成本相对高，不具有经济性。若在48h后再收取病毒，由于病毒含量已较多，病毒在培养条件下不稳定，会出现病毒死亡，造成损失，而在接种病毒后36 48h，病毒的毒价已经可以达到后期制苗的要求。在接种病毒后36 48h，载体上的宿主细胞只是最先被侵蚀的那些细胞及其邻近的那一部分的细胞死亡了，实际上反应器内还有足够的存活着的宿主细胞可以进行后续的病毒繁殖复制。故而，在第一次收取病毒液后，还可以再加入与已收取的病毒液等体积的细胞维持液，维持剩余的未死亡的宿主细胞继续生长以及病毒复制増殖，在一定时间后再进行下一次收取病毒液，如此这般，可多次重复收取病毒液及补充细胞维持液的操作，增大ー个批次发酵的病毒液抗原收获量。而当细胞耗糖量降至O. 5g/L/天以下，溶解氧有明显上升趋势时，此时宿主细胞基本死亡，存活的细胞数量已经很少，已无继续培养的价值，即可停止病毒的复制。本发明所述的细胞生长液是培养宿主细胞，使其数量快速扩增的培养液。所述的细胞维持液是指宿主细胞的数量达到一定数量后，为维持细胞存活或少量増殖的培养液，一般在细胞接种病毒时使用。本发明所述步骤(I)中采用的宿主细胞可以选用对猪圆环病毒敏感的能够作为病毒繁殖复制的细胞，在本发明中可采用PK-15细胞。本发明中，所述步骤(3)所述的宿主细胞还可以采用灌注培养方式进行扩大培养。所述的灌注培养方式是指从篮式反应器中排出旧细胞生长液，然后补充与排出的细胞生长液等体积的新鲜细胞生长液，使细胞始終处于满足生长需要的培养液中，以维持细胞快速生长。细胞生长需要消耗细胞生长液中的葡萄糖，因此在所述的宿主细胞扩大培养过程中，根据反应器内的葡萄糖浓度来决定换液的时间，若葡萄糖浓度低于细胞生长需求的浓度吋，进行换液。在本发明中所述的灌注培养方式的操作是定时取样检测葡萄糖浓度，根据测定的葡萄糖浓度进行判断是否需要换液，若葡萄糖浓度低于2g/L，进行换液操作，使葡萄糖浓度高于2g/L，以维持细胞生长。由于新鲜细胞生长液的葡萄糖浓度是已知的，因此可以计算出换液后反应器内细胞生长液的葡萄糖浓度，以判断是否需要继续向反应器中加入细胞生长液。本发明所述步骤(3)的宿主细胞在反应器中的细胞生长液中的接种密度应当满足细胞以合适的生长速度生长。接种密度过少细胞生长慢，需要的时间长，过多则增加准备细胞种的时间，都不利于提高生产效率。在本发明中所述的宿主细胞可以优选按照每克载体接种1飞X IO6Cells的密度接种于篮式反应器内，所述篮式反应器中每IL的有效体积中装填25 40g载体，而加入的细胞生长液应没过篮式反应器中的搅拌桨的桨叶，即让搅拌桨完全浸没在细胞生长液中。这样不仅能够满足宿主细胞的生长需求，又能使反应器运行时培养基内的溶氧、营养充分混合，使细胞的生长均匀一致。所述的有效体积一般是指正常使用反应器吋，能满足细胞生长的培养液的合适体积。本发明所述步骤(3)的细胞生长液推荐采用由包括以下体积分数的组分组成的 培养液RPMI-1640培养基液93°/Γ97%，牛血清3°/Γ7%，采用该细胞生长液不仅使细胞正常生长，而且牛血清用量少，能节约成本。牛血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，对细胞生长活性有促进和抑制作用，使细胞保持生理平衡。同时，牛血清是细胞贴壁、铺展在培养基质上所需的贴壁因子的来源，因此，在细胞培养液中牛血清含量必须要达到满足细胞的生长增殖需求，才能提高细胞的营养利用率。在本发明中，由于可以采用灌注培养方式来培养宿主细胞，可以不断的补充新鲜培养溶液，維持细胞正常的代谢，能够充分利用细胞维持液中的各种营养成分，減少了细胞对牛血清的依赖。而由于篮式反应器采用的Fibra Disk载体增强细胞的贴附能力，细胞能很好地与载体结合，因而需要的细胞贴壁因子的量少，进ー步减少了细胞对牛血清的依赖，与传统エ艺相比，本发明中所用的牛血清的量更少。本发明所述步骤(3)中宿主细胞扩大培养的条件推荐为ΡΗ:7.(Γ7. 3，溶解氧(DO) :50% 80%，搅拌桨转速50 100 RPM，温度37°C。作为本发明的一种实施方式，所述步骤(3)中宿主细胞在篮式反应器内培养5 7天，细胞耗糖量稳定在lg/L/天以上，此时的宿主细胞才应用于病毒培养。本发明所述步骤(3)所述的消毒灭菌处理可以采用以下具体操作在12(T125°C的温度下灭菌3(T50min ;优选的灭菌温度是12(Tl23°C，最优的灭菌温度是121 °C ;优选的灭菌时间40 50min,最优的灭菌时间是45 min。作为本发明的一种实施方式，所述步骤(3)中，定时取反应器中的培养液样品，测定细胞耗糖量，当连续几次測定的细胞耗糖量的数值都趋于接近时，可确定细胞耗糖量已稳定。本发明所述步骤(4)猪圆环病毒的病毒种制备采用常规方法，用方瓶或转瓶培养单层细胞，接种病毒后收获病毒液，再过滤后备用；或者直接采用上批次反应器发酵后的病毒液过滤备用。作为本发明的一种实施方式，所述步骤(4)自第一次收取猪圆环病毒液起，可以每间隔8 12小时收取一次猪圆环病毒液。作为本发明的一种实施方式，所述步骤(4)的病毒増殖培养的条件PH 7. 2 · 5，溶解氧(DO) :50% 80%，搅拌桨转速60 90 RPM，温度33°C 37°C。作为本发明的一种实施方式，所述步骤(4)的细胞维持液由RPMI-1640培养基液和牛血清混合构成，其中，RPMI-1640培养基液的体积分数为989Γ99. 5%，牛血清的体积分数为O. 5°/Γ2%。该细胞維持液的优选配方可以为RPMI-1640培养基液的体积分数为999Γ99. 5%，牛血清的体积分数为O. 5°/Γ %。在本发明中，由于可以采用多次繁殖收获的方式来收获病毒，可以不断的补充新鲜培养溶液，維持细胞正常的代谢，能够充分利用细胞培养液中的各种营养成分，减少了细胞对牛血清的依赖。而细胞与Fibra Disk载体结合紧密进一步减少了细胞对牛血清的依赖，与传统エ艺相比，本发明中所用的牛血清的量更少。本发明所述步骤⑵中每升细胞维持液中病毒种液的接种量可以为l(T20ml。本发明所述步骤(3)和⑷中的细胞耗糖量可以采用以下方式获得定时取反应器中的培养液样品，应用葡萄糖检测试剂盒与紫外分光光度计检测培养液的葡萄糖含量，然后根据已知的新鲜细胞生长液的葡萄糖浓度以及换液情况，计算出细胞耗糖量。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果· I.本发明提供的应用篮式生物反应器细胞发酵技术生产猪圆环病毒抗原的方法，该方法自动化程度高，在设定各种參数后，如PH、D0、搅拌桨转速等后，不再需要有人监守，具有用人少、占地小、效率高的特点，且エ艺简单易行，病毒液收获量大，能够极大的降低生产成本。2.本发明利用了篮式反应器和Fibra Disk载体的特定结构结合猪圆环病毒液为外分泌型病毒的特性，实现对病毒进行重复多次的繁殖复制及收获方式的制备，可以使生产效率最大化，例如40L的蓝式反应器，能够收获8(Tl20L的病毒液，而现有的培养方式最多只能收获40L的病毒液。收获的病毒液体积多，病毒数量多，不但可降低生产成本，而且经ELISA试剂盒测定获得的病毒的毒价，測定结果显示，以吸光度(OD)表示，病毒毒价在
2.5以上，说明获得的病毒的毒价高，有利于提升所制备疫苗的品质。3.本发明采用篮式反应器以及Fibra Disk载体，能够采用细胞灌注培养エ艺，可以令细胞充分利用培养基中的各种营养成分，降低对高浓度血清的依赖，而细胞能与FibraDisk载体结合紧密，进ー步减少了细胞对牛血清的依赖，使用的细胞生长液与细胞维持液中的血清含量较低，在宿主细胞增殖过程中产生的细胞碎片与蛋白杂质很少，故无需用PBS溶液对所得的猪圆环病毒进行清洗，不但減少了一个步骤，提高了制备效率，而且还可明显地减少对宿主细胞的损害。不仅如此，牛血清价格非常昂贵，其用量的減少，更节约成本。4.本发明采用RPMI-1640培养基作为宿主细胞生长的培养基，与传统使用的DMEM等培养基相比，其更加适合宿主细胞的生长繁殖，使细胞的生长速度和生长形态等指标都得以改善。5.经本发明人研究发现，在细胞维持液中添加孵育剂，会使细胞死亡趋于同歩，不利于病毒连续培养及收取的进行，因此病毒液多次繁殖复制及收取的操作可行性非常低。因而本发明中的细胞维持液中，免去现有技术所必须添加的孵育剂，避免细胞死亡趋于同步，在与本发明其他环节的配合下，实现病毒液多次收取的目的，从而可更进一歩地扩大了病毒生产的規模，更显著地提高病毒的生产效率。6.本发明载体采用NBS公司专用载体Fibra Disk, Ig Fibra Disk提供的生长面积为1200cm2，可为宿主细胞提供较高的生长面积/容积比，非常适合于猪圆环病毒等细胞外分泌型病毒的繁殖扩增。另外，Fibra Disk载体的材料性质稳定，且具有独特的结构，不易损坏，酸碱耐受能力强(PH (Γ14)，因此，可以回收后重复利用，使得生产成本能够大大降低。

反应器美国NBS Celligen plus型篮式生物反应器，该反应器罐体5L，有效体积3. 5L,加装 IOOg Fibra Disk 载体。细胞生长液RPMI_1640培养基液93%牛血清7%。细胞维持液RPMI_1640培养基液的体积分数98%，牛血清的体积分数2%。具体操作 (I)宿主细胞种的制备
以PK-15细胞系为宿主细胞，从液氮罐中取出细胞种，进行细胞复苏，然后置于培养瓶中，加入细胞生长液在培养箱内37°C培养，待细胞长成致密的细胞单层，再采用转瓶培养法进行培养，即将细胞分传成几个培养瓶进行培养，待细胞长满培养瓶后，用O. 25%浓度的胰蛋白酶液进行消化，再分成几个培养瓶继续进行传代培养，以此类推，直至达到可以满足接种相应篮式反应器的细胞数量为止，并制成细胞悬液。(2)病毒种的制备
采用常规方法进行病毒种培养取步骤(I)中培养好的单层宿主细胞用PBS溶液清洗后，加入少量猪圆环病毒液，病毒液覆盖所有单层细胞，放入培养箱内进行吸附，时间为O. 5 lh，培养温度为37°C。之后取出补充适量细胞维持液，放入培养箱内在37°C下继续培养36 48h后收毒，以此类推，扩大病毒毒价和数量。(3)宿主细胞在篮式反应器里的扩大培养
向篮式反应器的载体篮内装入IOOg Fibra Disk载体，加入PBS溶液至载体全部浸泡在PBS溶液中，121 °C灭菌45min。排空PBS溶液后，补入无菌的细胞生长液，至没过篮式搅拌桨的桨叶，让搅拌桨桨叶完全浸泡在细胞生长液中。接种前设定好反应器的各项參数，包括温度37°C、溶氧50%、PH7. 2、搅拌桨转速50RPM、通气量O. lL/min等，待各參数稳定后，将步骤(I)中制备好的PK-15细胞种，共4.0X108个细胞向篮式反应器内接种，之后进行反应器的自动控制培养。宿主细胞培养采用连续灌注培养方式，即接种48h后，每4tT8h取样一次，应用常规的葡萄糖检测试剂盒与紫外分光光度计检测培养液样品中葡萄糖含量，然后根据已知的新鲜细胞生长液的葡萄糖浓度以及换液情况，计算出细胞耗糖量，当反应器内的葡萄糖浓度在2g/L或以下时，将反应器内的细胞生长液排出，再向反应器中添加与前一次使用的细胞生长液等体积的新鲜细胞生长液，此后姆12小时进行一次换液操作，使反应器内的细胞生长液的葡萄糖浓度处在2g/L以上，維持细胞的生长。宿主细胞在篮式反应器内培养到接近第5天，且连续几次測定的细胞耗糖量的数值都稳定在I. lg/L/天以上吋，即细胞耗糖量已稳定，此时宿主细胞生长数量接近或达到最大，细胞数量基本维持在ー个恒定值，细胞生长稳定，即可准备接毒。(4)病毒在篮式反应器里的繁殖扩增
接种前将反应器内的细胞生长液排空，然后补入与排出的细胞生长液等体积的细胞维持液，重新设定反应器的各项參数，温度37で、溶氧50%、PH7. 2、搅拌速率60RPM、通气量O. lL/min，待各參数稳定后，将准备好的猪圆环病毒种液接种到反应器内。病毒种液量50ml,经ELISA试剂盒测定病毒毒价为OD值2. 8。接毒24h后,姆6h或姆4h取样一次,测
定耗糖量。接毒后45h，开始第一次收取病毒液，在收取一定体积的病毒液后，补入等体积的细胞维持液，使反应器内的培养液葡萄糖浓度处在2g/L以上，維持细胞生长代谢及病毒复制，然后每间隔8小时或12小时收取一次病毒液，并在每次收取病毒液后，补加与前一次收取的病毒液等体积的细胞维持液，使反应器内的培养液葡萄糖浓度处在2g/L以上。接毒后第4天，当细胞耗糖量降至O. 5g/L/天以下，DO有明显的上升趋势吋，停止培养，最后一次收获反应器内的全部病毒液，该批次发酵结束。收获病毒液10L，取样毒价最高达到OD值
3.2，IOL病毒液平均毒价为OD值3. O。
(5)收获病毒液的处理
收获的病毒液不可需要冻融操作，混合后可直接过滤或离心处理，进入制苗的其他程序。如短期备用可4°C保存，长期备用需-20°C冷冻保存。实施例ニ
与实施例一不同的是
反应器美国NBS BIOFLO 310型篮式生物反应器，该反应器罐体14L，有效体积10L，加装 300g Fibra Disk 载体。细胞生长液RPMI_1640培养基液94%牛血清6%。细胞维持液RPMI_1640培养基液的体积分数99%，牛血清的体积分数1%。(3)宿主细胞在篮式反应器里的扩大培养
向篮式反应器的载体篮内装入300g Fibra Disk载体，加入PBS溶液至载体全部浸泡在PBS溶液中，121 °C灭菌45min。排空PBS溶液后，补入无菌的细胞生长液，至没过篮式搅拌桨的桨叶，让搅拌桨桨叶完全浸泡在细胞生长液中。接种前设定好反应器的各项參数，包括温度37°C、溶氧50%、PH7. O、搅拌桨转速60RPM、通气量O. 3L/min等，待各參数稳定后，将步骤(I)中制备好细胞悬液的PK-15细胞种，共3. OX IO8个细胞向篮式反应器内接种，之后进行反应器的自动控制培养；接种48h后，每6h取样一次，測定细胞耗糖量，当反应器内的葡萄糖浓度在2g/L以下吋，将反应器内的细胞生长液排出，再向反应器中添加与前一次使用的细胞生长液等体积的新鲜细胞生长液，此后姆12小时进行一次换液操作，使反应器内的细胞生长液的葡萄糖浓度处在2g/L以上，維持细胞的生长。宿主细胞在篮式反应器内培养到第5天，且连续几次測定的细胞耗糖量的数值都稳定在I. 4g/L/天以上吋，即细胞耗糖量已稳定，细胞生长稳定，即可准备接毒。(4)病毒在篮式反应器里的繁殖扩增
接种前将反应器内的细胞生长液排空，然后补入与排出的细胞生长液等体积的细胞维持液，重新设定反应器的各项參数，温度36°C、溶氧70%、PH7. 2、搅拌速率90RPM、通气量
0.3L/min等，待各參数稳定后，将准备好的猪圆环病毒种液接种到反应器内。病毒种液量100ml,经ELISA试剂盒测定病毒毒价为OD值2. 7。接毒24h后姆6h或姆4h取样一次,测定耗糖量。接毒后42h，开始第一次收取病毒液，在收取一定体积的病毒液后，补入等体积的细胞维持液，使反应器内的培养液葡萄糖浓度处在2g/L以上，維持细胞生长代谢及病毒复制，然后每间隔8小时或12小时收取一次病毒液，并在每次收取病毒液后，补加与前一次收取的病毒液等体积的细胞维持液，使反应器内的培养液葡萄糖浓度处在2g/L以上。接毒后第5天，当细胞耗糖量降至O. 5g/L/天以下，DO有明显的上升趋势时，停止培养，最后一次收获反应器内的全部病毒液，该批次发酵结束。收获病毒液35L，取样毒价最高达到OD值
3.4，35L病毒液平均毒价为OD值3. 2。(5)收获病毒液的处理
收获的病毒液不需要冻融操作，混合后可直接过滤或离心处理，进入制苗的其他程序。如短期备用可4°C保存，长期备用需-20°C冷冻保存。实施例三
与实施例一不同的是
反应器美国NBS BIOFLO 510型篮式生物反应器，该反应器罐体40L，有效体积30L，加装 1200g Fibra Disk 载体。细胞生长液RPMI_1640培养基液96%牛血清4%。细胞维持液RPMI_1640培养基液的体积分数99. 5%，牛血清的体积分数O. 5%。(3)宿主细胞在篮式反应器里的扩大培养
向篮式反应器的载体篮内装入1200g Fibra Disk载体，加入PBS溶液至载体全部浸泡在PBS溶液中，121 °C灭菌45min。排空PBS溶液后，补入无菌的细胞生长液，至没过篮式搅拌桨的桨叶，让搅拌桨桨叶完全浸泡在细胞生长液中。接种前设定好反应器的各项參数，包括温度37°C、溶氧60%、PH7. 3、搅拌桨转速70RPM、通气量I. OL/min等，待各參数稳定后，将步骤(I)中制备好细胞悬液的PK-15细胞种，共4. OX IO9个细胞向篮式反应器内接种，之后进行反应器的自动控制培养；接种48h后，每8h取样一次，測定细胞耗糖量，当反应器内的葡萄糖浓度在2g/L以下吋，将反应器内的细胞生长液排出，再向反应器中添加与前一次使用的细胞生长液等体积的新鲜细胞生长液，此后姆12小时进行一次换液操作，使反应器内的细胞生长液的葡萄糖浓度处在2g/L以上，維持细胞的生长。宿主细胞在篮式反应器内培养到第6天，且连续几次測定的细胞耗糖量的数值都稳定在I. 4g/L/天以上吋，即细胞耗糖量已稳定，细胞生长稳定，即可准备接毒。(4)病毒在篮式反应器里的繁殖扩增
接种前将反应器内的细胞生长液排空，然后补入与排出的细胞生长液等体积的细胞維持液，重新设定反应器的各项參数，温度35°C、溶氧80%、PH7. 5、搅拌桨转速80RPM、通气量I. OL/min，待各參数稳定后，将准备好的猪圆环病毒种液接种到反应器内。病毒种液量320ml,经ELISA试剂盒测定病毒毒价为OD值2. 8。接毒24h后姆6h或姆4h取样一次,测定耗糖量。接毒后40h后，开始第一次收取病毒液，在收取一定体积的病毒液后，补入等体积的细胞维持液，使反应器内的培养液葡萄糖浓度处在2g/L以上，維持细胞生长代谢及病毒复制，然后每间隔8小时或12小时收取一次病毒液，并在每次收取病毒液后，补加与前一次收取的病毒液等体积的细胞维持液，使反应器内的培养液葡萄糖浓度处在2g/L以上。接毒后第6天，当细胞耗糖量降至O. 5g/L/天以下，DO有明显的上升趋势吋，停止培养，最后ー次收获反应器内的全部病毒液，该批次发酵结束。该批次共收获病毒液120L，取样毒价最高达到OD值3. 5，120L病毒液平均毒价为OD值3. 2。(5)收获病毒液的处理收获的病毒液不需要冻融操作，混合后可直接过滤或离心处理，进入制苗的其他程序。如短期备用可4°C保存，长期备用需-20°C冷冻保存。实施例四
与实施例一不同的是
反应器美国NBS BIOFLO 310型篮式生物反应器，该反应器罐体7. 5L，有效体积5L，カロ装 150g Fibra Disk 载体。细胞生长液RPMI_1640培养基液93%牛血清7%。细胞维持液RPMI_1640培养基液的体积分数98. 5%，牛血清的体积分数I. 5%。(3)宿主细胞在篮式反应器里的扩大培养
向篮式反应器的载体篮内装入150g Fibra Disk载体，加入PBS溶液至载体全部浸泡在PBS溶液中，121 °C灭菌45min。排空PBS溶液后，补入无菌的细胞生长液，至没过篮式搅拌桨的桨叶，让搅拌桨桨叶完全浸泡在细胞生长液中。接种前设定好反应器的各项參数，包括温度37°C、溶氧60%、PH7. 3、搅拌桨转速60RPM、通气量O. 2L/min等，待各參数稳定后，将步骤(I)中制备好细胞悬液的PK-15细胞种，共O. 5X IO9个细胞向篮式反应器内接种，之后进行反应器的自动控制培养；接种48h后，每8h取样一次，测定耗糖量，当反应器内的葡萄糖浓度在2g/L以下吋，将反应器内的细胞生长液排出，再向反应器中添加与前一次使用的细胞生长液等体积的新鲜细胞生长液，此后姆12小时进行一次换液操作，使反应器内的细胞生长液的葡萄糖浓度处在2g/L以上，維持细胞的生长。宿主细胞在篮式反应器内培养到第5天，且连续几次測定的细胞耗糖量的数值都稳定在I. 2g/L/天以上吋，即细胞耗糖量已稳定，细胞生长稳定，即可准备接毒。(4)病毒在篮式反应器里的繁殖扩增
接种前将反应器内的细胞生长液排空，然后补入与排出的细胞生长液等体积的细胞维持液，重新设定反应器的各项參数，温度36°C、溶氧70%、PH7. 3、搅拌桨转速90RPM、通气量
O.3L/min等，待各參数稳定后，将准备好的猪圆环病毒种液接种到反应器内。病毒种液量100ml,经ELISA试剂盒测定病毒毒价为OD值2. 7。接毒24h后姆6h或姆4h取样一次,测定耗糖量。接毒后44h，开始第一次收取病毒液，在收取一定体积的病毒液后，补入等体积的细胞维持液，使反应器内的培养液葡萄糖浓度处在2g/L以上，維持细胞生长代谢及病毒复制，然后每间隔11小时收取一次病毒液，并在每次收取病毒液后，补加与前一次收取的病毒液等体积的细胞维持液，使反应器内的培养液葡萄糖浓度处在2g/L以上。接毒后第4天，当细胞耗糖量降至O. 5g/L/天以下，DO有明显的上升趋势时，停止培养，最后一次收获反应器内的全部病毒液，该批次发酵结束。该批次共收获病毒液18L，取样毒价最高达到OD值
3.4，18L病毒液平均毒价为OD值3. 2。(5)收获病毒液的处理
收获的病毒液不需要冻融操作，混合后可直接过滤或离心处理，进入制苗的其他程序。如短期备用可4°C保存，长期备用需-20°C冷冻保存。实施例五
与实施例一不同的是
反应器美国NBS BIOFLO 115型篮式生物反应器，该反应器罐体5L，有效体积3. 5L，カロ装 120g Fibra Disk 载体。细胞生长液RPMI_1640培养基液93%牛血清7%。细胞维持液RPMI_1640培养基液的体积分数98%，牛血清的体积分数2%。(3)宿主细胞在篮式反应器里的扩大培养
向篮式反应器的载体篮内装入120g Fibra Disk载体，加入PBS溶液至载体全部浸泡在PBS溶液中，121 °C灭菌45min。排空PBS溶液后，补入无菌的细胞生长液，至没过篮式搅拌桨的桨叶，让搅拌桨桨叶完全浸泡在细胞生长液中。接种前设定好反应器的各项參数，包括温度37°C、溶氧50%、PH7. 2、搅拌桨转速50RPM、通气量O. lL/min等，待各參数稳定后，将步骤(I)中制备好细胞悬液的PK-15细胞种，共O. 4X IO9个细胞向篮式反应器内接种，之后进行反应器的自动控制培养；接种48h后，每8h取样一次，测定耗糖量，当反应器内的葡 萄糖浓度在2g/L以下吋，将反应器内的细胞生长液排出，再向反应器中添加与前一次使用的细胞生长液等体积的新鲜细胞生长液，此后姆12小时进行一次换液操作，使反应器内的细胞生长液的葡萄糖浓度处在2g/L以上，維持细胞的生长。宿主细胞在篮式反应器内培养到第5天，且连续几次測定的细胞耗糖量的数值都稳定在I. 2g/L/天以上吋，即细胞耗糖量已稳定，细胞生长稳定，即可准备接毒。(4)病毒在篮式反应器里的繁殖扩增
接种前将反应器内的细胞生长液排空，然后补入与排出的细胞生长液等体积的细胞维持液，重新设定反应器的各项參数，温度35°C、溶氧60%、PH7. 4、搅拌桨转速70RPM、通气量
O.lL/min等，待各參数稳定后，将准备好的猪圆环病毒种液接种到反应器内。病毒种液量50ml,经ELISA试剂盒测定病毒毒价为OD值2. 6。接毒24h后姆6h或姆4h取样一次,测定耗糖量。接毒后48h，开始第一次收取病毒液，在收取一定体积的病毒液后，补入等体积的细胞维持液，使反应器内的培养液葡萄糖浓度处在2g/L以上，維持细胞生长代谢及病毒复制，然后每间隔10小时收取一次病毒液，并在每次收取病毒液后，补加与前一次收取的病毒液等体积的细胞维持液，使反应器内的培养液葡萄糖浓度处在2g/L以上。接毒后第3. 5天，当细胞耗糖量降至O. 5g/L/天以下，DO有明显的上升趋势时，停止培养，最后一次收获反应器内的全部病毒液，该批次发酵结束。该批次共收获病毒液12L，取样毒价最高达到OD值3. 2，12L病毒液平均毒价为OD值2. 9。(5)收获病毒液的处理
收获的病毒液不需要冻融操作，混合后可直接过滤或离心处理，进入制苗的其他程序。如短期备用可4°C保存，长期备用需-20°C冷冻保存。实施例六
与实施例一不同的是
反应器美国NBS BIOFLO 510型篮式生物反应器，该反应器罐体75L，有效体积60L，加装 2000g Fibra Disk 载体。细胞生长液RPMI_1640培养基液97%牛血清3%。细胞维持液RPMI_1640培养基液的体积分数99. 5%，牛血清的体积分数O. 5%。(3)宿主细胞在篮式反应器里的扩大培养
向篮式反应器的载体篮内装入2000g Fibra Disk载体，加入PBS溶液至载体全部浸泡在PBS溶液中，121 °C灭菌45min。排空PBS溶液后，补入无菌的细胞生长液，至没过篮式搅拌桨的桨叶，让搅拌桨桨叶完全浸泡在细胞生长液中。接种前设定好反应器的各项參数，包括温度37°C、溶氧80%、PH7. 3、搅拌桨转速100RPM、通气量I. 8L/min等，待各參数稳定后，将步骤(I)中制备好细胞悬液的PK-15细胞种，共IOX IO9个细胞向篮式反应器内接种，之后进行反应器的自动控制培养；接种48h后，每8h取样一次，测定耗糖量，当反应器内的葡萄糖浓度在2g/L以下吋，将反应器内的细胞生长液排出，再向反应器中添加与前一次使用的细胞生长液等体积的新鲜细胞生长液，此后姆12小时进行一次换液操作，使反应器内的细胞生长液的葡萄糖浓度处在2g/L以上，維持细胞的生长。宿主细胞在篮式反应器内培养到第7天，且连续几次測定的细胞耗糖量的数值都稳定在I. 5g/L/天以上吋，即细胞耗糖量已稳定，细胞生长稳定即可准备接毒。(4)病毒在篮式反应器里的繁殖扩增
接种前将反应器内的细胞生长液排空，然后补入与排出的细胞生长液等体积的细胞维持液，重新设定反应器的各项參数，温度33°C、溶氧80 %、PH7. 4、搅拌速率90RPM、通气量2. OL/min，待各參数稳定后，将准备好的猪圆环病毒种液接种到反应器内。病毒种液量·1000ml,经ELISA试剂盒测定病毒毒价为OD值2. 7。接毒24h后,姆6h或姆4h取样一次，测定耗糖量。接毒后36h，开始第一次收取病毒液，在收取一定体积的病毒液后，补入等体积的细胞维持液，使反应器内的培养液葡萄糖浓度处在2g/L以上，維持细胞生长代谢及病毒复制，然后每间隔9小时收取一次病毒液，并在每次收取病毒液后，补加与前一次收取的病毒液等体积的细胞维持液，使反应器内的培养液葡萄糖浓度处在2g/L以上。接毒后第7天，当细胞耗糖量降至O. 5g/L/天以下，DO有明显的上升趋势时，停止培养，最后一次收获反应器内的全部病毒液，该批次发酵结束。该批次共收获病毒液200L，取样毒价最高达到OD值
3.4，200L病毒液平均毒价为OD值3. 2。(5)收获病毒液的处理
收获的病毒液不需要冻融操作，混合后可直接过滤或离心处理，进入制苗的其他程序。如短期备用可4°C保存，长期备用需-20°C冷冻保存。本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制，凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。


本发明公开了一种采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)宿主细胞种的制备；(2)篮式反应器接种前的准备；(3)宿主细胞扩大培养；(4)病毒增殖培养将所述反应器内的细胞生长液排空，补充与排出的细胞生长液等体积的细胞维持液后，接种猪圆环病毒，接毒后36~48h，进行第一次收取病毒液，在收获病毒液后，再向反应器内加入与已收取的病毒液等体积的细胞维持液，对病毒再次进行繁殖复制并收获，如此循环反复多次，直至检测到要收获的病毒液中的细胞耗糖量降至0.5g/L/天以下时，收获本批次最后一次猪圆环病毒液。该方法简单易行，能够极大的降低生产成本，明显提高猪圆环病毒抗原的单位毒价，增大每批次发酵的病毒液抗原收获量。