专利名称：褐色中脉3基因特异性标志物在玉米中用于性状基因渗入的用途的制作方法木质素是植物中与碳水化合物，诸如细胞壁中的半纤维素形成交联的通用组分。木质素聚合物在反刍类中降低纤维消化，并且木质化的程度可以与饲料作物消化率(digestibility)成反比。Cherney 等(1991) Adv. Agron. 46:157-98。含有褐色中脉(BMR)突变的玉蜀黍展现出与显著降低的木质素含量、改变的木质素组成和改善的消化率有关的叶中脉的微红褐色色素沉着。已经在玉米中鉴定出至少四处独立的BMR突变。Kuc等(1968)Phytochemistry 7:1435-6。在与对照玉米相比时，这些突变(称作“131111、131]12、131]13和131114”)都展现出降低的木质素含量。bm3突变包括咖啡酸O-甲基转移酶(C0MT，例如，GenBank登录号M73235)基因内的插入(bm3-l)、缺失(bm3_2)和插入/缺失(bm3_3)。Morrow等(1997)Mol. Breeding 3:351-7 ;Vignols 等(1995)Plant Cell 7:407-16。COMT基因控制木质素生物合成中牵涉的酶活性。COMT利用S-腺苷甲硫氨酸(adenyIsyImethionine)对咖啡酸进行转甲基化，这导致生成阿魏酸。最终，自阿魏酸生成松柏醇和芥子醇。在存在自由基的情况中松柏醇、阿魏酸和芥子醇的组合导致木质素生成。Bm3突变已经得到表征，并且认为其通过基因灭活抑制咖啡酸的转甲基化。Guillet Claude 等(2004)Theor. Appl. Genet. 110:126-35;Piquemal 等(2002)PlantPhysiology 130:1-11;He 等(2003)CropSci. 43:2240-51;Morrow 等(1997)Mol. Breeding3:351-7; Vignols等(1995)Plant Cell 7:407-16。然而，尚未开发出特异性检测并测试特定植物在bm3基因座处的接合性的快速方法。发明概述本文中公开了用于BMR玉米品种(例如，bm3突变体)的基于高通量PCR的分子表征的方法，其可以极大地增强含有BMR的品系的育种过程。公开了用于测定植物组织样品，并且因此制备样品的植物的接合性的方法，其通过测定bm3突变体和野生型COMT等位基因的存在或缺乏进行。如此，提供了基于端点水解探针PCR的接合性测定法(其在本文中称为TaqMan 测定法)，其特异性检测并测试bm3基因座处的接合性状态。公开了利用同一测定法对中bm3突变体和相应的野生型序列特异性的寡核苷酸的双重性(biplex)的测定法。附图简述图I包括具有bm3突变的COMT基因和为COMT基因的部分扩增(约I. 8kbp)设计的寡核苷酸的图示。图2包括来自12种bm3系和3种非bm3系(野生型系)的部分COMT基因序列的扩增的描绘。将PCR产物在Gel 上显现，然后经由O. 8%E Gel Cloneffell提取，随后克隆入pCR4 TOPO 载体中。图3包括来自bm3突变体和野生型COMT基因的共有序列的比对。三处先前描述的缺失/插入突变加下划线。图4包括COMT基因及对bm3突变和完整的COMT基因特异性的引物的图示。(A)具有点线的COMT基因代表bm3缺失。COMT基因特异性引物在缺失位点内。(B)bm3突变体基因。bm3特异性寡核苷酸在缺失位点侧翼的正向和反向寡核苷酸和探针跨越缺失区的接由·口卞ο图5a和5b包括实时PCR扩增图，其中对具有FAM的bm3 (a)和(b)具有VIC (由于实时PCR仪的限制而用Hex替换)的野生型COMT显示相对荧光单位(RFU)。对于bm3和野生型COMT基因两者，从循环22至36观察到指数扩增期。图6包括使用基于第30个循环时FAM作为等位基因I (纯合bm3)和VIC(由于仪器限制而用Hex替换)作为等位基因2 (纯合野生型C0MT)的相对荧光单位的等位辨别测定法进行的基因型测定。图7包括用端点TaqMan= 测定法进行的bm3接合性测定。在完成PCR和荧光阅读后，产生分布图，如下文所描述的=SOBl=FAM的高于背景的信号(高于535nm的背景信号平均值的样品信号)，S0B2=VIC的高于背景的信号(高于560nm的背景信号平均值的样品信号)。用对数尺度以S0B1/S0B2〈1 (对于野生型)、1<S0B1/S0B2<5 (对于半合子)、和SOBl/S0B2>5 (对于纯合子)进行基因型测定。图8包括用端点TaqMan 测定法进行的bm3接合性测定。在KUMS (KBioscience实验室信息管理系统)中分析直接来自读板仪的原始荧光强度数据。产生具有在X轴上绘图的FAM和在y周上绘图的VIC的RFU(相对荧光单位)的图。基于簇视图中的簇分离进行接合性测定。序列表使用如37C. F. R. § I. 822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写显示所附序列表中列出的核酸序列。仅显示每种核酸序列的一条链，但是互补链理解为通过对展示链的任意引用而包括在内。在所附序列表中SEQ ID NO: I显示用于扩增玉米COMT部分基因的正向引物序列(BM35_F)TACTCTACTGGCTGCGGCTAGC。SEQ ID N0:2显示用于扩增玉米COMT部分基因的反向引物序列(BM35_R)TAACCTTGATTGTTATTACTCGCACATGG。SEQ ID NO: 3显示用于对玉米COMT部分基因测序的来自COMT基因的寡核苷酸序列(BM1234R) ATCAGCATCAGCCAGGCAGG SEQ ID NO:4显示用于鉴定突变体bm3等位基因的正向引物序列(BM3_F)AAAAAGAACGAGGTTGCAAAAGATA。SEQ ID NO: 5显示用于鉴定突变体bm3等位基因的反向引物序列(BM3_R)TTAGAATCCACGACATGCAAGAG。SEQ ID NO:6显示具有在5’端的FAM和3’端的MGBNFQ的用于鉴定突变体bm3等位基因的探针序列(BM3_ 探针)FAM-ACAAACCAAAGGATGTCG-MGBNFQ。SEQ ID NO: 7显示用于鉴定野生型COMT等位基因的正向引物序列(C0MT_F):CGCAC TCGACGACGATGAC。SEQ ID NO: 8显示用于鉴定野生型COMT等位基因的反向引物序列(C0MT_R):CACGCTGCTCAAGAACTGCTA。SEQ ID NO:9显示具有5’端的VIC和3’端的MGBNFQ的用于鉴定野生型COMT等位基因的探针序列(C0MT_ 探针)VIC-CAITTTCCGGCAGCGC-MGBNFQ。 SEQ ID NO: 10显示bm3核苷酸序列。SEQ ID NO: 11显示部分COMT核苷酸序列。发明详述I.几个实施方案的概述本文中公开了用于bm3玉米品种的基于高通量PCR的分子表征的方法，其可以极大地增强含有BMR的植物系的育种过程。在具体的实施方案中，该方法可以包括自玉米植物获得分离的基因组DNA的样品，使分离的基因组DNA与至少一种包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO: 10杂交的核苷酸序列的核酸分子和至少一种包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO: 11杂交的核苷酸序列的核酸分子接触，并测定来自玉米植物的分离的基因组DNA中bm3突变的接合性。在具体的实施方案中，至少一种包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO: 10杂交的核苷酸序列的核酸分子和至少一种包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO: 11杂交的核苷酸序列的核酸分子的长度是10-35个核苷酸。在一些实施方案中，至少一种包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO: 10杂交的核苷酸序列的核酸分子与SEQ ID NO: 10的10-35个连续的核苷酸是至少95%相同的。在一些实施方案中，至少一种包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO: 11杂交的核苷酸序列的核酸分子与SEQ IDN0:11的10-35个连续的核苷酸是至少95%相同的。在一些实施方案中，能够在高严格性条件下与SEQ ID NO: 11杂交的核苷酸序列不能够在高严格性条件下与SEQ ID NO: 10杂交。在某些实施方案中，至少一种包含能够与SEQ IDN0:10或SEQ ID NO: 11杂交的核苷酸序列的核酸分子选自下组SEQ IDN0:l-9。还公开了用于鉴定玉米植物中BMR突变的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括将来自玉米植物的基因组DNA暴露于能够在高严格性条件下与SEQ ID NO: 10杂交的核酸分子。在具体的实施方案中，能够在高严格性条件下与SEQ ID NO: 10杂交的核酸分子可以选自下组SEQ ID NO:4, SEQ IDN0:5 和 SEQ ID N0:6。进一步公开了用于可靠且可预测地将低木质素含量的性状基因渗入(例如，经由将bm3等位基因基因渗入)植物种质中的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括将在COMT基因中具有突变的植物与另一种植物回交，自通过杂交生成的后代获得分离的基因组DNA的样品，使分离的基因组DNA的样品与至少一种包含能够在高严格性条件下与SEQ IDNO: 11杂交的核苷酸序列的核酸分子接触，并通过繁殖获得分离的基因组DNA的样品的植物自所述杂交选择在所述COMT基因中包含突变的后代，所述分离的基因组DNA的样品在高严格性的情况中结合至少一种包含能够在高严格性条件下与SEQID NO: 11杂交的核苷酸序列的核酸分子，由此生成遗传工程化植物，其中低木质素含量的性状已经基因渗入所述遗传工程化植物的种质中还公开了具有依照公开内容的基于高通量PCR的分子方法测定的基因型和/或接合性的玉米植物，及依照公开内容的用于可靠且可预测地将低木质素含量的性状基因渗入玉米植物种质中的方法生成的展现出低木质素含量性状的遗传工程化玉米植物。II.缩写BMR 褐色中脉MGBNFQ小沟结合非荧光淬灭剂 IFAM 6-羧基荧光素 PCR 聚合酶链式反应RFU 相对荧光单位VIC 6-羧基罗丹明III.术语在以下的描述和表中，使用许多术语。为了提供说明书和权利要求书(包括此类术语要给予的范围)的清楚且一致的理解，提供了下列定义回交回交是育种者将杂种后代返回与亲本之一，例如具有F1杂种的亲本基因型之一的第一代杂种Fl重复杂交的方法。BMR玉米如本文中所使用的，术语“BMR玉米”指含有褐色中脉突变，诸如以bml、bm2、bm3和bm4表征的突变的玉米品种。BMR玉米品种通常展现出叶中脉的微红褐色色素沉着。BMR玉米通常还以较低的木质素含量、较高的纤维消化率和较高的干物质摄取为特征。BMR 玉米品种的非限制性例子包括 F2F297、F2F383、F2F488、F2F449、F2F566、F2F610、F2F622、F2F665、F2F633、F2F682、F2F721、F2F700 和 F2F797。杂交寡核苷酸及其类似物通过互补碱基间的氢键合(其包括沃森-克里克、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键合)杂交。一般地，核酸分子由作为喃唳(胞喃唳(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))的含氮碱基组成。这些含氮碱基在嘧啶与嘌呤间形成氢键，并且嘧啶与嘌呤的键合称为“碱基配对”。更具体地，A会与T或U氢键键合，而G会与C键合。“互补的”指两种独特的核酸序列或同一核酸序列的两个独特区间发生的碱基配对。“特异性可杂交的”和“特异性互补的”是指示足够的互补性程度，使得寡核苷酸和DNA或RNA靶物间发生稳定的且特异性的结合的术语。寡核苷酸与要特异性可杂交的其靶序列不需要是100%互补的。在寡核苷酸与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能，并且有足够的互补性程度，从而避免寡核苷酸与非靶序列在期望特异性结合的条件下，例如在生理学条件下(在体内测定法或系统的情况中)非特异性结合时，寡核苷酸是特异性可杂交的。此类结合称为特异性杂交。导致特定严格性程度的杂交条件会随选择的杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成和程度而有所变化。一般地，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg2+浓度)会促成杂交的严格性，尽管清洗次数也影响严格性。关于获得特定的严格性程度需要的杂交条件的计算在 Sambrook 等(编)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，第 1-3 卷,Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork, 1989，第9章和第11章中讨论。出于本公开内容的目的，“严格条件”涵盖若杂交分子与靶序列间存在有小于25%错配会发生杂交的条件。“严格条件”可以进一步限定成特定的严格性水平。如此，如本文中所使用的，“中等严格性”条件是具有超过25%错配的分子不会杂交的条件；“中间严格性”条件是具有超过15%错配的分子不会杂交的条件，而“高严格性”条件是具有超过10%错配的序列不会杂交的条件。“极高严格性”条件是具有超过6%错配的序列不会杂交的条件。在具体的实施方案中，严格条件可以包括于60° C在依照制造商的用法说明书稀释的丨aqMan 基因型分型 Master 混合物(Applied Biosystems, FosterCity, CA,产品目录编号#4371355)中杂交。分离的“分离的”生物组分(诸如核酸或蛋白质)已经与该组分天然存在的生物体细胞中的其它生物组分，即，其它染色体和染色体外DNA和RNA及蛋白质基本上分开、离 开其生成、远离其纯化。已经“分离的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过宿主细胞中的重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。寡核苷酸寡核苷酸是短的核酸聚合物。寡核苷酸可以通过切割较长的核酸区段，或者通过聚合单个核苷酸前体来形成。自动化的合成仪容许合成长度多达几百个碱基对的寡核苷酸。因为寡核苷酸可以结合互补的核苷酸序列，所以它们可以作为探针用于检测DNA或RNA。由DNA(寡脱氧核糖核苷酸)构成的寡核苷酸可以在PCR(即一种用于扩增小DNA序列的技术)中使用。在PCR中，寡核苷酸通常称为“引物”，其容许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。接合性如本文中所使用的，术语“接合性”指生物体中遗传性状的基因的等位基因的相似性或其缺乏。若两种等位基因都是相同的，则生物体在性状方面是“纯合的”。若两种等位基因是不同的，则生物体在所述性状方面是“杂合的”。若一种等位基因是缺少的，则它是“半合子的”。若两种等位基因是缺少的，则它是“失效合子的”。除非另有明确解释，本文中使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。分子生物学中的常见术语的定义可以参见例如 Lewin B. , Genes V, Oxford University Press, 1994(ISBN0-19-8542879);Kendrew 等(编)，The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd. , 1994 (ISBN0-632-02182-9);及 Meyers R. A.(编)，Molecular Biology and Biotechnology:AComprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. , 1995(ISBN 1-56081-569-8)。IV.用于bmr玉米的基因型和接合性测定的高通量方法A.概述本文中描述了一种基因特异性端点TaqM an PCR测定法，其一般可用于BMR玉米或推定的BMR玉米的接合性分析。具体的例子利用同一测定法中对bm3缺失和对相应的野生型序列特异性的寡核苷酸的双重性。在这些例子中,可以通过bm3突变体和野生型COMT等位基因的存在/缺乏测定接合性。该测定法已经提交给高通量基因组分析组以进一步执行，并且可以极大地增强BMR基因渗入项目的育种过程。B.褐色中脉玉米褐色中脉(BMR)玉米植物以在V4至V6阶段时叶中脉中褐色色素沉着和抽穗后木髓的浅褐色着色为特征。褐色中脉杂种玉米含有在玉米植物组织中引起较低木质素含量的基因突变，例如，bm2突变，或bm3突变。褐色中脉3基因位于染色体4的短臂上，且bm3等位基因是隐性的。褐色中脉2基因位于染色体I的长臂上，且bm2等位基因也是隐性的。木质素聚合物限制玉米植物中纤维的消化率。褐色中脉玉米中降低的木质素导致比正常玉米具有更可消化的纤维的青贮饲料。动物喂养试验已经显示了与正常青贮饲料相比，在BMR玉米青贮饲料的情况中大大约10%的摄取和升高的乳产量。提供了鉴定bm3突变的方法。公开内容的方法可用于例如将特定玉米植物，或特定玉米品种鉴定为BMR玉米。公开的方法还可用于BMR性状对玉米种质的可靠的且可预测的基因渗入，其通过将BMR玉米与其它玉米品种杂交，或者通过将含有第一 BMR突变的BMR玉米与含有第二 BMR突变的BMR玉米杂交(例如，将bml玉米品种与bm3玉米品种杂交)来进行。许多BMR突变是本领域技术人员已知的，并且一些BMR突变已经得到表征(例如，定位并测序)。可以使用公开内容的方法鉴定BMR突变，测定BMR玉米植物或品种的基因型 和/或接合性，以及将任何BMR突变基因渗入玉米种质中。C.端点PCR检测测定法本文中描述了一种基因特异性端点TaqMan PCR测定法，其一般可用于BMR玉米或推定的BMR玉米的接合性分析。在具体的实施方案中，可以使用基因特异性端点TaqMan PCR测定法来分析玉米在bm3突变方面的接合性。在基因特异性端点TaqMan PCR测定法中使用的引物和探针可以基于感兴趣的基因中已知的突变设计。例如，可以基于在咖啡酸O-甲基转移酶(COMT)基因3’端的978bp缺失设计用于bm3特异性测定法的引物和探针。在双重性反应(其中在同一测定法中使用对突变(例如，bm3)和未破坏的野生型基因(例如，C0MT)特异性的寡核苷酸)中，特异性寡核苷酸会自存在于基因组DNA样品中的突变基因和/或野生型基因之任一或两者选择性扩增序列。在一些实施方案中，bm3特异性测定法扩增长度为71bp的片段，其对于自野生型COMT基因删除978bp核苷酸序列的接合位点而言是独特的。在某些实施方案中，靶物特异性寡核苷酸探针(例如，BM3_探针(SEQ ID NO:6))在高严格性条件下与基因组DNA样品中在两种PCR引物(例如，BM3_F(SEQID NO:4)和BM3_R(SEQ ID NO:5))间的靶序列杂交。在一些实施方案中，野生型COMT基因特异性测定法扩增长度为65bp且位于外显子2 (bm3突变体中缺失)内的COMT基因片段，使得不能扩增COMT基因座处的非bm3序列。在某些实施方案中，靶物特异性寡核苷酸探针(例如，C0MT_探针(SEQ ID NO: 9))在高严格性条件下与基因组DNA样品中在两种PCR引物(例如，C0MT_F(SEQ ID NO:7)和C0MT_R(SEQ ID NO:8))间的靶序列杂交。可以例如用荧光染料(例如，FAM、VIC和MGBNFQ)标记靶物特异性寡核苷酸，所述荧光染料可以容许靶物特异性荧光信号的快速量化。可以在预先确定的循环数目后，例如，在反应处于早期指数期时测量PCR产物。阴性对照样品可以包含例如没有bm3突变的来自任何玉米品种的基因组DNA。阳性对照样品可以包含具有BMR突变，诸如COMT基因中的bm3缺失突变的来自玉米品种的基因组DNA。对照半合子样品可以包含预先测定为在bm3突变方面半合子的来自玉米品种的基因组DNA;或者半合子样品可以包含等比例的阴性对照DNA与预先测定为在bm3方面纯合的来自玉米品种的DNA。可以通过本领域技术人员已知的方法自玉米植物组织分离(例如，提取并纯化)DNA。用于DNA分离的商业试剂盒可购自例如Qiagen, Inc。在一些实施方案中，将来自特定植物的叶盘冲孔并转移入收集管中。可以将冲孔器在每次取样后用70%酒精清洗，在水中漂洗，并干燥。可以依照制造商的推荐制备DNA提取缓冲液。然后，可以依照制造商的用法说明书使用试剂盒分离DNA。最后，可以使用例如QuantiT PicoGreen 量化试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)和分光光度计,或者通过任何其它合适的技术测定分离的DNA的浓度。一旦已经制备或以其它方式获得引物、探针和基因组DNA样品，可以进行PCR反应以鉴定基因组DNA样品中感兴趣的核酸序列(例如，对于BMR突变特殊的序列)。在具体的实施方案中，制备单独的PCR反应混合物，其含有所有反应组分，除了基因组DNA样品夕卜。对于包含bm3突变体和野生型COMT玉米的引物和基因特异性探针的双重反应，反应混合物可以包含酶、反应缓冲液、bm3突变的正向和反向引物、野生型COMT基因的正向和反向引物、bm3突变的基因特异性探针、COMT基因的基因特异性探针和水。在一些PCR测定 系统(例如，TaqMan PCR测定法)中，酶和缓冲液可以存在于单一试剂盒组分(例如，TaqVlan .:_l||因型分型 Master 混合物；AppliedBiosystems, Foster City, CA,产品目录编号 #4371355)中。一旦以其它方式制备反应混合物，可以添加基因组DNA样品，并开始反应。不必要标准化样品中基因组DNA的量。然而，熟练技术人员可以通过使用具有相对相等浓度的基因组DNA样品获得最好的结果。在一些实施方案中，可以用合适的对照建立PCR测定法(例如，TaqMan PCR测定法)。例如，多孔板中的反应可以在对照孔的情况下实施，所述对照孔包含(1)具有试剂但没有DNA样品的阴性对照；(2)包含bm3玉米基因组DNA的纯合阳性对照；(3)和半合子阳性对照，如上文所描述的。然后，在合适的循环条件下通过PCR扩增DNA。例如，在使用GenAmp PCR系统9700的一些实施方案中，可以存在着于95° C持续15分钟的单一初始变性循环，接着是30个循环的变性(92° C持续15秒)和变性/延伸￠0° C持续60秒)。本领域技术人员理解，PCR循环条件可以随从业人员的判断而有所变化，并且获得相当的结果。D.基因型和/或接合性的测定可以使用PCR测定法(例如，端点TaqMan PCR测定法)进行BMR玉米或推定的BMR玉米的基因型和/或接合性分析。在一些实施方案中，可以用报告物(例如，荧光模块)标记基因特异性寡核苷酸探针。对于使用荧光测定检测的测定法，可以使用适合于检测探针的激发和发射波长设置在分光荧光计(例如，Tecan GENios ； Mannedorf,Switzerland)中分析PCR反应产物。例如，可以用485nm的激发波长和535nm的发射波长测量荧光染料FAM。或者，可以用525nm的激发波长和560nm的发射波长测量荧光染料VIC。在完成PCR反应和探针检测后，可以使用例如任何合适的计算机制图学软件产生表和分布图。用相似基因型背景的野生型、半合子和纯合DNA获得的结果可以充当阴性和阳性对照。在一个分离的群体中，可以获得数据点的三个簇，其容许将样品结果视觉测定为可能属于分离簇之一。或者，可以使用数据分析计算机软件来计算如下的可能性，即样品结果属于每个分离簇，其中最可能的簇充当样品名称。在进行视觉测定时，每个簇的边界可以是任意的，例如在数据点的三个簇是明显可见的时。也可以使用合适的分析包，诸如KUMSOffiioscience实验室信息管理系统)自读板仪直接分析原始荧光强度数据。可以产生具有在一条轴上绘图的由突变体等位基因的特异性探针产生的荧光信号的相对荧光单位(RFU)和在另一条轴上绘图的由野生型等位基因的特异性探针产生的荧光信号的RFU的图。然后，接合性测定可以基于数据图形显示中的簇分离进行。不含突变体基因组DNA (例如，BMR突变)的样品仅可以产生野生型PCR产物的荧光读数。含有半合子或纯合突变体基因组DNA的样品可以产生比阴性背景对照的读数高的突变体特异性探针的RFU读数。若样品不产生足够的结果，则样品中的基因组DNA可能不是足够质量和/或数量的，并且应当实施新的DNA制备和/或新的PCR反应。优选地，不含DNA样品的阴性对照样品显示基因特异性探针的非常低的检出。还优选的是，已知的纯合对照仅仅显示对照中突变体或野生型DNA的高检出，而已知的半合子对照显示突变体和野生型DNA两者的高检出。·
PCR方法和基因型和/或接合性测定的“测试运行”可以在筛选样品前在所有合适的对照的情况中实施。方法的进一步优化对于可以在各次使用间有所不同的组分(例如，基因组DNA制备的方法、Taq DNA聚合酶、寡核苷酸、实验室设备等)可以是想要的。可以建立PCR和热循环条件，其以可接受的探针检测水平(例如，对于经荧光标记的寡核苷酸探针为可接受的RFU)扩增已知基因组DNA模板中突变体和/或野生型序列两者。E.低木质素含量的性状对植物种质的基因渗入本文中描述了经由牵涉有性生殖的常规植物育种生成具有低木质素含量的玉米植物(例如,BMR玉米)的方法。方法可以包括将在其基因组中包含至少一个拷贝的BMR突变(例如，bm3、bm3-l、bm3-2)的第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物杂交,从而生成Fl后代。第一植物可以是任何BMR玉米植物，包括例如BMR玉米品种F2F297、F2F383、F2F488、F2F449、F2F566、F2F610、F2F622、F2F665、F2F633、F2F682、F2F721、F2F700 和 F2F797。第二亲本玉米植物可以是在与第一玉米植物杂交时能够生成能活的后代玉米植物(即，种子)的任何玉米植物。第一和第二亲本玉米植物可以是相同玉米物种(例如，玉蜀黍(Zeamays, maize))的。所述方法可以进一步牵涉将F1后代自交以生成F2后代。方法可以进一步牵涉将F1或F2后代植物与作为第一或第二亲本玉米植物的相同系或基因型的植物回交的一个或多个世代。或者，可以将第一次杂交或任何随后的杂交的F1后代与第三玉米植物杂交，所述第三玉米植物与第一或第二植物是不同系或基因型的。在一些实施方案中，将后代植物进行公开内容的基因型和/或接合性测定。一旦已经将后代植物基因型分型，和/或已经测定其接合性，则熟练技术人员可以选择那些具有期望的遗传组成的后代植物。此类选定的后代植物可以进一步的杂交、自交或培养中使用。依照公开内容的方法指导的BMR突变的基因渗入的方法降低或消除没有期望的遗传组成的植物的培养和/或生殖，并且由此提供期望的可靠性和可预测性(经由预期的孟德尔遗传方式)。提供了以下实施例以例示某些具体的特征和/或实施方案。以下实施例不应解释为将公开内容限制成所描述的具体特征或实施方案。实施例实施例I :材料和方法植物和遗传材料。提供了含有纯合bm3等位基因和纯合野生型COMT等位基因的玉米叶样品。总基因组DNA的分离和量化。每份样品冲孔8个叶盘，并使用Genogrinder 2000将其研磨成细粉末。用Qiagen DNeasy 96孔试剂盒(Valencia, CA)提取DNA。在PCR前，使用制造商的用法说明书用Quant iT PicoGreen 量化试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)
量化DNA样品。部分COMT基因的克隆和测序。在含有2. 5个单位的TaKaRa LA Taq (Takara Bio Inc.，Shiga, Japan)、400nM dNTP、200nM 正向(BM35_F)和反向引物(BM34_R)和 30ng基因组 DNA 的反应中使用 ABI GeneAinp PCR 系统 9700 (Applied Biosystems, FosterCity, CA)用寡聚物 BM35_F(5’ -TACTCTACTGGCTGCGGCTAGC-3’ ; SEQ ID NO: I)和 BM34_R(5，-TAACCTTGATTGTTATTACTCGCACATGG-3’ ; SEQ ID NO:2)自 12 种 bm3 系和 3 种非 bm3 样品(见表I)扩增部分COMT基因的玉米基因组DNA片段。PCR程序以于94° C变性2分钟开始，接着是94° C持续45秒，55° C持续45秒和72° C持续2分钟的30个循环。将PCR产物在 2%E Gel (Invitrogen, Carlsbad, CA)上显现，然后在 0. 8%E Gel CloneWells 上提取。然后，依照制造商的用法说明书将纯化的PCR产物克隆入pCR4 TOPO 载体(Invitrogen, Carlsbad, CA)中。将选定的菌落在含有2. 5%LB(对于IL LB培养基为IOg胰蛋白胨、IOgNaCl和5g酵母提取物)、36mM K2HPO4U3mM KH2P04、I. 7mM柠檬酸钠、
6.8mM (NH4)2SO4,4. 4% 甘油、0. 4mM MgSO4 · 7Η20、12· 5 μ g/mL 氯霉素(使用前立即添加)和50 μ g/ml卡那霉素的IX冰箱培养基(freezer media)中培养过夜。然后，将选定的菌落送到Cogenics (Houston, TX)，以用 T7 和 T3 启动子及 BM1234R(5’ -ATCAGCATCAGCCAGGCAGG-3，；SEQ ID NO: 3)(其位于COMT基因内)测序。使用Sequencher 4. 8软件分析序列。通过比较来自bm3系与野生型COMT样品的共有序列鉴定Bm3突变。表I :用于COMT基因的克隆和测序的12种bm3和3种非bm3近交系的表。


本公开内容关注用于测定含有一处或多处褐色中脉(BMR)突变的玉米植物的接合性的组合物和方法。公开内容还关注可用于增强BMR玉米的育种过程的方法。在某些实施方案中，用于测定玉米植物就bm3等位基因而言的接合性的组合物和方法。