专利名称：用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法人脐血(human umbilical cord blood，hU(B)是胎儿出生时脐带内及胎盘内近胎儿侧血管内的血液，含有丰富的干/祖细胞，研究较多的主要为造血干细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)。人脐带血间充质干细胞(hUCB-MSCs)是一种成纤维细胞样，具有无限增殖和多向分化潜能的干细胞，表达SH2、SH3、SH4、ASMA、MAB1470、CD13、 ⑶四、⑶44、⑶166和⑶73等细胞表面抗原，但不表达⑶34、⑶45、⑶14等表面标志；与骨髓来源的MSCs具有相似生物学特性，但其培养成功率相对较低，据统计只有25-30%的脐血样本培养后出现MSCs，限制了其研究及应用价值的进一步发掘。不同的培养基、细胞因子、 扩增体系及纯化方法，可直接影响hUCB-MSCs培养的成功与否、扩增的数量及其生物学特性的保持。但又因其具有来源丰富，易收集，不涉及明显的伦理及法律争议，被病毒、细菌污染机率小，且免疫原性低、增殖分化能力强等优点，已在神经元退行性疾病、组织损伤等疾病的治疗中显示出良好的临床应用前景，故而不断优化其培养体系一直备受关注。hUCB-MSCs除可在适宜条件下分化为成骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经元细胞、心肌细胞、肝样细胞及胰岛细胞之外，还具有免疫调节作用和分泌功能；与造血干细胞一起移植，还可促进机体造血功能的恢复及长期造血功能的重建。但培养过程中， hUCB-MSCs数量少、获率低、周期长是制约其应用的瓶颈。脐带血中MSCs的比例较骨髓低得多(0. 05-2. 8/1 X 106hUCB单个核细胞，2-5/1 X IO6骨髓单个核细胞)；加之hUCB-MSCs缺乏特异性标志，其分离方法相对粗糙，难以去除混杂的破骨样细胞，大部分脐血标本中破骨样细胞占优势，MSCs夹杂其间，很难生长达到融合，无法传代。目前常用的分离、纯化方法主要是采用Ficoll、Percoll等密度梯度离心法和差速贴壁法进行单个核细胞的分离及 hUCB-MSCs 的纯化。以往的 hUCB-MSCs 培养通常使用单一的 DMEM/F12、DMEM/MEM、DMEM/Ham、α -MEM 和IMDM等，加以自体血清、脐带血血清，human platelet Iysate替代FBS，或添加氢化可的松、粒单细胞集落刺激因子、胰岛素等；也可通过调整pH偏酸性的Mesencult 间充质专用培养基，结合差速贴壁，传代培养出了高纯度的hUCB-MSCs。但这些培养方法突出的问题在于hUCB-MSCs培养成功率较低，尤其是单一的DMEM/F12、DMEM/MEM等培养基传代培养3_5 代后还出现明显的hUCB-MSCs生物学形态特征和功能改变，不适于细胞需求量较大的研究与应用。另外，许多市售专用培养基除存在经济成本较高外，在原代培养过程中破骨样细胞的生长常常比较旺盛，明显不利于差速贴壁、传代培养后纯化hUCB-MSCs，甚而极大地降低了 hUCB-MSCs的培养成功率。
本发明的目的在于提供一种用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法。本发明选用不适于破骨样细胞生长的PH值偏酸的DMEM/F12培养基，在提高hUCB_MSCs 集落形成和原代培养hUCB-MSCs成功率的同时，又发挥了后续使用Oricell人脐带间充质干细胞培养基能多次传代、较大量扩增hUCB-MSCs，并保持hUCB-MSCs良好生物学特性的优点，还大大降低了使用单一专用培养基的经济成本。本发明的技术方案用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法 采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离人脐带血单个核细胞，然后用PH值偏酸 (pH=6. 5-6. 8)的含10%FBS的DMEM/F12培养基原代培养人脐带血间充质干细胞，PO代细胞消化传代时，继续用含10%FBS的DMEM/F12培养基传代培养至P2代，同时通过换液和酶消化结合差速贴壁法进行P1-P2代细胞的纯化；从P3代细胞开始，改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养至P8代。具体地说，前述方法包括以下两个步骤(1)单个核细胞的分离将无菌采集的肝素抗凝脐带血用D-PBS缓冲液稀释、混勻后，按1 1体积比将稀释血加于淋巴细胞分离液上，离心后吸取中间白膜层，用含2mmol/L EDTA的D-PBS缓冲液洗涤后加入0. 83%的氯化铵裂解红细胞，用含2%FBS的PBS缓冲液洗涤细胞，离心后沉淀用DMEM/F12培养基悬浮，0. 4% 台盼蓝染色，观察细胞活力；(2)培养当细胞活力>95%时，用pH值偏酸(pH=6. 5-6. 8)的含10%FBS的DMEM/F12培养基进行原代培养；当生长2H8d，PO代细胞达到80%融合时，用含10%FBS的DMEM/F12培养基按1瓶细胞接种1瓶细胞进行传代培养；Pl和P2代细胞继续用含10%FBS的DMEM/F12培养基按1瓶细胞接种2瓶细胞进行传代培养；从P3代细胞开始，改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养至P8代。前述步骤(1)中所述D-PBS缓冲液的配制方法为取KCl 0. 20g、KH2P040 . 20g、NaCl 8. 00g、Na2HPO4 ‘ 7Η202· 16g，加超纯水至1000ml，调pH至7. 2 7. 4，高压灭菌，冷却后置4°C冰箱保存即可。前述步骤(1)中所述淋巴细胞分离液的密度为1. 077g/ml。前述步骤(2)中所述原代培养条件为按细胞密度5X106个/ml，将分离的单个核细胞接种于T25培养瓶，1份脐带血获得的细胞接种于2-3个T25培养瓶，用pH值偏酸 (pH=6. 5-6. 8)的含10%FBS的DMEM/F12培养基于37°C、5%的(X)2饱和湿度下进行原代培养， PO代细胞5d后首次半量换液，以后每5d换液一次。前述步骤(2)中所述P0-P2代细胞传代培养条件为当形成人脐带血间充质干细胞集落的PO代细胞达到80%融合时，用0. 25%的胰酶与0. 02%的EDTA混合液消化细胞 1-1. 5min,用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，每25ml培养瓶(细胞数5X IO5 1 X IO6个)细胞沉淀用含10%FBS的DMEM/F12培养基5ml重悬，1瓶传1瓶进行传代培养； P1、P2代细胞生长至细胞达80%融合时，用0. 25%的胰酶与0. 02%的EDTA混合液消化细胞 1-1. 5min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，每25ml培养瓶(细胞数IXlO6 3 X IO6个)细胞沉淀用含10%FBS的DMEM/F12培养基IOml重悬，一瓶细胞均分为二瓶进行传代培养；每3-5d换液、传代一次。前述步骤(2)中所述P3代以后细胞传代培养条件为P3代细胞达到80%融合时，用0. 25%的胰酶与0. 02%的EDTA混合液消化细胞1_1. 5min,用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养，细胞接种密度 1 X IO6个/ml，每3-5d换液、传代一次；当细胞生长达80%融合时，重复消化、终止消化以及 Oricell人脐带间充质干细胞培养基培养步骤，传代培养至P8代。前述含10%FBS的DMEM/F12培养基含2mmol/L的L-谷氨酰胺、100 μ g/ml的链霉素和100U/ml的青霉素。为了验证本发明方法的可行性及效果，下面通过具体实验例来进一步说明。一、材料和方法1、目的观察两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCB-MSCs)，及其对 hUCB-MSCs 基本生物学特性的影响。设计细胞培养和干细胞生物学特性检测。2、材料获得产妇及其家属知情同意后，采集妊娠36-40周剖宫产新生儿脐带血， 肝素(200U/ml)抗凝，50 75ml/份，由遵义市妇幼保健院提供，产妇健康，HBsAg阴性、HIV 阴性，未发现胎儿先天性疾病。脐血采集后4h内进行实验。 3、实验用主要试剂与仪器本发明公开了一种用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离人脐带血单个核细胞，用DMEM/F12培养基原代培养人脐带血间充质干细胞，增加了细胞的贴壁，明显减少了破骨样细胞的生长，有利于hUCB-MSCs集落的形成，大大提高了hUCB-MSCs培养的成功率；继续用DMEM/F12传代培养至P2代，同时采用酶消化和差速贴壁法结合，明显有利于P1-P2代细胞的纯化；P3代以后改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基培养，保持了hUCB-MSCs的标志蛋白及良好的形态学特征和生长特性，并保持了hUCB-MSCs的多向分化潜能；另外，本发明所采用的培养基成本明显降低。