一种低酰基结冷胶的提取方法[0002]结冷胶是继黄原胶后的又一新型微生物胞外多糖，具有优良的凝胶性能，是由四个糖分子依次为D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、L-鼠李糖通过糖苷键连接而成的高分子，其中第一个葡萄糖分子是以β_1，4糖苷键连接。由于结冷胶具有优越的凝胶性能，其被广泛的应用在食品领域，如奶制品、果肉饮料、果酱制品、布丁果冻及面包填料等，也应用在非食品领域中，如牙膏、药物的缓慢释放、微生物培养基等。[0003]结冷胶应用在奶制品中，将结冷胶加热到70°C~75°C可直接水合于奶中，在酸性奶制品中加入此种水溶胶充当胶体保护剂，可以消除奶制品中的蛋白质絮凝及口感的作用；用于糖果中，可给产品提供优越的结构和质地，并缩短淀粉软糖胶体形成的时间；结冷胶加入到饼干制品中可以减少饱和脂肪酸的用量，并改良饼干的层次，使饼干具有良好的疏松度；结冷胶也可替代果胶制备果酱和果冻，也能用于糕点和水果馅饼填料中；在肉制品和蔬菜类的加工过程中，添加结冷胶可弥补产品的口味不足，使其具有清爽的品味特点。[0004]按照结冷胶多糖分子中乙酰基的含量通常将结冷胶产品分为两种:一种是低酰基结冷胶，通过对高酰基结冷胶作脱酰基或部分脱酰基处理得到，水化后在阳离子作用下易形成脆性凝胶；另一种是高酰基结冷胶，即天然结冷胶，水化后易形成粘弹性凝胶。低酰基结冷胶不仅稳定，而且具有良好的凝胶性能，与传统凝胶剂(如卡拉胶琼脂等)相比，仅需0.25%的用量，即可达到1.5%琼脂和1%卡拉胶所能达到的凝胶强度，因此低酰基结冷胶在食品医药科研等领域有着广泛用途，具 有良好的市场前景。现有技术CN201210088884公开了一种结冷胶的发酵工艺，该方法存在结冷胶产率不高、步骤复杂并且需要添加PH调节剂等问题。如何开发一种结冷胶的产量高以及工业能耗低的绿色提取工艺实现有技术急待解决的技术问题。
[0005]为了克服现有技术的不足，提高低酰基结冷胶的产量，节省原料以及废物回收利用，本发明提供了一种低酰基结冷胶的提取方法，包括以下制备步骤:[0006]第一步，将混合菌液(少动鞘脂单胞菌液和短小芽孢杆菌液重量比为10: 1，两种菌液中菌体的浓度均为I X IO8个/mL)按照10% (体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为30°C，PH值7.2的条件下，培养24小时得到液体A，然后按液体A:发酵罐培养基为1: 10的体积比例转入发酵罐中培养，温度30°C，PH值7.2，培养时间72小时，得到发酵液；其中，种子罐培养基的组分为:鹿糖25g,蛋白胨5g,硫酸铵4.0g,酵母膏3.0g,檬酸3.5g，碳酸钙2.0g，蒸馏水1000ml ;发酵罐培养基的组分为:蔗糖40g，蛋白胨Sg，磷酸二氢钾3g,柠檬酸2.5g,碳酸韩2.0g,硫酸镁lg，蒸懼水1000ml ；
[0007]第二步，在第一步获得的发酵液内同时加入硅藻土和气相二氧化硅的混合物，边添加边搅拌，搅拌lOmin，搅拌速度为lOOr/min，然后用板框过滤，分别收集过滤后的滤液和菌体；其中所述混合物的添加量为发酵液重量的0.5%，所述硅藻土和气相二氧化硅的质量比为3: I ;所述气相二氧化硅的比表面积为200m2/g以上；
[0008]第三步，向第二步得到的滤液中加入液碱调节pH为10，升温至90°C~95°C，维持30~40分钟，进行脱酰基处理，然后降至室温；加入2~3倍体积的70%~90%乙醇，混合均匀，絮凝结冷胶；然后经膜过滤除去废液，得到絮凝结冷胶；并且低温旋转蒸发回收废液中的乙醇后，得到液体B;将上述絮凝结冷胶重新分散和溶解于水，得到结冷胶液体，然后加入结冷胶液体体积6%~7%的饱和氯化钠溶液，沉淀析出结冷胶；
[0009]第四步，将第三步析出的结冷胶经螺杆式压榨机，去除多余的水分，得湿品结冷胶；然后将湿品结冷胶干燥、粉碎即得低酰基结冷胶；
[0010]第五步，将第二步获得的菌体以及第三步获得的液体B混合得到混合溶液，然后往混合溶液中添加玉米粉、高粱粉、豆渣以及麦麸，边添加边搅拌至糊状；最后通入蒸汽升温至110°C，蒸馏15分钟；然后将蒸馏物烘干、粉碎后，添加硫酸锌、维尘素E以及绿原酸，混合均匀，获得猪饲料；其中，玉米粉、高粱粉、豆渣以及麦麸分别占混合溶液质量的6%，5%，2%和1%，硫酸锌、维生素E以及绿原酸分别占混合溶液质量的万分之一。
[0011]本发明还公开了一种生产低酰基结冷胶的复合菌液，其由少动鞘脂单胞菌液和短小芽孢杆菌液按照重量比为10: I混合而成，两种菌液中菌体的浓度均约为IXio8个/mL。
[0012]本发明使用的少动鞘脂单胞菌和短小芽孢杆菌为本领域常用的菌株，优选少动鞘脂单胞菌 Sphingomonas paucimobilis (ATCC 31461,参见 J Ind MicrobiolBiotechnol.20020ct ；29(4):170-6.)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) (ATCC27142，参见 Journal of Food Protectionl995, Volume58, Number4)。
[0013]本发明取得的有益效果主要如下:`[0014]通过多次试验和研究，开拓性地在少动鞘脂单胞菌发酵中添加了短小芽孢杆菌，使得短小芽孢杆菌能够有效地降解少动鞘脂单胞菌产生的各类酸性物质，并且使得发酵液始终维持在弱碱性条件下，保持少动鞘脂单胞菌发酵效果维持在较高的状态；
[0015]少动鞘脂单胞菌发酵产生结冷胶的最佳pH为7.2左右，但是在发酵过程中会产生多种酸性物质，包括羟基丁酸等，使得发酵环境往酸性条件演化，不利用少动鞘脂单胞菌的发酵，使得结冷胶的产量降低，而短小芽孢杆菌通过与少动鞘脂单胞菌的协同共生，促进了结冷胶的生成；并且降低了结冷胶中各类酸性物质的含量，提高了结冷胶的纯度。
[0016]发酵过程中无需额外添加pH调节剂，减少了原料的浪费，节约了成本；
[0017]提取过程中减少了现有技术中其他提取方法使用的各类化学物质，避免了将化学物质带入到结冷胶中；
[0018]在提取结冷胶的过程中，对菌体蛋白、大分子多糖等进行了回收，避免了此类物质的废液对环境造成的污染；同时，获得了营养丰富的菌体蛋白饲料，变废为宝，增加经济效益；同时实现了结冷胶提取过程绿色环保，几乎无废水外排，料液组分充分利用。

[0019]以下将采用具体的实施例来对本发明作进一步的解释，但是不应当看作是对本发明创新精神的限制。[0020]实施例1
[0021]一种低酰基结冷胶的提取方法，包括以下制备步骤:
[0022]第一步，将混合菌液(少动鞘脂单胞菌液(ATCC31461)和短小芽孢杆菌液(ATCC27142)重量比为10: 1，两种菌液中菌体的浓度均为I X IO8个/mL)按照10% (体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为30°C，PH值7.2的条件下，培养24小时得到液体A，然后按液体A:发酵罐培养基为1: 10的体积比例转入发酵罐中培养，温度30°C，PH值7.2，培养时间72小时，得到发酵液；其中，种子罐培养基的组分为:蔗糖25g，蛋白胨5g,硫酸铵4.0g,酵母膏3.0g,柠檬酸3.5g,碳酸钙2.0g,蒸懼水1000ml ;发酵罐培养基的组分为:蔗糖40g，蛋白胨Sg，磷酸二氢钾3g，柠檬酸2.5g，碳酸钙2.0g，硫酸镁lg，蒸馏水1000ml ；
[0023]第二步，在第一步获得的发酵液内同时加入硅藻土和气相二氧化硅的混合物，边添加边搅拌，搅拌lOmin，搅拌速度为lOOr/min，然后用板框过滤，分别收集过滤后的滤液和菌体；其中所述混合物的添加量为发酵液重量的0.5%，所述硅藻土和气相二氧化硅的质量比为3: I ;所述气相二氧化硅的比表面积为200m2/g以上；
[0024]第三步，向第二步得到的滤液中加入液碱(又名纯液体烧碱)调节pH为10，升温至90°C，维持35分钟，进行 脱酰基处理，然后降至室温；加 入2倍体积的80%乙醇，混合均匀，絮凝结冷胶；然后经膜过滤除去废液，得到絮凝结冷胶；并且低温旋转蒸发回收废液中的乙醇后，得到液体B ;将上述絮凝结冷胶重新分散和溶解于水，得到结冷胶液体，然后加入结冷胶液体体积7%的饱和氯化钠溶液，沉淀析出结冷胶；
[0025]第四步，将第三步析出的结冷胶经螺杆式压榨机，去除多余的水分，得湿品结冷胶；然后将湿品结冷胶干燥、粉碎即得低酰基结冷胶；
[0026]第五步，将第二步获得 的菌体以及第三步获得的液体B混合得到混合溶液，然后往混合溶液中添加玉米粉、高粱粉、豆渣以及麦麸，边添加边搅拌至糊状；最后通入蒸汽升温至110°C，蒸馏15分钟；然后将蒸馏物烘干、粉碎后，添加硫酸锌、维生素E以及绿原酸，混合均匀，获得猪饲料；其中，玉米粉、高粱粉、豆渣以及麦麸分别占混合溶液质量的6%，5%，2%和1%，硫酸锌、维生素E以及绿原酸分别占混合溶液质量的万分之一。
[0027]实施例2
[0028]实施例1制备的低酰基结冷胶的性能参数:
[0029]对照组:仅采用少动鞘脂单胞菌发酵生产结冷胶，其他步骤同实施例1 ;实验组为实施例1制备的结冷胶。分子量测定(酸碱滴定法测定结冷胶中酰基的含量):对照组低酰基结冷胶平均分子量均在:76万道尔顿，实验组的结冷胶的平均分子量均在:74万道尔顿。
[0030]凝胶强度的测定:用TA.TX21物性测试仪进行测定透光率的测定；
[0031]透光率的测定:称取0.5样品，加蒸馏水100ml，将烧杯置于80摄氏度水浴中，样品溶解后加入2.7%的氯化钙溶液2ml，补充蒸发水量至原体积，趁热将胶溶液倾入比色皿，立即放入20摄氏度的恒温箱中放置15分钟，用分光光度计在497nm处测定透光率，用
蒸馏水对照。
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