专利名称：一种抗寒的草铵膦抗性基因及应用的制作方法草铵膦(Glufosinate)是有机磷类除草剂，其有效成分是phosphinothricin (简称PPT)，化学名称为(RS)-2-氨基-4-4(羟基甲基氧膦基)丁酸铵，是外消旋体混合物，只有L-PPT具有植物毒性，属灭生性仿生茎叶处理剂。草铵膦的研制与开发是与双丙氨膦密切相关。双丙氨膦是从链霉菌(Str印tomyceshygroscopicus)发酵液中分离提纯的一种三肽天然产物，双丙氨膦本身无除草活性，在植物体内降解成具有除草活性的草铵膦。据此，德国艾格福公司直接合成草铵膦(Glufosinate)，成功开发出一个新除草剂品种。草铵膦制剂已被广泛使用在非耕地防除多种一年生和多年生禾本科草和阔叶草(Ahren W H et all994)。草铵膦原药为白色至浅黄色结晶粉末，密度1.4g/ml(20°C )，熔点215°C，沸点99. 5 °C，蒸气压< 0. ImPa (25 V )，高度稳定，25 °C可贮存2年；20°C、pH = 7时水溶度l，370，000mg/L，20°C时有机溶剂溶解度(g/100ml)丙酮0.016，乙醇0. 065，乙酸乙酯 0. 014，正己烧 0. 02，甲苯 0. 014 (Vencill W K 2002 HiraiK, Uchida A，Ohno R 2002)。草铵膦是非选择性茎叶处理剂，传导较差。一般来说，草铵膦在植物体内随蒸腾流在木质部运输(Anderson D M et al 1993)，但是在一些植物体内，14C-草铵膦也可以由韧皮部运输到根的分生组织。研究还发现杂草对草铵膦的敏感性与草铵膦在韧皮部内传导的速率密切相关。Steckel等人(1997b)报道，草铵膦处理狗尾草、稗草、苘麻和藜24h后，对草铵膦的吸收依次是67^^53^32^^16 ^用14C-同位素示踪法检测这4种杂草对草铵膦传导性，处理狗尾草1 后，对草铵膦运输达到；处理稗草24h后，对草铵膦运输达到14%。经研究发现，处理叶片将所吸收的草铵膦向根部运输，这就说明狗尾草和稗草对草铵膦的运输是经韧皮部进行的(Steckel G J 1997b)。谷氨酰胺合成酶在植物的氮代谢过程中起作用，它是植物一个重要的解毒酶， 可解除由硝酸盐还原、氨基酸降解及光呼吸中释放出的铵的毒性。草铵膦的靶标酶正是谷氨酰胺合成酶(GQ。在正常情况下，GS可以由ATP及glutamate形成λ-glutamyl phosphate0但在PPT处理后，PPT先与ATP结合，磷酸化的PPT占据GS分子的8个反应中心，使GS的空间构型发生变化，从而GS的活性受到抑制。这些过程破坏的结果导致细胞内氨积累、氨基酸合成及光合作用受抑制、叶绿素破坏；虽然氨的积累能使细胞死亡，但主要引起植物受害的还是对RuBp羧化酶/光呼吸作用迅速抑制造成。同使，草铵膦也具有杀虫和杀菌功能(Nicole J Kutlesa, Stanley Caveney 2001)。最早研究草铵膦在土壤中的代谢是Tebbe和Reber (Tebbe C C and H HReber 1988)，随后Smith (Smith A Ε. 1988)也进行了研究。草铵膦在土壤中降解很快，半衰期短， 其土壤活性很低。草铵膦在土壤中一般被降解为4-甲基磷酸亚基2-氧代丁酸(PPO)，3-甲基磷酸亚基丙酸(MPP)，2-羟基-4-羟基(甲基)膦酰基丁酸(MHB)和4-羟基(甲基)膦酰基丁酸(MPB)。由于草铵膦杀草谱广，在环境中迅速生物降解及对非靶生物低毒，因此如何将其作为作物田苗后选择性除草剂使用是十分必要的，而生物工程技术为此提供了可能；至今为止，在转基因抗除草剂作物研究与推广中，抗草铵膦作物仅次于抗草甘膦作物而居第2 位，随着抗草铵膦作物种植面积的继续扩大，国际农药市场对草铵膦的需求将会进一步增加，无疑这对我国除草剂出口将是一大机遇。
本发明的目的是在于提供了一种抗寒的草铵膦抗性基因，该基因是通过设计引物从基因组中直接扩增得到。该基因的核苷酸序列全长为489bp，编码162个氨基酸。利用Genbank数据库中的BLASTP进行氨基酸序列比对，发现该基因编码的氨基酸序列Streptomyces hygroscopicus分离与克隆出抗性基因bar及Streptomyces viridochromogenes中分离出来具有同样功能的基因pat，都只有37%的相似性。证明该基因是一个新的基因。本发明的再一个目的是在于提供了一种抗寒的草铵膦抗性基因在植物除草剂草铵膦中的应用，将该基因连接到PGEX-6P-1表达载体(购自美国GEHealthcare公司) 上，转化到大肠杆菌Escherichia coliBL21 (该大肠杆菌Escherichia coliBL21购自 Invitrogen公司)，该菌能在150mM/L的草铵膦抗性平板上生长，而空白对照不能生长，经实验论证，该基因对除草剂草铵膦有很高活性，而且能够在低温下保持这样的活性。经测定发现该酶的，Kmippt)为 0. 079mM,Kcat 为 13IMirT1，Kcat/Km = 1711mM/L .min。说明该基因确实有很高的草铵膦抗性，在转基因植物有巨大的潜在应用价值。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种草铵膦抗性的编码基因的制备过程是将深海混合菌液按体积比为1 %的接种量转接到含有草铵膦(50mM/L)的HLB (培养基组成(质量体积比，以下相同)的蛋白胨，0.5% (质量体积比)酵母培养物和2% (质量体积比)氯化钠，补充水到1L，调pH至7. 0))液体培养基上培养M小时。再将生长好的菌液在含有草铵膦(50mM/L)的HLB固体(在液体HLB的基础上补加了质量体积比为2%的琼脂粉)培养基上划线培养M小时。划线分离得到单菌落以后，再按照上述方法复筛一次，得到的抗性细菌。抽提该原始单菌落的基因组DNA，并以其为PCR模板，选用16S扩增通用引物 1492R (5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)和 27F (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)(合成于金斯瑞生物公司)以细菌染色体DNA为模板进行PCR扩增，鉴定结果为lihodococcusequi (马红球菌，保藏在中国海洋微生物菌种保藏中心)，原始细菌的16S序列如表SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列，一种分离的草铵瞵抗性的编码基因，其序列为SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。查阅相关文献，发现该属的菌报道的基因组中有草铵瞵-N-乙酰转移酶的基因。然后设计引物从该菌的基因组DNA中通过PCR扩增出目的基因，命名为r印at，该基因的核苷酸序列全长为489bp(核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示)将该基因连接到表达载体pGEX_6P_l 上导入大肠杆菌BL21进行蛋白诱导表达，纯化。其表达的蛋白为phosphinothricinN-acetyltransferase (草铵瞵_N_乙酰转移酶)编码162个氨基酸。(氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示)。一种分离的草铵瞵抗性的蛋白，其序列为SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。为确定此酶对草铵瞵有活性，所以测定了此酶的相关活性。一种抗寒的草铵膦抗性基因在植物除草剂草铵膦中的应用，其应用过程是含有目的蛋白的该菌能在150mM/L的草铵瞵抗性平板上生长，而空白对照不能生长，通过PEG 法、微弹轰击法、电激法及Ri双元载体质粒将此基因导入水稻、小麦、马铃薯、玉米、甜菜、 烟草、番茄、油菜、甘蔗等20多种作物中，证明了这些转基因植株对草铵瞵的抗性有很好的效果。这种转基因技术所培育出来的品种，为控制一些抗性杂草提供了 1条很好的途径。此外，这类基因还可以作为植物的筛选标记基因，作为筛选标记的同时又赋予转基因作物农业上的有用性状。将此基因插入表达有助于提高分化频率，让其作为筛选标记基因，在组织培养的过程中，培养基中添加20mg/L以上的草铵瞵，存活的组织可以初步认定含有次目的基因。而含有该基因的大肠杆菌具有以下形态特征此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般大小约0. 5 μ -0. 8 μ ml. 0 μ m-3. 0 μ m,多单独存在或成双，但不呈长链状排列。约有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性，所以是阴性细菌。与现有发明相比，申请人克隆的i^pat基因编码的phosphinothricinN-acetyltr ansferase与现有的酶相比具有一些不同的特性。该酶的Km(ppt)为0. 079mM，Keat为13IMirT1， Kcat/Km= 1711mM/L*min (图7)，说明此蛋白具有较高的活性，而且该酶能在0°C时保持48% 左右的活性(图6)，说明此酶在低温下能够保持较高的活性，其转基因作物能在北方等寒冷的条件下生长有潜在的应用价值。在PH6-10的环境中能够维持60%左右的活性(图 5)，说明该酶具有广泛的酸碱度适用范围。该酶既能够作用草铵膦又能够作用于其类似物 L-甲硫氨酸砜和L-甲硫氨酸砜亚胺，是一个新的可以利用的有用资源。经过生物学实验验证，证明该酶具有高活性，耐低温，可广泛用于不同抗除草剂转基因作物。图1为一种抗寒的草铵膦抗性基因流程2为一种原始的pGEX-6p_l图谱图3为一种重组质粒pGEX-6p-l_R印at图谱图4为一种RePAT蛋白纯化示意图。M泳道为Marker 1泳道未诱导pGEX_6p-l上清2泳道诱导pGEX_6p-l上清3泳道未诱导RePAT上清4泳道诱导RePAT上清5纯化的目的蛋白图5为一种RePAT最佳pH示意图。横坐标为不同pH值纵坐标为相对活性。图6为一种RePAT最佳温度示意图。横坐标为不同温度值纵坐标为相对活性。图7为一种RePAT动力学图示意图。横坐标为浓度值纵坐标为速度。IOxPCR缓冲液(购自TAKARA公司)5 μΙ_
dNTP (10mM 购自 TAKARA 公司1 μΙ_
模板(Rhodococcus equi 染色体 DNA)1 μL
27F (10μΜ)1 μΙ_
1492R (10μΜ)1 μΙ_
TaqDNA 聚合酶(TAKARA)1 μΙ_
加无离子水至50 μ L0PCR 条件:95°C预变性 4min ；95°C，30s ；55°C，30s ；72°C 90s，30 个循环；72°C延伸 IOmin, 4°C 5min。将PCR产物送去金斯瑞生物公司测序，结果经Blast比对得知，该菌是 Rhodococcus equi。查询该菌的基因信息，发现该属的菌报道的基因组中有草铵膦_N_乙酰转移酶的基因。引物设计扩增目的基因根据NCBI GENEBANK 公布的 pat 基因的核苷酸序列(Accession Number :GI 311888035)设计合成如下引物正向引物(pat_F)5，_CG GAATTCATGCTGA TCCGCGACGCC-3，， 包含 EcoRI 限制性酶切位点，反向引物(pat-R)5，-ATAAGAATGCGGCCGCCTAGAGGGTCAGCTGCA G-3’，包含Notl限制性酶切位点。(下划线为酶切位点)引物由金斯瑞生物工程技术有限公司合成。PCR 扩增PCR体系如下
IOxPCR缓冲液(购自TAKARA公司)5 μΙ_
dNTP (10mM 购自 TAKARA 公司)1 μΙ_
模板(Rhodococcus equi DNA)1 μL
正向引物F (10μΜ)1 μΙ_
反向引物R(10|jM)1 μ
TaqDNA 聚合酶(TAKARA)1 μΙ_加无离子水至50 μ L0PCR 条件95°C 预变性 4min ；95°C, 30s ；55°C, 30s ；72 °C 30s, 30 个循环；72°C 延伸10min，4°C 5min。将PCR产物拿去金斯瑞生物公司测序，结果经Blast比对得知，该基因的核苷酸序列全长为489bp，启示密码子为AUG，终止密码为UAG0编码162个氨基酸，这些氨基酸形成的蛋白质属于N乙酰转移酶家族，该基因编码的氨基酸序列Sti^ptomyces hygroscopicus分离与克隆出抗性基因bar及Streptomyces viridochromogenes中分离出来具有同样功能的基因pat，都只有37%的相似性，说明该基因是一个比较新颖的基因，为转基因植物提供了一个新的资源。酶切PCR产物和质粒载体pGEX-6p_lPCR产物用限制性内切酶EcoRI-Notl (购自TAKARA公司)酶切，酶切反应体系如酶解缓冲液，5 μ L ；EcoRI，，2 μ L ；Notl, 2 μ L ；PCR产物，41 μ L。混勻后置于37°C保温6小时。质粒载体pGEX-6p-l (购自美国GE Healthcare公司)酶解体系和条件同上一致。DNA凝胶回收本发明中涉及到的DNA的纯化均使用试剂盒QIAquick GEL Extraction Kit (够自德国Qiagen公司)，操作参照产品说明书。具体过程是在紫外灯下将目的条带切下来后至于1. 5mL的离心管中，每IOOmg加入300 μ L的QG缓冲液，50摄氏度水浴锅温浴8min， 直到凝胶全部融化。将溶胶液加入到吸附管12000rpm，4°C离心lmin，加入750 μ L PE缓冲液离心洗脱lmin，加入50 μ L去离子水洗脱收集DNA。
连接连接体系IOX连接酶缓冲液(购自TAKARA公司)1 μ L双酶切的PCR产物6 μ L双酶切的载体2 μ L T4 DNA连接酶(购自TAKARA公司)1 μ L混勻后，16 °C保温过夜。转化将连接混合物与100 μ L大肠杆菌感受态细胞Ε. coli BL21 (DE3)混合，冰浴放置 30分钟，42°C处理90秒，加800 μ L LB培养基(其中1 %胰蛋白胨，1 %氯化钠，0. 5%酵母粉，ρΗ7. 0)，37°C保温45min，涂布于含100 μ g/mL氨苄青霉素固体LB平皿，37°C保温14小时，得到转化子。同时将该质粒转化到大肠杆菌DH5anvitr0gen公司)用于保存。实施例3 蛋白的表达、纯化与分析重组蛋白的表达将过夜活化的转化子以的接种量转接至IL含100 μ g/mL氨苄青霉素LB液体培养基中，37°C培养2-3h，使0D_达到0. 6-0. 7，加入异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 至终浓度为0. 2mM, 15°C 200转/分钟培养12小时。离心收集菌体，然后用PBS缓冲液(pH 7. 4，140. OmM氯化钠，2. 7mM氯化钾，10. OmM磷酸氢二钠，1. 8mM磷酸氢二钾)洗涤一次，再用50mL PBS悬浮，然后用高压细胞破碎仪破碎细胞(够自美国THERMO公司)。细胞破碎液于4°C、12000转/分钟离心30分钟，收集上清。用SDS-PAGE检测上清是否有目的蛋白表达。蛋白的纯化本发明利用GST亲和纯化重组蛋白，具体操作步骤如下(所有操作均在4°C下进行)装柱取ImL 柱材料 GSH Sepharose 4B (够自 Amersham-Pharmacia)司层析柱中， 用50mL PBS缓冲液洗脱平衡；结合将细胞破碎液液的上清以1. OmL/min的流速过柱；洗脱用IOOmL PBS洗脱没有结合的杂蛋白，流速控制在1. OmL/min以下；酶解取10 μ L浓度为10unit/yL的3C蛋白酶(购自Pharmacia公司)与ImL 的PBS缓冲液混勻，加入层析柱酶切混勻后4°C酶解16小时；收集蛋白收集酶解后的PBS至1. 5mL的离心管中，再加ImL PBS第二次洗脱收集，PBS缓冲液中即溶有目的蛋白；纯化蛋白的检测和定量本发明中涉及到蛋白的检测均使用12%的SDS-PAGE分析。配方如下
浓缩胶浓度为5%
H2O
30% Acr-Bis (29:1) IMTris-HCL1 pH8.8 10% SDS
10%过硫酸铵
TEMED
分离胶浓度为12%
H2O
30% Acr-Bis (29:1) IMTris-HCL1 pH8.8 10% SDS
10%过硫酸铵
1.4mL 0.33mL 0.25mL 0.02mL 0.02mL
0.002mL
1.6mL 2mL 1.3mL 0.05mL 0.05mL
TEMED0.002mL检测方法取10 μ L纯化的蛋白样品，加等体积的蛋白上样缓冲液(5Χ，购买自宝生物工程大连有限公司)，沸水浴5-lOmin，然后上样10 μ L。蛋白纯化的SDS-PAGE结果见图2。蛋白浓度的测定本发明中涉及到的蛋白质的定量均使用Bradford蛋白定量检测试剂盒(购自上海生工生物工程技术有限责任公司)。具体步骤如下取4yL蛋白标准品(购自上海生工生物工程技术有限责任公司)加PBS稀释至 100 μ L，使终浓度为200 μ g/mL。取稀释后的标准品按0，1,2,4,6,8,10，15 μ L分别加到96孔板中，加PBS补足到 20 μ L，每孔蛋白含量分别为0，0. 2，0. 4，0. 8，1. 2，1. 6，2和3 μ g，每个梯度重复3次。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加PBS到20 μ L，重复3次。各孔加入200 μ L Bradford Reagent，混勻，室温放置 5min。用预热的酶标仪(Thermo Scientific公司)测定A595读数。绘制标准曲线，计算样品的蛋白浓度。最后计算获得蛋白浓度为0. 62mg/mL。实施例4 酶学性质的测定草铵膦N乙酰转移酶最适pH的测定采用二硫代二硝基苯甲酸(DNTB)显色的方法测定辅酶A的产量。取0. 5ul纯化的蛋白加入到150ul用不同pH值缓冲液配置的草铵膦和乙酰辅酶A底物(pH3. 0-8. 0的缓冲液为0. 2M磷酸氢二钠/0. IM柠檬酸缓冲液；PH8-10的缓冲液为50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，35°C反应30分钟，然后加入3. OM盐酸胍IOul，终止反应3分钟，再加入20mM的DNTB20ul，持续五分钟，取200ul放入酶标仪测定A412的读数，以最高酶活为100%，计算不同条件下的相对酶活。图3表明，草铵膦N乙酰转移酶的最适pH为8. 6，在转基因作物中能更好的定位与植物的叶绿体中，而且在PH6-10的范围内都保持了 50%的活性。这表明该酶在一定的酸碱条件下都具有很好的催化活性。草铵膦N乙酰转移酶最适温度的测定草铵膦N乙酰转移酶最适温度的测定是用pH8. 6的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液在不同温度下测定酶活。图4表明，该酶在(0 60°C)都有活性，最适温度为25°C，且在0°C时都能够保持50%左右的活性，说明该酶是个冷活性的酶，更适用于在寒冷地带转基因作物的种植。草铵膦N乙酰转移酶的动力学测定在pH8. 6的缓冲液温度25°C时测定酶的动力学常数。图5表明，草铵膦N乙酰转移酶的 Kmippt)为 0. 076mM, Kcat 为 niMirT1，Kcat/Km = 1711mM/L · min。该酶与商品 PAT 活性相近，但是同源性确只有37%，为转基因植物中提供了一个新的资源，并且能够得到很好的应用。


本发明公开了一种抗寒的草铵膦抗性基因及应用，将深海混合菌液按1%的接种量转接到含有草铵膦的HLB的蛋白胨，酵母培养物和氯化钠液体培养基上培养。再将生长好的菌液在含有草铵膦的HLB固体培养基上划线培养。划线分离得到单菌落以后，再按照上述方法复筛一次，得到的抗性细菌。抽提该原始单菌落的基因组DNA，并以其为PCR模板，选用16S扩增通用引物1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)和27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)以细菌染色体DNA为模板进行PCR扩增，鉴定结果为Rhodococcusequi，原始细菌的16S序列为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，一种分离的草铵膦抗性的编码基因，其序列为SEQIDNO2所示的核苷酸序列。经过生物学实验验证，证明该酶具有高活性，耐低温，可广泛用于不同抗除草剂转基因作物。