制备2,4-二脱氧己糖和2,4,6-三脱氧己糖化合物的方法

J·G·T·基尔科尔斯, D·明克, S·潘科, F·A·M·洛门, D·希姆斯科克, J G T 基尔科尔斯, M 洛门, 匪箍瓶

2004年9月1日

2002年7月9日

2001年7月12日

Dsm Ip 财产有限公司, Dsm Ip财产有限公司

C12N15/60GK1526019SQ02813942

脱氧 制备

1.在醛缩酶和水存在下使用取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物和取代或未取代的醛制备2，4-二脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖的方法，其特征在于取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物与取代或取代的醛之间的反应是在羰基浓度最高为6摩尔/升反应混合物和2，4-二脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖的终浓度最低为反应混合物的2质量％的情形下进行2.根据权利要求1的方法，其特征在于2，4-二脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖的终浓度为反应混合物的5-50质量％3.根据权利要求2的方法，其特征在于2，4-二脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖的终浓度为反应混合物的10-25质量％4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于合成过程中反应混合物内的羰基浓度为0.6-4摩尔/l反应混合物5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于给料至少0.1摩尔/l的取代或未取代的醛6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物和/或取代或未取代的醛至少分两批加到反应混合物中7.根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物和/或取代或未取代的醛按时计量加到反应混合物中8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于加入的取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物总量与加入的取代或未取代的醛总量之间的摩尔比为1.5∶1至4∶19.根据权利要求1-8中任一项的方法，其特征在于使用2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶作为醛缩酶10.根据权利要求9的方法，其特征在于2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶由大肠杆菌产生11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其特征在于作为取代或未取代的醛，使用具有式HC(O)CH2X的取代醛，其中X代表CN，卤素，甲苯磺酸基，甲磺酸基，酰氧基，苯乙酰氧基，烷氧基或芳氧基12.根据权利要求11的方法，其特征在于X为离去基团13.根据权利要求1-12中任一项的方法，其特征在于使用乙醛作为取代或未取代的羰基化合物14.根据权利要求12和13的方法，其中得到的2，4-二脱氧己糖或得到的2，4，6-三脱氧己糖随后被转化成相应的4-羟基-四氢吡喃-2-酮15.根据权利要求14的方法，其中4-羟基-四氢吡喃-2-酮随后被转化成2-(1，3-二噁烷-4-基)乙酸衍生物16.根据权利要求15的方法，其中2-(1，3-二噁烷-4-基)乙酸衍生物随后被转化成相应的2-(6-羟甲基-1，3-二噁烷-4-基)乙酸衍生物17.根据权利要求15或16的方法，其中2-(1，3-二噁烷-4-基)乙酸衍生物为2-(1，3-二噁烷-4-基)乙酸叔丁酯18.按照权利要求1-13中任一项的方法制得的2，4-二脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖在制备药物中的应用19.根据权利要求17的用途，其特征在于所述药物为HMG-CoA还原酶抑制剂，优选他汀类

本发明涉及使用取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物和取代或未取代的醛在醛缩酶和水存在下制备2，4-二脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖的方法这种方法在US-A-5,795,749中是已知的，它经描述了经由4-取代的3-羟基丁醛中间体进行的2，4，6-三脱氧己糖的合成该方法使用乙醛和2-取代的醛作为反应物和醛缩酶作为催化剂这种酶促醇醛缩合方法的缺点是生产能力低下这主要是由于该种醛醇缩合通常是在低醛浓度下进行的，因为人们普遍认为在高浓度醛存在下使用的醛缩酶将会在很大程度上被灭活使用低浓度的另一个不利因素是反应末端反应混合物中的2，4，6-三脱氧己糖的浓度较低，对例如提纯的成本影响很大因此，人们预测不可能研制出基于这种技术制备2，4-二脱氧己糖和2，4，6-三脱氧己糖的工业适用方法本发明提供了一种通过酶促醇醛缩合反应制备2，4-二脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖的工业适用方法根据本发明，这一方法是在至多6摩尔/升反应混合物的羰基浓度下进行取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物与取代或未取代的醛之间的反应，结果2，4-二脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖的终浓度最低为反应混合物的2质量％在合成2，4-二脱氧己糖和2，4，6-三脱氧己糖的已知方法中，所用的羰基化合物的浓度至多为0.4摩尔/升反应混合物得到的2，4-二脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖的终浓度最高大约为反应混合物的1质量％令人惊奇的是，本申请人已发现可以适当使用高达6摩尔/1的羰基浓度，此时尽管羰基浓度增高但酶灭活程度仍保持有限结果，可以获得较高浓度的2，4-二脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖，从而提高生产能力，降低产物的成本，尤其是产物的纯化成本这样就有可能开发成工业适用方法在本发明范围内，羰基浓度应理解是指取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物和取代或未取代的醛以及取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物与取代或未取代的醛反应形成的中间体的浓度总和合成过程中羰基浓度实质上保持低于6摩尔/1对本领域技术人员而言是显而易见的是，在(极)短时间内浓度稍微增高不会产生严重的不利影响，因而在本发明范围内仍然是允许的优选羰基浓度为0.1-5摩尔/升反应混合物，更优选0.6-4摩尔/升反应混合物实践中2，4-二脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖的终浓度，按照反应结束时反应混合物的质量计算，通常为5-50质量％，例如8-40质量％，特别是10-35质量％取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物、取代或未取代的醛以及己糖的加料顺序并不特别重要优选的是，在加入取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物之前，先将己糖加到反应混合物中更优选的是，在加入取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物之前，将己糖与至少一部分取代或取代的醛的溶液混合，特别是当在选定条件下使用的取代或未取代的醛自身反应的程度低于取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物时更是如此优选取代或未取代的醛的浓度大于0.1摩尔/升反应混合物，更优选每升反应混合物大于0.3摩尔，特别是每升反应混合物大于0.6摩尔选择这种起始浓度的取代或未取代的醛对酶催化方法的起始反应速率具有有利影响己糖可以在反应过程中分数批加入或计量加入本发明的一个实施方案中，取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物和取代或未取代的醛以及己糖各自可以一次性加入到反应混合物中在如此操作时，取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物、取代或未取代的醛以及己糖可以同时或者依次加入根据该实施方案，所加入的取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物和取代或未取代的醛的数量总和一般可以达到6摩尔/升反应混合物，实践中终产物浓度常常达到反应混合物质量的7-15％，尤其是5-20％在本发明的另一个实施方案中，取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物的加料至少分两批完成，每下一批的加料都是在至少一部分前一批加料反应物发生转化之后进行这样就能够使加入的取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物与取代或未取代的醛的总数量在反应过程中达到每升反应混合物高于6摩尔，而与此同时反应混合物中的羰基浓度在反应期间任何时刻都低于6摩尔/1，从而减少酶的灭活如果需要，己糖可以一次性加入或者至少分两批加入在又一个实施方案中，取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物和/或取代或未取代的醛在反应期间按时计量加到反应混合物中在该实施方案中，优选至少一部分取代或未取代的醛是和己糖一同加入的如果需要，己糖可以一次性加入，分数批加入或者按时计量加入后两个实施方案可以产生高于40质量％的2，4-二脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖的终浓度此外，还发现向反应混合物计量加入取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物、取代或未取代的醛和/或己糖能够在很大程度上节约酶成本也可以将上述实施方案进行组合反应温度和pH并非特别重要，而且二者可选择为底物的函数优选反应在液相下进行反应例如可以在-5至45℃，优选0至10℃的反应温度以及5.5至9，优选6至8的pH下进行反应优选在大体恒定的pH下进行，使用例如缓冲剂或自动滴定方式调节作为缓冲剂，例如可以使用碳酸氢钠和碳酸氢钾、磷酸钠和磷酸钾、三乙醇胺/HCl、双-三-丙烷/HCl和HEPES/KOH优选使用碳酸氢钾或碳酸氢钠缓冲剂，其浓度例如为20-400毫摩尔/1反应混合物加入的取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物总量与加入的取代或未取代的醛总量之间的摩尔比不怎么重要，并且优选为1.5∶1至4∶1，特别是1.8∶1至2.2∶1也可以使用其它比例，但不具任何优点作为本发明方法中的催化剂，使用能催化两个醛分子或醛与酮分子之间醇醛缩合的醛缩酶优选所用醛缩酶为2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩合酶(DERA，EC 4.1.2.4)或其突变体，更优选大肠杆菌的DERA或其突变体DERA的用量并不十分重要，并且选择作为例如所用反应物、反应物浓度、需要的反应速率、需要的反应持续时间及其它实用因素的函数DEAR的用量为例如50-5000U/毫摩尔取代或未取代的醛1U(单位)为酶活性的量度，表示37℃下每分钟1μmole 2-脱氧核糖-5-磷酸的转化率取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物优选具有2-6个碳原子，更优选2-4个碳原子例如，可以使用醛(例如乙醛和丙醛)和酮(例如丙酮和氟代丙酮)当使用醛作为取代或未取代的具至少两个碳原子和至少一个α-氢原子的羰基化合物时，当然也可以使用其(半)缩醛形式，例如作为醇(特别是甲醇、乙醇或乙二醇)的缩醛形式作为取代或未取代的醛，例如可以使用具有2-20个碳原子的醛，例如乙醛、丙醛、丁醛、和缩醛保护的二醛或取代的醛，特别是具有式HC(O)CH2X的取代醛，其中X代表终产物中需要的取代基或可以转化为该取代基的基团，例如CN基团，或者代表在后续反应中作为离去基团可以裂去的取代基，例如卤素，特别是Cl，Br或I；甲苯磺酸酯基团；甲磺酸酯基团；酰氧基，特别是乙酰氧基；苯乙酰氧基；烷氧基或芳氧基，氯乙醛特别合适取代或未取代的乙醛可以以其原有形式或以其(半)缩醛形式使用，例如以醇(如甲醇、乙醇或乙二醇)的缩醛形式使用式1的2，4-二脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖例如是制备各种不同药物的需要中间体，特别是用于合成HMG-CoA还原酶抑制剂，更特别的是用于合成他汀类(staines)药物，例如洛伐他汀(lovastatine)、cerivastatine、rosuvastatine、辛伐他汀(simvastatine)、普伐他汀(pravastatine)和氟伐他汀(fluvastatine)，特别是用于合成ZD-4522，如M.Watanabe等在Drugs of the future，(1999)，24(5)，511-513，Bioorg.&Med.Chem.(1997)，5(2)，437-444中所述本发明因此提供了一条新的经济适用的制备2，4-二脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖的路线，此类化合物可用于合成例如2-(6-羟甲基-1，3-二噁烷-4-基)乙酸，后者是制备药物(特别是斯汀类)所需的中间体 式1的2，4-二脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖可以利用本发明方法由乙醛和HC(O)CH2X制备，其中X如上定义，随后可以例如经由已知方法转化为相应的式2 4-羟基-四氢吡喃2-酮 其中X如上定义用于这一转化的适当试剂例如有Br2/作为碱的碳酸钙(Tetrahedron Lett.30(47)，1989，p.6503)、重铬酸吡啶鎓/二氯甲烷(Carbohydrate Res.3001997 p.301)和四-羟基钌酸四-N-丙基铵(J.Chem.Soc.Commun.1987 p.1625)如果需要，得到的4-羟基-四氢吡喃-2-酮随后可以转化成式3的2-(1，3-二噁烷-4-基)乙酸衍生物 其中X如上定义，R1，R2和R3各自独立地代表含1-3个碳原子的烷基这种转化例如可以在适当缩醛化剂和酸催化剂存在下进行其后，2-(1，3-二噁烷-4-基)乙酸衍生物在碱和水存在下可以水解生成式4的盐 其中Y代表碱金属，碱土金属，或取代或未取代的铵基，优选Na，Ca或四烷基铵化合物，并且其中的X，R1和R2如上定义水解之后可以再进行生成相应的其中Y＝H的式42-(1，3-二噁烷-4-基)乙酸的转化式4的2-(1，3-二噁烷-4-基)乙酸的盐可以按照本领域已知的方式转化成相应的式32-(1，3-二噁烷-4-基)乙酸，其中X，R1和R2如上定义，R3代表具有1-12个碳原子的烷基，具有6-12个碳原子的芳基或具有7-12个碳原子的芳烷基优选将2-(1，3-二噁烷-4-基)乙酸的盐转化成相应的2-(1，3-二噁烷-4-基)乙酸叔丁酯其中R3代表具1-12个碳原子的烷基，具6-12个碳原子的芳基或具7-12个碳原子的芳烷基的式32-(1，3-二噁烷-4-基)乙酸衍生物，通过转化成其中X＝酰氧基(例如乙酰氧基)和R1，R2和R3如上定义的式3化合物，继而用公知方法用羟基置换酰氧基而可以转化相应的式52-(6-羟甲基-1，3-二噁烷-4-基)乙酸的乙酸衍生物，其中R1，R2和R3如上定义，例如如UA-A-5594153或WO-A-200008011中所描述 借助酸或碱，还可以将其中X如上定义的式2 4-羟基-四氢吡喃-2-酮 转化成相应的式6二羟基己酸 式6二羟基己酸随后在例如适当缩醛化剂和酸催化剂存在下可以转化成式3的2-(1，3-二噁烷-4-基)乙酸衍生物，其中X，R1，R2如上定义，且R3代表具1-12个碳原子的烷基，具6-12个碳原子的芳基或具7-12个碳原子的芳烷基本发明以实施例为基础加以说明，但并受其限制实施例制备与测定方法1.制备大量用作GC分析用参比物质的6-氯-2，4，6-三脱氧己糖10℃下，向0.62L 100mM NaHCO3溶液中加入76mL(0.60摩尔)50％氯乙醛溶液和84mL(1.47摩尔)乙醛，之后将pH用4N NaOH调至pH7.0加入220g酶溶液(2050U/g)启动酶促反应搅拌约18小时后，利用GC测定形成6-氯-2，4，6-三脱氧己糖的最大转化率加入1.7L丙酮终止反应向此混合物中加入4g硅藻土，搅拌大约30分钟后过滤混合物40℃真空蒸发滤液5小时将所得油体上硅胶柱(400mL)进行柱层析，以由体积比为1∶2的石油醚(沸点40-70℃)与乙酸乙酯的混合物组成的洗脱剂洗脱蒸发Rf值为0.33的馏分之后分离出总计26g的6-氯-2，4，6-三脱氧己糖术语馏分的Rf值是本领域技术人员公知的，定义为馏分在柱内移动的距离除以流动溶剂在柱内移动的距离，或者定义为馏分在柱内移动特定距离需要的时间除以流动溶剂在柱内移动相同距离需要的时间6-氯-2，4，6-三脱氧己糖的纯度按照P.P.Lankhoust在Pharmacopeial Forum，22，(3)，2414-2422中描述的方法利用1H-NMR测定2.GC分析利用气相色谱分析测定酶促反应过程中6-氯-2，4，6-三脱氧己糖的浓度使用带有HP5890 II型系列火焰电离检测器的HewlettPackard GC，其中装备有Chrompack CP-Sil 5 CB柱(25m*0.25mm，df 1.2μm)以具有已知化学纯度(1)的6-氯-2，4，6-三脱氧己糖在丙酮中的校准曲线为基准测定浓度3.制备DERA溶液用标准技术在重组大肠杆菌细胞中超表达DERA酶这种技术记载在Sambrook等的“Molecular CloningA Laboratory Manual”中(Cold Spring Harbor，N.Y.，1989.)在这种情况下，大肠杆菌W3110的deoC基因在市售表达载体pBADMyc-HisB(Invitrogen，Groningen，NL)中克隆基因(包括终止密码子)利用聚合酶链反应扩增，并且以能使deoC的ATG起始密码子等同于载体Ncol位点上ATG密码子(翻译融合)的方式引入载体的Ncol和EcoRI位点内由于deoC终止密码子也被克隆，从而防止带有His尾端的融合蛋白的形成，这种融合蛋白也克隆在载体上在10L通气、搅拌的槽反应器中，在含100μg/mL羧苄青霉素的复合Luria Bertani培养基上培养具有产生的质粒pBADDERA2.2的大肠杆菌DHl0B细胞(Life Technologies，Breda，NL)，并通过加入阿拉伯糖至0.01％进行诱导为增高细胞密度，在细胞完全耗尽LB培养基之后加入两份含纯甘油(补料1)与13％酵母提取物和1.3％胰蛋白胨(Difco，Michigan，US)(补料2)的外加水溶液用这种方法由10L培养物获得大约350g湿细胞，离心回收，之后将它们再悬浮在pH7.2的磷酸钾缓冲液中，再次离心移去上清液，沉淀物随后置-20℃贮存文献中描述了纯化重组E.Coli细胞的DERA的不同方法，例如见Chen等，J.Am.Chem.Soc.Vol.114，1992，741-748和Wong等，J.Am.Chem.Soc.Vol.117，1995，3333-3339)但是，纯化不是醇醛缩合反应中有效使用DERA的条件，参见例如Wong等，J.Am.Chem.Soc.Vol.117，1995，3333-3339对于DERA的部分纯化，应用标准技术将冷冻沉淀物悬浮在100mM pH7.2的磷酸钾缓冲液中(1份重量湿细胞和2份重量缓冲液)，之后通过连续超声波处理破坏细胞壁离心得到清亮粗萃取物，可以直接使用或置-20℃贮存如果需要，溶液可以进一步通过超滤法浓缩，例如使用具10,000 Dalton截止值(cut-off value)的Millipore超滤膜(Millipore，Bedford，USA)用本发明方法获得的典型比活度为每g溶液1400-5300单位4.DERA活性的测定将合成DERA的重组大肠杆菌细胞在50mM磷酸钾缓冲液中进行超声处理，离心(18,500rpm，30min.)除去细胞物稀释所得游离细胞萃取物，用于联动分光光度法试验在该试验中，2-脱氧核糖-5-磷酸转化成D-甘油醛-3-磷酸和乙醛，随后D-甘油醛-3-磷酸在丙糖磷酸异构酶(TIM，EC 5.3.1.1)存在下转化成二羟丙酮磷酸二羟丙酮磷酸然后在甘油磷酸脱氢酶(GDH，EC 1.1.1.8)存在下转化成甘油-3-磷酸在最后步骤中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸以还原型(NADH)形式消耗，这可以通过用分光光度法测定340nm处的吸收减弱进行监测典型地，使用的总体积为3ml，其中包含2878.5μM的50mM三乙醇胺缓冲液(pH7.2)，30μl的12mM NADH水溶液，11.5μL含30单位GDH和500单位TIM在3.2M磷酸铵水溶液中的酶混悬液，以及30μL的50mM 2-脱氧核糖-5-磷酸水溶液反应通过加入50μl游离细胞萃取物启动温度37℃根据340nm处吸收作用的线性减弱计算活性，以U(单位)表示，其中1单位活性等于37℃每分钟转化1μmole 2-脱氧核糖-5-磷酸的酶促活性实施例I用分批试验制备6-氯-2，4，6-三脱氧己糖在4℃下，向37mL 100mM的NaHCO3缓冲液中加入4.3mL(0.03摩尔)45％的氯乙醛溶液和3.4mL(0.06摩尔)乙醛该混合物的pH为7.3加入6.3mL(5270U/g)酶溶液启动反应反应在恒定pH(7.5)下进行混合物定期用GC分析在6-氯-2，4，6-三脱氧己糖的浓度达到大约80g/L(8质量％)之后加100mL丙酮终止反应实施例II用重复分批试验制备6-氯-2，4，6-三脱氧己糖重复实施例I的试验但是在6-氯-2，4，6-三脱氧己糖的浓度达到大约80g/L之后，再加入另一份4.3mL(0.03摩尔)45％的氯乙醛溶液、3.4mL(0.06摩尔)乙醛和6.3mL(5270U/g)酶溶液再重复该过程三次，每次之后转化都达到恒定值，不会进一步增高这样总计加入0.15摩尔45％氯乙醛溶液和0.30摩尔乙醛反应在恒定pH(7.5)下进行利用GC分析反应混合物样品最终的6-氯-2，4，6-三脱氧己糖浓度大约为240g/L(24质量％)实施例III通过计量加反应组分制备6-氯-2，4，6-三脱氧己糖将84g(1.0摩尔)NaHCO3加到6.2L软化水中，之后冷却溶液到大约2℃随后向该溶液中加入72.3mL(0.4摩尔)45％的氯乙醛溶液，利用32％的HCl调节溶液的pH至7.3向该混合物中加入酶溶液(6.8×106U)，之后补偿体积至7.5L在2小时内向该混合物中计量加入总计1.3L(9.5摩尔)45％氯乙醛溶液和0.9L(9.9摩尔)50％乙醛溶液随后在5小时内加入0.86L(9.5摩尔)50％乙醛溶液在2℃和恒定pH(7.5)下搅拌反应混合物过夜反应混合物的总重量共计10.9kg利用气相色谱法测定6-氯-2，4，6-三脱氧己糖的含量，发现为126g/L(12.6质量％)实施例IV通过计量加反应组分制备6-氯-2，4，6-三脱氧己糖将11.8g(0.14摩尔)NaHCO3加到0.44L软化水中，之后冷却溶液到大约2℃随后向该溶液中加入10.0mL(0.07摩尔)45％的氯乙醛溶液，利用32％的HCl调节溶液的pH至7.3向该混合物中加入酶溶液(1.03×106U)在2小时内向该混合物中计量加入0.193L(1.35摩尔)45％氯乙醛溶液和0.127L(1.40摩尔)50％乙醛溶液随后在5小时内加入0.134L(1.46摩尔)50％乙醛溶液在2℃和恒定pH(7.5)下搅拌反应混合物过夜利用气相色谱法测定6-氯-2，4，6-三脱氧己糖的含量，发现为180g/L(18.0质量％)