专利名称：一种利用香菇液体发酵生产漆酶的方法漆酶(Laccase,P-diphenol oxidase, EC I. 10. 3. 2)是一类结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，存在菇、菌及植物中，其中以担子菌中的白腐菌中分布最为广泛。漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物是水，是一种环保型酵素。由于环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶国内外 研究较热。真菌漆酶一般含有4个铜离子，其氧化还原电位比昆虫和植物漆酶高，可以氧化多种酚类、芳胺类、羧酸类、留体激素与生物色素、金属有机化合物和一些非酚类底物，在废水处理、纸浆漂白、土壤净化、染料脱色、免疫检测等诸多现代工业领域里都能广泛应用。香燕(Lentinula edodes)又名香蕈,属担子菌纲,伞菌目，蘑菇科，皮裥属，学名香皮裥菌，在我国已有悠久的生产栽培历史。我国是全球最大的香菇生产国，目前在我国70%以上的省份均有栽培香菇，因此香菇具有价格低、产地多、易于培养的特点。香菇作为一种白腐真菌已被证明可以产生漆酶，而且其中包括多种同工酶，合称为总漆酶，且其酶的氧化还原活力比昆虫漆酶、植物漆酶都要高出很多。相比直接从香菇子实体中提取，低成本、高效的液体发酵技术是目前工业化发酵生产的发展方向，然而当前相关香菇发酵生产漆酶的研究很少，而且与香菇其它活性成分的发酵提取生产相比，其漆酶的产量仍然偏低，同时酶活性受到培养条件和基质成分等诸多因素的制约。已有报道利用芳香类化合物或重金属离子诱导提高产量，但是这些诱导物一般都具有毒性，且难于降解，添加后使发酵液处理成本增高，还易造成环境污染。利用液体静置培养或固态发酵技术能够缓解漆酶生产的环境污染问题，但发酵周期太长，不适合工业化发酵生产应用。如中国专利文献CN1463578A(申请号02124094)，公开了一种香菇液体菌种的深层发酵培养方法及其培养基涉及菌种深层发酵培养方法及其培养基。该培养方法包括(I)将母种在母种培养基内进行培养；(2)将在母种培养基内培养长满试管的菌丝移种到木屑原种培养基内进行过渡培养，培养条件为 温度22 27± 1°C，暗培养12 20天，待菌丝长满，(3)将木屑菌种充分打碎后立即移种到液体培养基中进行一级摇瓶的培养扩增；(4)将一级摇瓶内生长5 7天的菌液移入盛有新鲜液体培养基的二级摇瓶中进行扩增；(5)将二级摇瓶出来的菌液进行发酵处理即可得到成品香菇液体菌种。其它一些利用漆酶基因的异源表达的产量往往也低于野生菌。因此，这些都限制了目前漆酶的工业化生产应用，急需开发一种新的能够提高漆酶产率、降低生产成本的制备方法和生产工艺以满足现代工业化的需要。近年来在植物细胞壁中发现一类称为扩张蛋白的新蛋白种类。研究表明，扩张蛋白在植物形态建成(Fleming et al. , 1999)、果实成熟(Cosgrove, 2000)、根毛发生(Choand Cosgrove, 2002)、细胞扩张(Cosgrove, 1998)、渗透调节(Wu and Cosgrove, 2000)和禾本科植物花粉管生长(Cosgrove，1997)等诸多方面均起着极为重要的作用。在拟南芥、番茄、草莓、棉花、水稻和玉米等多种植物中均已发现扩张蛋白，被认为其普遍存在于各种双子叶和单子叶植物的细胞壁中。试验证明这种植物细胞壁蛋白有使热钝化的离体细胞壁恢复伸展的功能，推测其能够打断细胞壁多聚物之间的氢键进而调节酸依赖的细胞壁延展和压力松弛等生理活动，可能在植物生长过程中起生理调控和细胞壁延伸等调控作用。然而，关于扩张蛋白的作用机制目前仍未有明确定论，将扩张蛋白应用于香菇的液体发酵进行漆酶等次生代谢产物的生产国内外目前均未见报道。
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用香菇液体发酵生产漆酶的方法。本发明技术方案如下 —种利用香菇液体发酵生产漆酶的方法，包括如下步骤(I)将香菇菌种接种到ro液体发酵培养基中，进行活化培养,得种子液；(2)将步骤(I)制得的种子液按5 15%体积比接种于液体发酵培养基中，在温度25 30°C的条件下，液体发酵培养I 5天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为I. 0 3. Omg/mL，然后继续培养4 8天，分离，取上清液，得到发酵液；(3)从步骤(2)制得的发酵液中提取漆酶。根据本发明优选的，所述步骤(I)中的ro液体发酵培养基，每升组分如下去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，蒸馏水定容至lOOOmL。根据本发明优选的，所述步骤(I)中的活化培养条件为摇床转速100 ISOr/min,温度25 30°C,时间3 6天。根据本发明优选的，所述步骤(2)中的液体发酵培养基，每升组分如下玉米粉IOOg,麸皮 IOOg,鹿糖 20g,白糖 IOg,蛋白胨 2g, MgSO4 7H20 0. 5g,KH2PO4O. 5g，水定容至 1000ml, pH 5. 0 7. 0。根据本发明优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为I. 5 3. Omg/mL ;进一步优选2. 0 3. Omg/mL。最优选的,所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为2. 5mg/mL。所述步骤(2)中的扩张蛋白溶液可参照现有技术制备,如采用McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins thatinduce cell wall extension in plants. Plant Cell, 1992,4 :1425 1433 中的记载的方法制备；也可以按照如下方法制备扩张蛋白溶液将大豆或黄瓜种子经0. 05 0. 15wt % HgCl2消毒4 6min,流水冲洗5 7h,然后，25 28°C暗培养4 6天；剪取幼苗下胚轴顶端3 4cm，置_20°C预冷0. 5h，加预冷至4°C的匀浆缓冲液，匀浆后，用孔径70 y m的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置I 3h，得静置液；向静置液中加入提取液，4°C下提取44 50h，过滤，按0. 3 0. 5g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH4) 2S04,添加(NH4) 2S04过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置25 30h，4°C条件下25000g离心5 IOmin,沉淀用酸性缓冲液复溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析,透析液经20000g离心lOmin，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。上述扩张蛋白溶液制备方法中，所述匀浆缓冲液组分为25mmol/L HEPES(4_羟乙基哌嗪乙横酸)，I. 5mmol/L Na2S2O5, 2mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，0. Iwt Tritonx-100, pH 7. O ;所述提取液组分为15mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，I. Ommol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，I. 5mmol/LNa2S205,0. 5mol/L NaCl, pH 6. 0 ;所述酸性缓冲液配制是将 2.05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4. 0，水定容至1L。根据本发明优选的，步骤(2)中所述的分离是将发酵液经4 6层纱布过滤，4°C、8000r/min 离心 15min。所述步骤(3)中，从发酵液中提取漆酶的步骤如下向步骤⑵制得的发酵液中0 4°C下按0. 3 0. 5g/mL的添加量向发酵液中缓慢添加研磨后的(NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，4°C沉淀6 8h，于4°C IOOOOrpm离心20min，弃上清液，将沉淀溶解于磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液中；4°C用截留分子量为10 20kDa的透析袋透析，然后4°C条件下用截留分子量为10 20kDa的透析膜进行超滤浓缩，除去小分子的蛋白质，即得香菇漆酶酶液。所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制方法是将0. 69g磷酸二氢钠、0. 012g柠檬酸溶于蒸馏水中，定容至lL，pH 8.0。本发明同现有技术相比有如下优点I.本发明将植物扩张蛋白和优化后的发酵方法应用于香菇漆酶的液体发酵生产，大幅度提高了香菇漆酶的液体发酵产量，使产量达到17. 41U/mL，相比传统发酵生产方法提高了 3. 2倍以上，具有极好的工业化应用前景。2.本发明所采用的香菇液体发酵工艺简单，环保无毒，原材料成本低廉，整个发酵过程可控，不受外部环境条件限制，非常适合工业规模化发酵罐培养生产。本方法也适用于其它普通香菇栽培品种3.本发明所述的植物扩张蛋白可从大多数双子叶和单子叶植物等多种物种中提取，来源相当广泛，成本较低，制备方法也相对简单，重复性好，可工业化规模提取。取由IL发酵液制得的漆酶，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至50mL，制得漆酶待测样品。漆酶的含量测定(2)标准曲线的建立采用本领域常规的BCA法，具体参见(《蛋白质技术手册》，ISBN : 7-03-008329-6，出版日期2000)(I)标准曲线建立将牛血清蛋白标准液(0.5g/L)0. OmL,0. ImL,0. 2mL，0. 3mL，0. 4mL，0. 5mL，0. 6mL,依次加入 0. 15mol/L NaCl 溶液 I. OmT,, 0. 9mL, 0. 8mL, 0. 7mL, 0. 6mL, 0. 5mL, 0. 4mL,再在每支管中加入5mL的0. 01% (W/V)考马斯亮蓝。465nm进行测定OD值，绘制标准曲线。(I)漆酶的产量测定取制得的制得的漆酶待测样品IOii L试管中，用0. 15mol/L NaCl溶液定容至1.OmL，摇匀。空白对照为I. OmL 0. 15mol/L NaCl溶液。再加入5mL加入0. 01wt% (W/V)考马斯亮蓝。465nm进行测定OD值。根据标准曲线计算蛋白含量测得蛋白含量为0. 234g/L，得到漆酶发酵液每升粗漆酶总蛋白含量为0. 234X100/20 = I. Hg.(2)漆酶的活力测定采用本领域常规的愈创木酚法测定(具体参照张玉荣等影响愈创木酚法测定玉米过氧化物酶活力的因素，粮食工程.2008 4 7)发酵液漆酶总酶活将ImL琥珀酸钠缓冲液，ImL 4mM愈创木酚和0. 5mL漆酶待测样品混合，制得2.5mL反应混合液，然后30°C反应30min后，用紫外可见分光光度计于465nm处测定吸光值，用0. 5ml磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液替代漆酶待测样品与ImL琥珀酸钠缓冲液和ImL4mM愈创木酚混合做对照。所述酶活力单位定义每分钟使OD465值改变0. 01为一个酶活单位(U)。经检测，漆酶待测样品总酶活为85. IU。得到每毫升粗漆酶发酵液总酶活为85. 1X2/20 = 8.51U。(测得值X2得Iml酶活的活力，再除以发酵液浓缩的倍数)，具体结果如表I所示。实施例2 如实施例I所述的方法，不同之处在于，步骤(2)中，在温度25°C的条件下，液体发酵培养3天，然后加入扩张蛋白溶液,使扩张蛋白的浓度为2. Omg/mL,然后继续培养6天。经检测计算，465nm比色法测定得到漆酶发酵液每升粗漆酶总蛋白含量为I. 52g，每毫升发酵液粗漆酶总酶活10. 33U。具体结果如表I所示。实施例3如实施例I所述的方法，不同之处在于，步骤(2)中，在温度25°C的条件下，液体发酵培养5天，然后加入扩张蛋白溶液,使扩张蛋白的浓度为2. 5mg/mL,然后继续培养4天。经检测计算，465nm比色法测定得到漆酶发酵液每升粗漆酶总蛋白含量为2. 82g，每毫升发酵液粗漆酶总酶活17. 41U。具体结果如表I所示。对比例I : 如实施例I所述的方法，不同之处在于，步骤(2)中，将步骤(I)制得种子液按10%体积比接种于液体发酵培养基中，在温度25°C的条件下，液体发酵培养9天，过滤得发酵液。经检测计算，465nm比色法测定得到漆酶发酵液每升粗漆酶总蛋白含量为0. 71g，每毫升发酵液粗漆酶总酶活4. 07U。具体结果如表I所示。表I.不同实施例的香燕漆酶产量比较


本发明涉及一种利用香菇液体发酵生产漆酶的方法，包括如下步骤(1)将香菇菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，得种子液；(2)将种子液按5～15％体积比接种于液体发酵培养基中，液体发酵培养1～5天，加入扩张蛋白溶液，然后继续培养4～8天，分离，取上清液，得到发酵液；(3)从发酵液中提取漆酶。本发明将植物扩张蛋白和优化后的发酵方法应用于香菇漆酶的液体发酵生产，大幅度提高了香菇漆酶的液体发酵产量，相比传统发酵生产方法提高了32倍以上，具有极好的工业化应用前景。