植物土传病害尖孢镰刀菌快速鉴定的引物及方法 【技术领域】 [0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及植物土传病害尖孢镰刀菌快速鉴定方法。 [0002]尖孢镰刀菌是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花丼等100多种植物枯萎病的发生。 [0003]现目前，从土传病害中鉴定尖孢镰刀菌需要首先将感病植株的根部组织进行消毒处理和病原菌分离，在获得纯化菌株后，再进行室内离体培养和形态鉴定；在不产孢或无法确定时，还需要将分离菌株进行测序、比对，才能够鉴定出尖孢镰刀菌，其操作方法复杂，准确性不高。

[0004]本发明的目的主要是提供一种快速鉴定尖孢镰刀菌的方法，解决了现有鉴定方法操作复杂，准确性不高的问题。
[0005]本发明通过下述技术方案实现:
植物土传病害尖孢镰刀菌快速鉴定的引物，
其中，上游引物序列:5’-CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG-3’ ；
下游引物序列:5’-GACGGATTTGGCGAACCTACCCT-3’。
[0006]植物土传病害尖孢镰刀菌快速鉴定方法，包括以下步骤:
(1)合成以下引物，
上游引物序列:5’-CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG-3’ ；
下游引物序列:5’-GACGGATTTGGCGAACCTACCCT-3’ ；
(2)制备土传病害真菌的DNA稀释液；
(3)配制PCR反应体系；
(4)常规PCR检测。
[0007]进一步地，步骤(I)中合成的引物的浓度均为10Mmol/l，步骤(2)中制备的DNA稀释液的浓度为50ng/^l。
[0008]再进一步地，步骤(3)中所述的配制PCR反应体系，包括以下组分:
Taq Mix10μ1
上游引物2μ1
下游引物2μ1
DNA稀释液?μ?
ddH205μ1。
[0009]更进一步地，所述PCR反应条件为:94°C预变性3min，94°C变性30s，65 °C退火30s，72°C延伸 lmin，35 个循环；72°C终止 1min0
[0010]本发明具有以下优点及有益效果: (I)本发明打破了传统的鉴定方法，使得鉴定过程相当简单，无需进行形态鉴定和DNA测序，即可确定尖孢镰刀菌。
[0011](2)本发明扩增效率高、特异性强、准确度高。




[0012]图1为本发明尖孢镰刀菌特异引物PCR后特异条带图。
[0013]图2为本发明采用三种不同引物PCR后的对比图。


[0014]下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。实施例
[0015]转基因玉米98140结构特异定量PCR精准检测方法，在检测pin II终止子与zm-hra gene相连位置核酸片段时，步骤如下:
植物土传病害尖孢镰刀菌快速鉴定方法，包括以下步骤:
(I)合成以下引物，
上游引物序列:5’-CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG-3’ ；
下游引物序列:5’-GACGGATTTGGCGAACCTACCCT-3’。
[0016]本实施例引物的合成浓度均为10Mmol/l。
[0017]以上引物的核苷酸序列是针对尖孢镰刀菌设计；通过该设计就可以精准鉴定出尖孢镰刀菌。
[0018](2)制备土传病害真菌的DNA稀释液；即采用常规的DNA提取手段，从土传病害真菌中提取出浓度为50ng/^l的DNA稀释液。
[0019](3)配制PCR反应体系；即将制备好的DNA稀释液加入20μ1反应体系中即可。
[0020]以上20μ1反应体系包括以下组分:
Taq Mix10μ1
上游引物2μ1
下游引物2μ1
DNA稀释液?μ?
ddH205μ1。
[0021](4)常规 PCR 检测。
[0022]根据上述PCR反应体系，在以下PCR反应条件下对产物进行扩增并检测，所述PCR反应条件为:94°C预变性3min，94°C变性30s，65 °C退火30s，72 °C延伸lmin，35个循环；72°C终止lOmin。本实施例中采用的是常规的B1-RAD PCR仪。
[0023]扩增后电泳条带为1080bp，序列如下: CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGGTCGATCTGGAGGTCGATTCTCCGGCTGGCGGATCTGACACTGTCGAAA
CGAGATGCGGGCGGTGTAGGGTAGGCTAGTTTCGTCCTCGCCAGGTTGCGATTTGGACGAGATATGTGGTCTAGGG
TATGCTCTAGGGTAAGTAGAATTCGAGTTCCGTCGCCGACAGTTTTCTGTGGGTGTATGGTAGGTACAGGGTAGGCA
GATCTCTCTCCGGCCAGTACTTGTCTGGTGGTCGTGAGTCGATTTTTTTGTTTTGCCATACTATTGAATTTTGCGGAAATTCAAAAGTGGCTCGGGAGTCCCGCCTGGCGTGCGTCCGACTCGAACATCGTCGGTGTACATATGAGAGGGAGTAATCCGGCCCGGTCGGGGCCCATCGCGAGCTGCCGGGTAGGTAAAAGTAAAAAAGTTGTTAAGAGGCGCGGTGTCGGCGTGCTTGTATTTGCGGGAGAGAATTATCTGGGGGTGCTGGGTAGCCGGGAAGACTTGGACGGATCTGGCCCGGGAATGGGTCTGGGCCTGGATTCTGGTGTGGTGTAGGGTAGGCGTAGATAGATGAGTGGTCTAGGGTAGATACAGGGTAGCCAGACGTCTGGTATATAGTATGGGGGT.GTAGGGTAGGTCTGGACACCGTTTTCCACTTCGCCCTTCCCTTTAGTCGAGGGAGGACGATCTTGGCTGGGACGGAGGTGTAGGGTAGGCTTAACTTACGATTACATGATCTGTGTCACTCTAGGGTAGGTGAAAATCCCATATATGTATGATCACATTTGGTGAAGAGGTGGTTTGGCTGGTGAGATGGACAAAAGTGCAATATAGAATTATATGTGATTTTGCAAAAGTGGGTGTGAAATTGGGAAATCGGTTTTCCCGCACAGATGAGAGCACGTTTGAGGTTCCATGAGATGCACCTCTCCGAGACGACCTCAACGGTACCACCCATGTGTTGGTCGGGCTCCTGTGCGGCCGTCCAGGGCGGGATAAGTAGAGAATGTGGTGGTGTAGGGTAGGTGACCAGGTCCAGGGTAGGTTCGCCAAATCCGTCAATCCGGCTTGA 。
[0024]如图1 所示，从左至右依次为 Marker、2、3、4、5、l、plus2、plus4、9、Marker、19、23、24、25、26、27、28、31、Marker、33、GDC3、GS1、YB3、YB 1、GG2、GS2、GS3，Marker 条带之上而下为 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp。其中 5、plus2、plus4、19、28、GS1、GG2 为阳性，即为尖孢镰刀菌。
[0025]对本发明的序列进行试验对比:
发明人采用本发明的引物、FO-EFla引物、FO-RBPl引物对菌株中的尖孢镰刀菌进行鉴定，结果如图2所示，图2中左边是采用本发明的引物PCR六个菌株，其中前三个和最后一个是尖孢，第4、5泳道是木贼、赤霉；图2中间是采用FO-EFI a引物PCR八个菌株，其中前四个和最后一个是尖孢，第5、6、7道分别是腐皮镰刀菌、木贼镰刀菌、赤霉镰刀菌；图2右边采用FO-RBPl引物PCR八个菌株，其中前四个和最后一个是尖孢，第5、6、7分别是腐皮镰刀菌、木贼镰刀菌、赤霉镰刀菌。值得说明的是每组中间均留有一个泳道。
[0026]从图中可以看出，用本发明的引物能特异性的从菌株中鉴定出尖孢镰刀菌，特异性条带在IlOObp左右；而FO-EFla引物PCR虽也能得到特异性条带，但是该引物不能区分赤霉镰刀菌和尖孢镰刀菌，FO-RBPl则特异性更差。
[0027]由以上检测结果可得知，本发明的扩增效率高、准确度高、特异性强。