一种均相制备低脱乙酰度羟丙基改性甲壳素的方法[0002]甲壳素是仅次于纤维素的第二大可再生天然高分子，具有线性结构。甲壳素及其衍生物具有非常好的生物相容性、生物可降解性、低毒性和多种生物活性，具有极大的研究和应用价值。一般条件下，甲壳素本身由于氢键作用结晶度高，很难在水和低浓度的酸碱溶液中溶解，也不易溶于常用的有机溶剂，从而限制了它的研究开发和应用。[0003]甲壳素与羧基化试剂在氢氧化钠-尿素体系中反应，可制得具有pH敏感性和温敏性的羧基甲壳素，中国发明专利申请公开说明书CN201310641249.6中报道了一种均相制备低脱乙酰度羧基甲壳素的方法。甲壳素与羟乙基化试剂(主要为氯乙醇和环氧乙烷)反应后，可制得易溶于水的羟乙基甲壳素[一种水溶性羟乙基甲壳素的制备方法，中国专利申请公开说明书CN200610116655.0]。侯春林等报道了温敏性羟丁基壳聚糖[中国专利申请公开说明书CN200810033699.6]和温敏性羟戊基壳聚糖[中国专利申请公开说明书CN201210220246.0]的制备及其在临床应用研究[周霖，温敏性羟丁基几丁糖作为防治脑脊液漏材料的基础与临床研究，2012，第二军医大学长征医院硕士学位论文]。但羟丙基改性甲壳素特别是低脱乙酰度羟丙基甲壳素的制备报道很少，王爱勤等报道了水溶性羟丙基甲壳素在人工泪液中的应用[王爱勤等，甲壳质的改性及其在人工泪液中的应用，中国海洋药物，1997，16，14-17],但该改性甲壳素的脱乙酰度较高达0.4，且是在异丙醇非均相介质内进行反应，反应过程难以控制。
[0004]本发明针对现有制备羟丙基甲壳素技术的局限性，提供一种工艺简单的均相制备低脱乙酰度羟丙基改性甲壳素的方法:反应介质使用较低碱浓度和不用有机溶剂，反应条件温和，有利于大规模工业化生产；甲壳素基本上未降解，甲壳素的乙酰度降低小，产品取代度分布均一易控，产率高。[0005]本发明提供的技术方案如下: 一种均相制备低脱乙酰度羟丙基改性甲壳素的方法，包括如下步骤: 将脱乙酰度低于25%的甲壳素制备成0.5 wt%~8wt%的均相甲壳素水溶液，在均相甲壳素水溶液中加入羟丙基化试剂，所述的羟丙基化试剂的加入量为甲壳素结构单元摩尔数的I~40倍，在O~50°C下搅拌均相反应10~105小时，反应液经后处理得到脱乙酰度低于30%的羟丙基改性甲壳素。
[0006]所述的甲壳素优选为脱乙酰度低于10%的粉状甲壳素，其重均分子量优选为5X IO4 ~5X106。
[0007]所述的羟丙基化试剂优选为环氧丙环、氯丙醇、溴丙醇或其任意混合物。所述的后处理方法为:将反应液用酸溶液调节PH值至6.9^7.6，用有机溶剂沉淀产物后洗涤或纯水透析的方式，除去尿素和盐等小分子物质，干燥后即得到脱乙酰度低于30%的羟丙基改性甲壳素，甚至能得到脱乙酰度低于20%的羟丙基改性甲壳素。
[0008]所述的酸优选为盐酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸、柠檬酸中的一种或几种。
[0009]所述的有机溶剂优选为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃中的一种或几种。
[0010]所述的均相甲壳素水溶液的制备方法，包括以下步骤:首先制备质量比为可溶性碱:尿素:纯水=6~20:3^12:68^91的混合液；将脱乙酰度低于25%的甲壳素溶解于上述混合液中，混合均匀后在-30~-12°C下放置24~96小时，解冻后于I~25°C下充分搅拌均匀，制得均相甲壳素水溶液。
[0011]所述的可溶性碱为氢氧化钠、氢氧化钾和/或氢氧化锂。
[0012]上述方法可制得具有温度敏感性的低脱乙酰度羟丙基改性甲壳素。
[0013]上述方法可制得脱乙酰度小于15%的羟丙基改性甲壳素。
[0014]一种由上述方法制备得到的具有温度敏感性的低脱乙酰度羟丙基甲壳素。
[0015]上述方法制备得到的羟丙基改性甲壳素作为人工泪液、可注射水凝胶和药物载体材料的应用。
[0016]本发明方法可制得温度敏感性的低脱乙酰度羟丙基改性甲壳素，其脱乙酰度可以小于15%。本发明制得的低脱乙酰度羟丙基改性甲壳素可作为人工泪液、可注射水凝胶和药物载体材料的应用；由于其价廉可生物降解，可广泛用于其它医药保健和食品加工等领域，具有较高的应用开发价值。本发明的反应介质是使用较低碱浓度的可溶性碱和尿素的混合水溶液，不用有机溶剂，反应条件均相温和，对甲壳素分子的破坏小，产品取代度分布均一易控，产率高，有利于大规模工业化生产。
[0017]与现有技术相比，本发明具有显著的技术进步和特点:
第一，本发明在甲壳素的均相水溶液中制备低脱乙酰度羟丙基化甲壳素，制备工艺简单，反应条件温和，反应过程易控，产率高，可用于大规模工业化生产；
第二，本发明采用较低浓度的碱液(6~20wt%)作为反应介质，反应过程不涉及有机溶剂，无毒无污染，成本较低；
第三，本发明反应过程中甲壳素基本上未降解，甲壳素的乙酰度降低小，产品的羟丙基取代度均匀。



[0018]图1为本发明实施例1用环氧丙烷作为羟丙基化试剂得到的羟丙基改性甲壳素在25°C下10 wt% DC1/D20的核磁氢谱图。
[0019]图2为本发明实施例9用溴丙醇为羟丙基化试剂在不同反应时间合成的羟丙基改性甲壳素在25°C下20 wt% DC1/D20的核磁氢谱图。
[0020]图3为本发明实施例10中羟丙基改性甲壳素HPCH-8 (溶液浓度2 wt%, pH 7.4)在升温和降温时流变行为测试图。
[0021]图4为本发明实施例10中在37°C下羟丙基改性甲壳素HPCH-8不同浓度溶液(Iwt9T3 wt%, pH 7.4)存储模量和损耗模量随时间的变化图。
[0022]下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0023]实施例1
首先制备氢氧化钠:尿素:纯水=11:4:85 (质量比)的混合液；将2.0克甲壳素(脱乙酰度低于25%)溶解于100克的上述混合液中，混合均匀后在_30°C下放置24小时，解冻后于2~5°C下充分搅拌均匀，制得2wt%的均相甲壳素水溶液；向均相甲壳素水溶液中加入
11.4克环氧丙烷作为羟丙基化试剂，温度控制在4~6°C搅拌反应24小时，再将温度升高至9~11°C搅拌反应，反应液在反应6、12和24小时时分别取样，取得的样品液分别用IM的盐酸溶液调节PH值至7.0，得到均匀透明溶液；然后用蒸馏水透析7天，除去溶液中的尿素和盐等小分子物质，冷冻干燥得到海绵粉末状的羟丙基改性甲壳素。反应6、12和24小时得到的三个产品分别记为HPCH-7、HPCH-8和HPCH-9，其反应收率分别为87%、91%和87%，其核磁氢谱图如图1所示。由图1可知，所得的产物改性甲壳素中引入了羟丙基，且这些产物具有较高的乙酰度(>85%)，通过核磁氢谱计算得到:HPCH-7的乙酰度DA为0.92，其羟丙基摩尔取代度MS为0.53 ；HPCH-8的乙酰度DA为0.89，其羟丙基摩尔取代度MS为0.77 ;HPCH-9的乙酰度DA为0.87，其羟丙基摩尔取代度MS为0.80。
[0024]实施例2
首先制备氢氧化钠:尿素:纯水=11:4:85(质量比)的混合液；然后将2.0克甲壳素(脱乙酰度低于25%)溶解于 100克的上述混合液中，混合均匀后在_30°C下放置24小时，解冻后于2~5°C下充分搅拌均匀，制得2wt%的均相甲壳素水溶液；向均相甲壳素水溶液中加AU.4克环氧丙烷作为羟丙基化试剂，温度控制在4~6°C搅拌反应24小时，再将温度升高至14~16°C搅拌反应，反应在6和12小时时分别对反应液进行取样，反应液为均相透明体系，取得的样品溶液用IM的盐酸溶液将pH值调节至7.5，然后加入1.2升丙酮使产物沉淀，过滤后将沉淀用乙醇水溶液(80%，v/v)洗涤，洗去尿素和盐类等小分子物质；接着将沉淀在50°C下烘干，得到粉末状的羟丙基改性甲壳素。反应6和12小时得到的产物都溶解于纯水，这两个产品分别记为HPCH-4和HPCH-5，其收率分别为83%和86%。通过核磁氢谱计算得到:HPCH-4的乙酰度DA为0.90，其羟丙基摩尔取代度MS为0.99 ;HPCH_5的乙酰度DA为0.86，其羟丙基摩尔取代度MS为0.99。
[0025]实施例3不同投料比的影响
首先制备氢氧化钠:尿素:纯水=11:4:85 (质量比)的混合液；然后将3.0克甲壳素(脱乙酰度低于25%)溶解于150克的上述混合液中，混合均匀后在_30°C下放置24h并适时搅拌，解冻后于2~5°C下充分搅拌制备2wt%的均相甲壳素水溶液；将均相甲壳素水溶液分成体积相同的3等份，分别加入不同比例的环氧丙烷(1.43克、2.85克和4.28克)作为羟丙基化试剂，其余操作步骤完全相同；将温度控制在4~6°C搅拌反应24小时，再升高温度在14~16°C下搅拌反应6小时，反应液为均相透明体系；接着用IM的盐酸溶液将反应液的pH值调节至7.2,然后加入0.8升丙酮使反应产物沉淀,过滤后将沉淀用乙醇水溶液(80%，v/v)洗涤，洗去尿素和盐等小分子物质；然后将沉淀在50°C下烘干，得到粉末状的羟丙基改性甲壳素。加入1.43克、2.85克和4.28克环氧丙烷得到的三个产品分别记为HPCH-UHPCH-2和HPCH-3，其收率分别为87%、85%和86%。通过核磁氢谱计算得到:HPCH_1的乙酰度DA为0.89，其羟丙基摩尔取代度MS为0.34 ;HPCH_2的乙酰度DA为0.89，其羟丙基摩尔取代度MS为0.58 ；HPCH-3的乙酰度DA为0.88，其羟丙基摩尔取代度MS为0.83。
[0026]实施例4
首先制备氢氧化钠:尿素:纯水=11:4:85(质量比)的混合液；然后将2.0克甲壳素(脱乙酰度低于25%)溶解于100克的上述混合液中，混合均匀后在_30°C的冰箱冷冻室中放置24小时并适时搅拌，解冻后于2~5°C下充分搅拌，制得2wt%的均相甲壳素水溶液；然后向均相甲壳素水溶液加入0.57克环氧丙烷作为羟丙基化试剂，调节反应温度至4~6°C搅拌反应24小时，再升高温度至14~16°C搅拌反应33小时；然后用IM的盐酸溶液调节反应液的PH值至7.2，得到透明溶液；然后加入2升乙醇水溶液(85%，v/v)使反应产物沉淀，过滤后将沉淀在50°C下烘干，得到粉末状的羟丙基改性甲壳素1.9克。
[0027]除了将在14~16°C下搅拌反应的时间从33小时再延长3天之外，即在14~16°C下搅拌反应的时间为105小时，其余操作步骤完全相同，制得的粉末状羟丙基改性甲壳素完全溶解于纯水。
[0028]实施例5
首先制备氢氧化钠:尿素:纯水=6:3:91 (质量比)的混合液；然后将0.5克甲壳素(脱乙酰度低于25%)溶解于100克的上述混合液中，混合均匀后在-12~-20°C下放置72小时，解冻后于I~12°C下充分搅拌，制得0.5wt%的甲壳素均相溶液；向甲壳素均相溶液中加入5.7克环氧丙烷作为羟丙基化试剂，在O~50°C下(先低温，后慢慢升温，升温过程无需严格控制，整个过程控制反应液为均相体系)搅拌反应10小时，然后用IM的盐酸溶液将反应液的PH值调节至6.9，用蒸馏水透析7天除去反应液中的尿素和盐等小分子物质，冷冻干燥后得到海绵粉末状的水溶性羟丙基改性甲壳素。
[0029]实施例6
首先制备氢氧化钠:尿素:纯水=11:4:85(质量比)的混合液；然后将1.0克甲壳素(脱乙酰度低于25%)溶解于100克的上述混合液中，混合均匀后在_28°C的冰箱冷冻室中放置24小时，并适时搅拌；解冻后于12~25°C下充分搅拌制得lwt%的甲壳素均相溶液；向甲壳素均相溶液中加入5.8克环氧丙烷作为羟丙基化试剂，反应温度控制在8~12°C搅拌反应15小时，再升高温度至18~22°C搅拌反应，控制反应液为均相透明体系；反应液在18~22°C下反应6小时和37小时分别取样，取得的样品溶液用IM的盐酸溶液将pH值调节至
7.4，得到透明溶液；然后加入2升乙醇水溶液(85%，v/v)使反应产物沉淀，过滤后将沉淀在50°C下烘干，得到粉末状的羟丙基改性甲壳素。
[0030]通过核磁氢谱计算得到:反应液在18~22°C下反应6小时得到的羟丙基改性甲壳素乙酰度DA为0.88，其羟丙基摩尔取代度MS为0.44 ;反应液在18~22°C下反应37小时得到羟丙基改性甲壳素乙酰度DA为0.85，其羟丙基摩尔取代度MS为0.55。
[0031]实施例7 首先制备氢氧化钠:尿素:纯水=8:4:88 (质量比)的混合液；然后将1.2克甲壳素溶解于30克的上述混合液中，混合均匀后在_30°C下放置36 h，并适时搅拌；溶液解冻后于2~8°C下充分搅拌均匀，制得4wt%的甲壳素均相溶液；然后向甲壳素均相溶液中加入3.4克环氧丙烷作为羟丙基化试剂，依次在5°C下搅拌反应6小时、8~12°C下搅拌反应12小时、14~16°C下搅拌反应12小时、8~22°C反应12小时、30~40°C反应12小时，控制反应液为均相透明体系；然后用IM的盐酸溶液将反应液的pH值调节至7.6，之后加入IL丙酮使反应产物沉淀，过滤出的沉淀用乙醇水溶液(80%，v/v)洗涤，洗去尿素和盐类等小分子物质；然后将沉淀在50°C下烘干，得到粉末状的水溶性羟丙基改性甲壳素。
[0032]实施例8
首先制备氢氧化钠:尿素:纯水=20:12:68 (质量比)的混合液；然后将8.0克甲壳素溶解于100克的上述混合液中，混合均匀后在-20~-30°C的冰箱冷冻室中放置96小时，并适时搅拌，解冻后于2~5°C下充分搅拌均匀，制得8wt%的甲壳素均相溶液；向甲壳素均相溶液中加入22.8克环氧丙烷作为羟丙基化试剂，在2~20°C下搅拌均相反应48小时，然后用2M的盐酸溶液将反应液pH值调节至7.2，加入大量的乙醇-丙酮混合液(1/1，v/v)使反应产物沉淀3次，以除去其中的尿素和盐等小分子物质；然后将沉淀真空干燥，得到粉末状的水溶性羟丙基改性甲壳素。
[0033]实施例9不同羟丙基化试剂
首先制备氢氧化钠:尿素:纯水=11:4:85 (质量比)的混合液；然后将1.0克甲壳素加入到100克的上述混合水溶液中，混合均匀后在_26°C的冰箱冷冻室中放置24小时，并适时搅拌，解冻后于20°C下充分搅拌制得lwt%的甲壳素均相溶液；向甲壳素均相溶液中加入
6.9克3-溴丙醇作为羟丙基化试剂，再调节反应温度在8~12°C下搅拌反应48、72和84小时分别取样；取得的样品溶液用IM的盐酸溶液调节pH值到中性，得到透明溶液，使用I升乙醇水溶液(85%，v/v)将反应产物沉淀，过滤后将沉淀在50°C下烘干，得到粉末状水溶性羟丙基改性甲壳素，这三个产品的核磁氢谱如图2所示，在8~12°C下搅拌反应48h得到的溴丙醇改性甲壳素的乙酰度DA为0.92，其羟丙基摩尔取代度MS为0.34 ;在8~12°C下搅拌反应72h得到的溴丙醇改性甲壳素的乙酰度DA为0.89，其羟丙基摩尔取代度MS为
0.39 ;在8~12°C下搅拌反应84h得到的溴丙醇改性甲壳素的乙酰度DA为0.89，其羟丙基摩尔取代度MS为0.44。
[0034]同样，其他操作步骤完全相同，采用3-氯丙醇代替3-溴丙醇，其中，3-氯丙醇与甲壳素结构单元的摩尔比为20:1，反应温度为13~17°C，在反应时间为84小时后也制得了水溶性的羟丙基改性甲壳素。
[0035]实施例10温度敏感性
称取100 mg实施例1制得的羟丙基改性甲壳素CHCH-8，加入pH为7.4的0.15 M PBS缓冲盐5 mL完全溶解，使用流变仪测试羟丙基改性甲壳素在升温和降温时其存储模量和损耗模量的变化，升温(降温)速率为0.5°C/min，频率为1Hz，应变5%，结果如图3所示。由图3可知，这种羟丙基改性甲壳素具有温度敏感性，其凝胶化转变温度在升温时为18°C，在生理温度37°C下可快速固化为凝胶状态；其凝胶化转变温度在降温时为11.5°C。所以本发明制得的这类羟丙基改性甲壳素具有温度敏感性，并且是可逆型，可望作为温度敏感性的可注射水凝胶材料使用。羟丙基改性甲壳素的浓度越高，凝胶化转变温度越低，形成的凝胶存储模量越大，如图4所示。由该图可知，在37°C下这些羟丙基改性甲壳素的水溶液均可快速凝胶(小于30秒)。不同摩尔取代度的羟丙基改性甲壳素，不同羟丙基改性甲壳素的浓度，均可形成不同形貌的水凝胶，可用于载药，其释放速度可依据需要进行调节，所以这类羟丙基改性甲壳素可望作为药物载体材料使用。
[0036] 本发明的实施例中氢氧化钠水溶液可用其它可溶性碱溶液如氢氧化钾水溶液、氢氧化锂或者它们的混合液代替，调节pH值的酸可用硫酸、硝酸、甲酸、乙酸或柠檬酸代替盐酸，沉淀所用的溶剂可用甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或四氢呋喃代替丙酮和乙醇水溶液，均不影响本发明的效果。
[0037]以上所述，对本发明的目的、技术方案和有益结果进行了进一步的详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之类，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之 内。