专利名称：香菇新菌株k05、k03及其选育方法目前食用菌的育种方法主要有野生种训化、杂交育种、诱变育种、原生质体融合育种和基因工程育种等多种。野生种训化是从野生子实体中分离获得菌丝体，经栽培试验，筛选获得优良菌株。这种方法需收集并分离获得大量菌株，从中筛选出高产优质的品种，但不能创造新的种性。杂交育种是一种目前应用较多而有效的育种技术，它可组合双亲的优良性状、表现出较强的杂交优势，培育出超越亲本的优良杂交种。但杂交育种是一项耗工耗时的工作，从对育种材料进行遗传分析和亲缘关系分析来确定亲本，再从众多的杂交后代中筛选、鉴定出优良品种的过程不仅需要很长时间，且随机性和盲目性很大。现阶段诱变育种是通过物理和化学的手段，使其染色体结构发生改变，促进变异，再从众多的变异体中筛选出好的品种，这仍然是一种筛选量大和随机性、盲目性很强的育种方法。原生质体融合育种是用于远缘杂交，克服“种间性隔离”的技术，上世纪80年代在食用菌中广泛研究，但由于在有丝分裂过程中有些染色体会丢失，融合子不稳定，未能得到广泛应用。基因工程育种在食用菌中的研究应用主要包括以下两个方面一是利用食用菌作为新的基因工程的受体菌，生产人们所期望的外源基因编码的产物(即作为生物反应器)。二是利用基因工程技术定向培育食用菌新品种，包括抗虫、抗病，优质的新品种，以及将编码纤维素或木质素降解酶的基因导入食用菌体内，以提高食用菌的产量和质量(阎培生等，1997)。但基因工程育种目前存在的主要问题有1、假阳性菌落的干扰；2、外源DNA整合率不高；3、外源基因整合后表达率不高；4、转化子不稳定。这些问题均将严重阻碍着研究向实际应用的转化。在诱变育种中，除采用物理、化学方法改变和破坏染色体结构而促其变异外，还有一种是不改变和破坏染色体的结构，而人工诱导多倍体形成的技术方法。在植物界中的经济作物、中药材植物、花卉中已人工培育出众多的多倍体植株。在动物界国内已有成功的报道。以贝类、虾类、鱼等海产养殖领域的多倍体育种比较成熟，如大连水产学院的鲍多倍体等。在微生物中已有酿酒酵母的多倍体菌株用于工业化生产。人工诱导多倍化过程主要是利用诱导剂(如细胞松弛素Β、6-二甲基氨基嘌呤、秋水仙素等)干扰细胞分裂过程。其作用主要在于能抑制处于分裂细胞中的微管的聚合，使已有的微管解聚，从而阻止纺锤体的形成或破坏已形成的纺锤体，使细胞的染色体在加倍后而不能分离，使细胞分裂停止在分裂中期。这种染色体加倍后的细胞在解除诱导处理后，在一定时间内能恢复正常生长，重新进行细胞分裂，从而得到较为稳定的多倍体细胞。这种干扰作用对染色体结构无明显影响， 只导致染色体的成倍增加，并不发生染色体交换、基因重组和基因突变，可使原有性状得到放大、加强和提高。这在很多种植物的多倍体育种中得到证明，而在食用菌育种研究中还未见有国内外的任何报道。有日本学者在上世纪八十年代研究认为人工诱导菇类多倍体是不可能的。我国是世界香菇栽培大国，栽培历史悠久，栽培技术先进，特别是代料栽培技术居世界领先水平。但是国内培育具有自主知识产权的香菇品种较少，特别是能在国内大面积栽培的品种更少。香菇代料栽培是今后生产发展的主要方式，目前国内香菇代料栽培中的品种仍以“ 135”和“939”菌株为主。香菇“ 135”菌株是上世纪70年代使用的低温迟熟型品种，菇形、品质较好，但使用年代过久，在代料栽培中表现为产量较低，抗逆性差，夏季遇高温易烂筒。香菇“939”菌株产量较高，易管理，但出菇过多、过密，丛生菇多，严重影响香菇品质。所以，选育出高产优质、抗逆性强的香菇新菌株，促进我国香菇代料生产的可持续发展，已是迫在眉睫的工作。
本发明的目的是通过诱变处理，在不改变出发菌株的优良性状的基础上，较大幅度的提高产量和增强其适应性，采用出发菌株的双核体诱变的方法，以期培育出适宜代料栽培、优质、高产，且抗逆性强的优良菌株，用于香菇生产，代替目前的常规栽培品种，促进香菇产业的可持续发展。一方面，本发明提供了一种香菇(Lentinula edodes)新菌株K05、K03，该菌菌株已于2012年01月06日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌株K05的保藏号为CGMCC No. 5712 ； 菌株K03的保藏号为CGMCC No. 5711。所述K05是香菇135菌株的双核体诱变菌株，所述 K03是香菇303菌株的双核体诱变菌株。另一方面，本发明提供了一种香菇诱变育种的方法，包括以下步骤(1)制备含有秋水仙素的PDA培养基，装试管，灭菌后摆放成试管斜面培养基；(2)上述培养基中分别接入香菇135、303双核体菌株进行诱导培养；(3)经培养一定时间后，转出菌落生长前端的菌丝到常规培养基中进行恢复培养；(4)作生长速度、生长形态观测试验；作对峙培养，同功酶检测试验；作DNA指纹图谱分析检测，鉴定诱变菌株是有别于出发菌株的新菌株；(5)新菌株与出发菌株作连续三年的栽培品比试验；(6)优良新菌株经过专家组鉴定。所述秋水仙素的浓度在0.01% -5%的范围内，优选为为0. 1%。所述诱导培养的时间为2天-120天，根据诱导剂的使用浓度来选择诱导处理时间。本发明具有以下优点本发明克服了现有诱变育种中使其染色体结构发生改变而促使变异后，再筛选大量变异体的随机性、盲目性强的缺点，提供了一种食用菌诱变育种的新方法。不破坏和改变出发菌株的染色体结构，仅促使染色体倍性的增加，可不改变出发菌株现有的优良性状，从而达到使现有优良品种在产量、品质和适应性等生产性状方面得到较大的提升，获得更加优良的新菌株。通过诱变处理，在不改变出发菌株的优良性状的基础上，较大幅度的提高了产量和增强了适应性。从本发明的试验结果可以看出，秋水仙碱的诱变效果明显，该技术方法为香菇的新菌株选育提供了一种有效的新途径。香菇(Lentinula edodes)新菌株K05、K03,该菌菌株已于2012年01月06日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌株K05的保藏号为CGMCCNo. 5712 ；菌株K03的保藏号为CGMCC No.5711。图1是本发明技术路线示意图；图2是供试菌株ISSR聚类分析图；图3是供试菌株SRAP聚类分析图；图4是新菌株135A和出发菌株135的三年栽培数据统计直观图(横坐标为出菇月份当年9月至次年4月，纵坐标为单产，单位g)；图5是新菌株135A和出发菌株135平均单袋12月底以前产量占全年总产量比例图；图6是新菌株135A和出发菌株135三年平均单袋产量直观图；图7是供试菌株子实体形态特征。
下作菌丝生长试验，观察并记录菌丝生长情况。将诱变双核体菌株分别与其出发菌株135、303作拮抗性试验，观察并记录实验结
1. 2. 3新菌株检测鉴定(委托华中农业大学食品科技学院检测)1. 2. 3. 1鉴定的方法和内容1)菌丝细胞核染色采用爬片制备菌丝体进行荧光染色或吉姆沙染色，而后荧光显微镜下镜检，并记录结果。2)担孢子电镜扫描取子实体菌褶制片供电镜扫描观察担孢子形态和大小。3)营养成分分析氨基酸、多糖含量的测定4)拮抗实验取直径5cm的培养皿制平板，用打孔器制圆形接种块，同皿，同组合，
三次重复，接种对峙培养。5)酯酶同工酶常规凝胶电泳法记录结果。6)多酚氧化酶常规凝胶电泳法记录结果。7)核酸含量测定方法见提供的参考资料。8)分子标记(ISSR和SRAP)分析每种标记筛选3个合适的引物，记录每种引物分析的DNA指纹图和遗传聚类的结果。1.2. 4新菌株栽培比较试验1.2. 4. 1三年栽培比较试验于2007年、2008年、2009年分别用15cmX50cm的塑料袋制作菌筒，经室内越夏后，于秋季移入层架式菇棚(5层)中出菇，并注意环境条件的一致，记录每次的出菇时间、 产量、个数、菌盖直径、菌柄长短并计算每筒平均单产、单菇重。1. 2. 4. 2产量生物学统计分析用SPSS17. 0生物统计软件，对比出发菌株对新菌株三年的平均单袋产量进行统计分析。用旬期做因变量，同一菌株三年同一旬期的单袋产量做自变量，进行单因素方差分析。1.2. 4. 3抗高温比较试验对供试菌株进行越夏管理实验，统计分析越夏温度在30°C以上的时间及越夏前后菌筒的污染情况。1.2. 5营养组分测定检测单位农业部食品质量监督检验测试中心(武汉)1. 2. 6子实体形态特征子实体考种方法参照日本国提供的标准和方法进行。2结果与分析2. 1 结果2. 1. 1诱变实验从双核体诱变菌株中初筛选出菌株135A1、135A2、303A1、303A2，2. 1. 2供试菌株的筛选和拮抗实验生长温度试验表明所有菌株在5°C、25°C中均生长正常，菌丝均勻一致。在高温培养中，各菌株自开始即出现生长异常现象。将诱变双核体菌株13541、13542、30341、303々2分别与其出发菌株135、303作拮抗性试验，结果如表1 表

本发明涉及一种香菇新菌株K05、K03及其选育方法。所述K05是香菇135菌株的双核体诱变菌株，所述K03是香菇303菌株的双核体诱变菌株。是通过用含有秋水仙素的PDA培养基诱导培养而获得的，在不改变出发菌株现有优良性状的基础上，使新菌株在产量、品质和适应性等生产性状上比出发菌株得到较大的提升，是一种简便、实用和有效的食用菌育种新技术。