Kin17基因或蛋白在制备子宫颈癌诊断及治疗药剂中的应用的制作方法[0002]子宫颈癌是女性最常见的恶 性肿瘤之一。2012年我国宫颈癌的发病率为12.96/10万，占全部女性肿瘤构成的5.12%，严重威胁着我国女性的生命健康。宫颈上皮内瘤变及镜下早期浸润癌一般无症状，子宫颈癌患者在出现典型症状后，一般已为浸润癌。而在经手术与化疗等手段的有效治疗后，80%的I期和II期宫颈癌患者能获得明显的疗效。早期筛查与及早诊治对子宫颈癌患者的预后及疗效至关重要。目前用于临床的早期筛查方法及诊断指标尚不理想。一般的宫颈癌化疗药物缺乏肿瘤特异性，毒性强，副作用大。分子靶向治疗方法具有特异性好，副租用小的特点，在治疗子宫颈癌患者，特别是晚期的患者中具有独特的优势。目前宫颈癌靶向药物还处于早期研发阶段，而且在临床试验中出现疗效不稳定、个体疗效差异大、与常规化疗药协同作用不佳等一些亟需解决的临床问题，尚未见疗效显著的分子靶向药物用于子宫颈癌患者的临床治疗。[0003]子宫颈癌细胞具有旺盛的增殖力、持续的DNA复制潜能和蓄积的DNA损伤。Kinl7蛋白是一个在物种进化过程中十分保守的蛋白质，它主要与细胞的DNA复制、DNA修复及细胞增殖功能有关，在人体各组织器官中表达普遍较低。目前，关于Kinl7基因或蛋白子宫颈癌新的诊断标志及药物靶标还末见报道。
[0004]本发明的目的在于提供Kinl7基因或蛋白在制备子宫颈癌诊断、预后评估及治疗药剂中的应用。[0005]发明人发现，Kinl7基因或蛋白可作为子宫颈癌新的诊断标志及药物靶标，Kinl7蛋白在正常子宫颈上皮组织及子宫颈良性病变组织中表达较低，而其在子宫颈癌组织中的表达明显异常升高；而且Kinl7维持了子宫颈癌细胞的快速增殖活性，在子宫颈癌的发生发展中发挥重要作用。因此，Kinl7基因(核苷酸序列见SEQIDN0:1)或蛋白(氨基酸序列见SEQ ID NO:2)可作为子宫颈癌新的诊断标志及药物靶标，Kinl7基因或蛋白可用于子宫颈癌的早期鉴别诊断、肿瘤患者的预后评估分析及临床治疗。


[0006]图1:Kinl7在子宫颈良性病变标本的上皮组织及宫颈癌标本的癌巢组织中的表达情况；
图2:重组质粒pET32a-KIN17中插入的Λ7Λ77基因的部分测序图；
图3:1PTG诱导Kinl7蛋白在大肠杆菌中原核表达的SDS-PAGE电泳图；图4:纯化后的His标签Kinl7蛋白的SDS-PAGE电泳图(左)与Western_blot鉴定图(右)；
图5:用siRNA_Kinl7下调Kinl7表达(左)，抑制了子宫颈管癌HeLa细胞的生长增殖活性(右)；
图6:用siRNA_Kinl7剔降Kinl7，能增强紫杉醇对子宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用。

[0007]Kinl7基因或蛋白的定名与序列
编码Kinl7蛋白的基因定名为“KIN17基因”，KIN17基因编码的蛋白定名为“Kinl7蛋白”，KIN17基因的登录号为:NM_012311。
[0008]KIN17基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]Kin17蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0010]下面结合具体的实验对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0011]Kinl7基因或蛋白应用于子宫颈癌诊断:
子宫颈癌组织是由子宫颈正常上皮细胞发生恶性变化及不受控制地增殖而形成的。本发明人用免疫组织化学方法，检测了 Kinl7在129例子宫颈活检标本中的表达，其中包含27例宫颈良性病变标本(含慢性宫颈炎、宫颈上皮不典型增生及宫颈上皮内瘤变标本等)及102例子宫颈癌标本(含82例宫颈鳞癌、15例宫颈腺癌和5例宫颈腺鳞癌)。
[0012]免疫组化检测的步骤:
1)组织切片脱蜡至水，置于0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中，100°C微波抗原修复处理20min，自然冷却至室温；
2)蒸馏水冲洗后，滴加3%H202孵育15min;然后用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)冲洗3次,每次3min ；
3)滴加I: 150稀释的Kinl7抗体(购自Santacruz)，37°C孵育60min后，用PBS冲洗3次,每次3min ；
4)接着滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的EnVision?二抗试剂(购自Dako公司)，37°C孵育30min后，用PBS冲洗3次，每次3min。最后用3，3’- 二氨基联苯胺(DAB)显色3min，Mayer苏木素复染3min ；
5)梯度酒精脱水、透明、封固。
[0013]染色评分:分别就每张切片的染色强度(一，±，I +，2 +，3 +，4十)与阳性细胞的百分率(0-100)%进行打分。计算染色得分=染色强度(0，0.5，1，2，3，4)X (0-100)。
如，某张玻片的染色强度是2 +，阳性细胞的百分率是65%，那得分等于2X60=130。得分(100定义为低表达，得分> 100定义为高表达。全部切片由两个病理科医生在不知道组织诊断性质的情况下独立打分。
[0014]根据染色评分结果对数据进行统计分析。结果发现，Kinl7在子宫颈正常组织及宫颈不典型增生组织中表达较低，而在子宫颈癌组织中表达明显异常升高0° < 0.01，图1)。Kinl7的表达随着疾病的进程由宫颈上皮细胞从正常或不典型增生，发展到宫颈癌而升高。肿瘤细胞增殖越旺盛的组织部位，Kinl7的表达越强。因此，采用免疫组化、免疫荧光和实时定量PCR等方法对患者宫颈病变组织中的Kinl7表达水平进行检测，有助于鉴别诊断子宫颈的良性病变与子宫颈癌。
[0015]Kinl7蛋白的制备
纯化Kinl7蛋白是制备Kinl7抗体及相关的诊断试剂的重要材料。为了研发基于Kinl7表达的肺癌诊断试剂，采用如下方法制备Kinl7蛋白。
[0016]I)先用引物 Pl (5，-CGGGATCCATGGGGAAGTCGGATTTTCT-3’，SEQ ID NO:3)和 P2 (5，-CGTAAGCTTTCAGGCAAGTTTAGAAATGTCTTC-3’，SEQ ID NO:4)从细胞中 PCR 扩增基因开放阅读框全长，经用内切酶汉3ΜΠ和历id分别进行双酶切反应后，插入到pET32a-c (+)载体中，测序分析(图2)证明成功构建pET32a-KIN17重组质粒；
2)将重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21中，再用IPTG诱导表达携带His标签的Kinl7蛋白，经SDS — PAGE电泳分离及考马斯亮蓝染色后，发现目的蛋白的表达较好(图3)；
3)接着利用N1-NTAHis-Bind柱进行亲和层析来纯化Kinl7蛋白。
[0017]纯化终产物经SDS-PAGE电泳分析显示，一个和His标签Kinl7蛋白大小一致的蛋白条带纯度很高，达到95%以上(如图4左);该主要条带经Western blot方法鉴定为Kinl7目的蛋白(图4右)。
[0018]Kinl7基因或蛋白应用于子宫颈癌患者的预后判断的方案: 收集宫颈癌患者及肿瘤组织的病理参数的数据信息，统计分析病理组织中Kinl7表达与这些参数的相关性。结果显示，患者肿瘤组织中Kinl7表达水平高低(评分> 100或者≤100)与患者P53突变情况Gd = 0.035，x 2检验)、Ki_67表达0° = 0.028，x 2检验)和对化疗药物敏感性Gd = 0.046，X2检验)等参数密切相关；通过患者的随访调查发现，发生远处转移的子宫颈癌患者的组织中，Kinl7的表达比没有发生转移的子宫颈癌患者要高0°= 0.042，X2检验)。因此，对Kinl7基因或蛋白的检测有助于评估与预期子宫颈癌患者的病情进展状况、抗癌治疗效果及预后情况。
[0019]Kinl7基因或蛋白应用于子宫颈癌的临床治疗的方案:
按照以下步骤进行RNA干扰试验:子宫颈癌HeLa细胞经血清饥饿2h后，用脂质体Lipofectamine 2000 转染 Kinl7 特异性的 siRNA (siRNA_Kinl7)与相对应的对照 siRNA(siRNA_NC)到细胞中；48h后，收集两组细胞进行Western blot分析及细胞生长曲线比较，发现转染siRNA_Kinl7的HeLa细胞中Kinl7表达被明显下调，而且其生长速度明显减慢Gd< 0.05，图5)。因此，沉默子宫颈癌细胞中Kinl7表达，抑制能够肿瘤细胞的增殖活性。
[0020]转染siRNA_Kinl7与siRNA_NC到HeLa细胞48h后，在两组细胞中各加入子宫颈癌常用化疗药紫杉醇，然后比较两组细胞的存活率变化；结果显示，转染siRNA_Kinl7的HeLa细胞存活率下降得比对照组要更快。当今，很多化疗药是利用抑制DNA复制与增加细胞内DNA损伤的程度，来达到抑制肿瘤细胞生长的作用。因此，沉默子宫颈癌细胞中与DNA复制、修复相关的Kinl7表达，能增强其对化疗药紫杉醇的敏感性(图6)。
[0021]因此，Kinl7可以作为子宫颈癌治疗的靶点，采用特异性的si_RNA、sh_RNA、Kinl7特异性的抗体或者小分子药物，沉默或者降低肿瘤组织中的Kinl7的表达，可用于子宫颈癌的临床治疗。