专利名称：一种利用玉米秸秆水解液发酵生产微生物油脂的方法当前，能源与环境问题日益受到人们的关注，已成为世界各国面临的主要问题之一。如何应对日益加剧的化石能源需求量的增加与自然资源严重短缺的矛盾，实现可持续发展，是各国研究人员关注的焦点。作为一种能够替代传统化石燃料的绿色可再生能源，生物柴油具有极大的发展潜力。生物柴油(Biodiesel)是生物质能的一种，是以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物的油脂以及动物油脂、餐饮废弃油等为原料油脂通过酯交换工艺制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料。生物柴油具有优良的稳定性和环保特 性，硫含量低，可大大减少二氧化硫等硫化物的排放量且生物降解性可达98%，与普通柴油相比，对环境的破坏作用显著降低。用于生产生物柴油的原料油脂来源广泛，主要包括各种天然的植物油脂、动物脂肪以及食品工业的废油等，目前主要集中于植物油和餐饮废弃油脂。尽管生物柴油在世界多个国家和地区已经有了一定的应用，但成本过高仍然是制约其进一步发展和应用的主要瓶颈。以植物油脂为例，原料成本高达总成本的75%，而餐饮废弃油脂也同样存在收集和运输困难等问题。因此，开发一种廉价的原料油脂是生物柴油产业化的关键。微生物油脂(Microbial oil),又称单细胞油脂(Single cell oil, SCO),是指微生物在一定条件下产生并储存于菌体内的甘油脂，其脂肪酸组成以C16、C18系脂肪酸(如硬脂酸、油酸和亚油酸)为主。产油微生物产生并储存的油脂通常占其生物总量的20%以上，包括细菌、霉菌、酵母、藻类等。与传统油脂生产相比，微生物发酵生产油脂具有以下优点生长周期短，适应性强；不受场地、气候和季节的限制，占地面积小，易于实现大规模连续生产；碳源利用谱广，可以工农业、林业、食品行业及造纸业的多种废弃物为基质进行生长，来源丰富、价格低廉；油脂成分与植物油脂组成相似，可作为生产生物柴油的原料，也可开发一些功能性油脂应用于食品及其它相关领域。木质纤维素是含量最丰富的自然资源之一，主要由纤维素、半纤维素、木质素三部分组成，其中，纤维素、半纤维素是可发酵糖的重要来源。木质纤维素经水解后，可生成葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等多种糖类，为微生物的生长提供丰富的碳源。我国是农业大国，如果能充分利用各种农业废弃物如水稻杆、高粱杆、小麦杆、玉米秸杆等进行微生物发酵生产油脂，将对缓解油脂供需紧张的局面和环境保护产生积极的影响。目前，也存在一些关于制备微生物油脂的方法，但是普便得率较低，方法较为复杂。通过检索，发现与本专利申请相关的如下三篇专利公开文献I、微生物发酵油脂及其用于制备生物柴油的方法(CN1923960)，本发明包括微生物发酵油脂的制备和利用微生物发酵油脂制备生物柴油的方法，即以酵母菌为微生物产油脂菌种，通过在产油脂菌种培养基中接入该酵母菌微生物，在一定的培养条件下进行微生物发酵制备油脂，然后经离心、分离、提取得到微生物发酵油脂，以该微生物油脂为原料，在催化剂作用下进行转酯化反应，得到生物柴油，副产物为甘油。该技术反应条件温和、操作简单、易于控制、成本较低，以微生物发酵油脂为原料，具有良好的工业化应用前景。2、用植物废弃物生产生物柴油和土壤调节剂的方法(CN101007957A)，其方法具体是将植物废弃物粉碎后通过常规的酶水解或者酸水解得到水解产物，用水解产物发酵培养高产油脂的微生物，得到大量的菌体； 水解残渣接种内生菌或益生菌，待用；按常规方法从培养得到的菌体中提取油脂，提取的油脂再通过甲酯化得到生物柴油；菌体残渣与接种内生菌或者益生菌的秸杆水解残渣复配，得到土壤调节剂。本方法利用植物废弃物转化为生物柴油，同时生产土壤调节剂，能充分利用秸杆成分实现资源效益最大化，有广阔的市场空间。3、秸杆载体用于油脂热解制备生物柴油的方法(CN101463264A)，提供一种秸杆载体用于油脂热解制备生物柴油的方法，油菜籽等含油脂物料粉碎后与粉碎的秸杆混和，或油脂与粉碎的秸杆混和，用固定床或流化床反应器热解，收集液相产物分离脂肪酸甲酯即得生物柴油。本发明的秸杆载体用于油脂热解制备生物柴油的方法，具有下述优点首先，用热解的方法将油脂转化为生物柴油，避免了油脂提取和传统转酯化反应复杂工艺；其次，本发明所用的油脂物料来源广泛，包括富含动植物和微生物油脂物料及动植物和微生物油月旨，对油脂原料没有选择性，有利于解决生物柴油生产过程中油脂来源不足问题。通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献有本质不同。
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种方法简便、降低原料油脂的生产成本、提高农副产品的应用价值、对环境无污染而且油脂含量较高的利用玉米秸杆水解液发酵生产微生物油脂的方法。本发明实现目的的技术方案是一种利用玉米秸杆水解液发酵生产微生物油脂的方法，步骤如下⑴玉米秸杆水解液的制备将玉米秸杆通过酸水解制得玉米秸杆水解液；⑵脱毒处理；向步骤⑴中的玉米秸杆水解液中加入0&(011)2，调pH至10-11，离心取上清液，用磷酸回调PH至6. 0，离心取上清液，再将上清液灭菌、抽滤，所得滤液调pH至6. 0，再次灭菌后备用;⑶产油微生物的发酵培养向步骤⑵制得的玉米秸杆水解液中加入固液比g/mL为0. 1-0. 3%的(NH4)2SO4,0. 01-0. 10% 的酵母粉，0. 05-0. 2% 的 KH2PO4,0. 01-0. 05% 的Mg2SO4 *7H20，溶解后调 pH至 5. 0，经121°C、20min灭菌，作为发酵培养基；向灭菌后的发酵培养基中接入产油微生物，接种量为发酵培养基体积的10-20%，在30°C、180r/min条件下培养96_144h，发酵结束后，离心收集菌体；⑷微生物油脂提取步骤⑶中菌体经破碎、提取即得微生物油脂。而且，所述步骤⑴中玉米秸杆水解液的制备的具体步骤如下玉米秸杆经清洗、烘干、粉碎后，过40目筛，按照玉米秸杆粉末与稀酸溶液的固液比g mL为1:8-11的比例加入质量百分数为2%的稀硫酸溶液，于121°C高压水解20min，3800r/min离心15min,即得玉米稻杆水解液。而且，所述步骤⑵中Ca (OH) 2为Ca (OH) 2粉末。而且，所述步骤⑶中向步骤⑵制得的玉米秸杆水解液中加入固液比g/mL为0. 2%的(NH4)2SO4jO. 05% 的酵母粉，0. 1% 的 KH2PO4,0. 03% 的 Mg2SO4 7H20。而且，所述步骤⑶中的发酵培养基制备中调节pH所用的酸为盐酸。而且，所述步骤⑶中的接种量为发酵培养基体积的15%。而且,所述步骤⑶中的产油微生物是圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloidesAs2. 1389)。 而且，所述步骤⑶中的发酵时间为120h。而且，所述步骤⑷中微生物油脂提取的具体步骤如下使用酸热耦合超声波法对菌体细胞进行破碎，即每克菌体加入10mL、4mol/L盐酸，振荡混匀，室温下静置30min后沸水浴3min，立即置于-20°C环境中速冷；取出后超声破碎；将破碎后的菌体细胞按照固液比g mL为1:2-5的比例加入体积比为I: I的乙醚石油醚混合溶液萃取，充分振荡后，超声lOmin，抽滤，取滤液，旋转蒸发除去有机溶剂即得微生物油脂。而且，所述破碎后的菌体细胞与乙醚石油醚混合溶液的固液比g :mL为1:3。本发明的优点和有益效果为I、本发明微生物油脂的生产方法利用稀硫酸水解玉米秸杆得到木质纤维素水解液，经Ca (OH) 2脱毒处理后可有效减少或抑制水解液中的发酵抑制物，从而促进微生物发酵，得到含量较高的微生物油脂。本发明方法得到的生物量为13. 5g/L，油脂产量4. 71g/L，油脂含量为34. 89%，还原糖利用率95. 73%。2、本发明微生物油脂的生产方法以玉米秸杆为原料，价格低廉、来源广泛，不仅扩大了原料油脂的来源、降低了原料油脂的生产成本，提高了农副产品的应用价值，而且对环境保护和资源的可再生利用具有积极的意义。3、本发明微生物油脂的生产方法以木质纤维素水解液为底物发酵生产微生物油月旨，水解后获得的可发酵糖可作为培养基用于多种生物发酵产品，不仅扩展了生物柴油的原料油脂来源，使生物质资源得到充分应用，而且方法简便，便于工业化生产。玉米秸杆经清洗、烘干、粉碎后，过40目筛，按照玉米秸杆粉末与稀酸溶液的固液比(g mL)为1:8的比例加入质量百分数为2%的稀硫酸溶液，于121 °C高压水解20min，3800r/min离心15min,得玉米稻杆水解液，即木质纤维素水解液；采用DNS法测水解液中还原糖的含量；⑵脱毒处理Ca(OH)JA毒处理向水解液中加入Ca (OH) 2粉末，调pH至10-11，3800r/min离心IOmin,取上清液,用磷酸回调pH至6. 0, 3800r/min离心IOmin,取上清液；所得上清液经灭菌有沉淀产生，抽滤，去除沉淀，用NaOH调pH至6. 0，灭菌；⑶产油微生物的发酵培养 ①种子液的培养在无菌条件下从活化后的圆红冬孢酵母(RhodosporidiumtoruloidesAs2. 1389)斜面上挑取1_2环菌体，接入到已灭菌的50mLYEro液体种子培养基中，于30°C、180r/min摇瓶培养至对数生长期，得到发酵种子液；所述的YEH)培养基的组成为酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH6. 0 ；固体培养基加入20g/L的琼脂。所述的YEH)培养基在121 °C条件下灭菌20min ；②发酵培养在步骤⑵制得的玉米秸杆稀酸水解液中加入固液比(g/mL)为0. 1%的(NH4) 2S04,0. 01% 的酵母粉，0. 01% 的 KH2PO4,0. 01% 的 Mg2SO4 IW2Q,充分溶解后，调 pH 至5.0，经121°C、20min灭菌后，作为发酵培养基，备用；在灭菌后的发酵培养基中接入步骤①所得的发酵种子液，接种量为培养基体积的10%，置于恒温摇床培养箱中培养，培养条件为30°C、180r/min，发酵周期120h，发酵结束后，4000r/min离心15min收集湿菌体,用蒸懼水洗漆两次后于45°C烘箱中干燥至恒重,获得干菌体，备用；⑷微生物油脂提取将步骤⑶得到的干菌体利用有机溶剂乙醚-石油醚提取法，对干燥的油脂微生物菌体细胞内的油脂进行提取，方法如下用酸热耦合超声波法对菌体细胞进行破碎，即每克菌体加入10mL、4mol/L盐酸，振荡混匀，室温下静置30min后沸水浴3min，立即置于-20°C环境中速冷。取出后再置于200W的超声清洗器中超声lOmin。将破碎后的菌体细胞按照固液比(g:mL)l:2的比例加入体积比为1:1的乙醚石油醚混合溶液萃取，充分振荡后，超声lOmin，抽滤，取滤液，旋转蒸发除去有机溶剂即得粗油脂。经检测，本发明所得微生物油脂的组成成分包括肉豆蘧酸(C14:tl)、十五碳酸(C15:tl)、棕榈油酸(c16:1)、反式棕榈油酸(c16:1)、棕榈酸(c16:tl)、十七碳酸(c17:tl)、亚油酸(c18:2)、油酸(C18:1)、硬脂酸(C18:tl)。主要成分为C16和C18系脂肪酸，其中棕榈酸、油酸、亚油酸的含量相对较高，与植物油的组成相似，可以作为原料油脂用于生产生物柴油及其它相关化工行业。经检测，所得玉米秸杆稀酸水解液中的还原糖含量为38. 77g/L ;发酵结束后菌体生物量达到12g/L，油脂产量3. 5g/L，油脂含量为29. 17%，还原糖利用率92. 52%。实施例2一种利用玉米秸杆水解液发酵生产微生物油脂的方法，具体步骤如下
⑴玉米秸杆水解液的制备玉米秸杆经清洗、烘干、粉碎后，过40目筛，按照玉米秸杆粉末与稀酸溶液的固液比(g mL)为1:10的比例加入质量百分数为2%的稀硫酸溶液，于121°C高压水解20min，3800r/min离心15min,得玉米稻杆水解液，即木质纤维素水解液；采用DNS法测水解液中还原糖的含量；⑵脱毒处理Ca(OH)JA毒处理向水解液中加入Ca (OH) 2粉末，调pH至10-11，3800r/min离心15min,取上清液,用磷酸回调pH至6. 0, 3800r/min离心15min,取上清液；所得上清液经灭菌有沉淀产生，抽滤，去除沉淀，用NaOH调pH至6. 0，灭菌；
⑶产油微生物的发酵培养①种子液的培养在无菌条件下从活化后的圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides As2. 1389)斜面上挑取1_2环菌体，接入到已灭菌的50mLYEro液体种子培养基中，于30°C、180r/min摇瓶培养至对数生长期，得到发酵种子液；所述的YEH)培养基的组成为酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH6.0 ;固体培养基加入20g/L的琼脂。所述的YEH)培养基在121 °C条件下灭菌20min ；②发酵培养在步骤⑵制得的玉米秸杆稀酸水解液中加入固液比(g/mL)为0. 2%的(NH4) 2S04,0 . 05% 的酵母粉，0. 1% 的 KH2PO4,0. 03% 的 Mg2SO4 IW2Q,充分溶解后，调 pH 至5.0，经121°C、20min灭菌后，作为发酵培养基，备用；在灭菌后的发酵培养基中接入步骤①所得的发酵种子液，接种量为发酵液体积的15%，置于恒温摇床培养箱中培养，培养条件为30°C、180r/min，发酵周期120h，发酵结束后，4000r/min离心15min收集湿菌体,用蒸懼水洗漆两次后于45°C烘箱中干燥至恒重,获得干菌体，备用；⑷微生物油脂提取将步骤⑶得到的干菌体利用有机溶剂乙醚-石油醚提取法，对干燥的油脂微生物菌体细胞内的油脂进行提取，方法如下用酸热耦合超声波法对菌体细胞进行破碎，即每克菌体加入10mL、4mol/L盐酸，振荡混匀，室温下静置30min后沸水浴3min，立即置于_20°C环境中速冷，取出后再置于200W的超声清洗器中超声lOmin。将破碎后的菌体细胞按照固液比(g:mL)l:3的比例加入体积比为1:1的乙醚石油醚混合溶液萃取，充分振荡后，超声lOmin，抽滤，取滤液，旋转蒸发除去有机溶剂即得粗油脂。经检测，本发明所得微生物油脂的组成成分包括肉豆蘧酸(C14:tl)、十五碳酸(C15:tl)、棕榈油酸(c16:1)、反式棕榈油酸(c16:1)、棕榈酸(c16:tl)、十七碳酸(c17:tl)、亚油酸(c18:2)、油酸(C18:1)、硬脂酸(C18:tl)。主要成分为C16和C18系脂肪酸，其中棕榈酸、油酸、亚油酸的含量相对较高，与植物油的组成相似，可以作为原料油脂用于生产生物柴油及其它相关化工行业。经检测，所得玉米秸杆稀酸水解液中的还原糖含量为38. 77g/L ;发酵结束后菌体生物量达到13. 5g/L，油脂产量4. 71g/L，油脂含量为34. 89%，还原糖利用率95. 73%。实施例3
一种利用玉米秸杆水解液发酵生产生物柴油的方法，具体步骤如下⑴玉米秸杆水解液的制备玉米秸杆经清洗、烘干、粉碎后，过40目筛，按照玉米秸杆粉末与稀酸溶液的固液比(g mL)为1:10的比例加入质量百分数为2%的稀硫酸溶液，于121°C高压水解20min，3800r/min离心15min,得玉米稻杆水解液，即木质纤维素水解液；采用DNS法测水解液中还原糖的含量；⑵脱毒处理Ca(OH)JA毒处理向水解液中加入0&(011)2粉末，调口11至10-11，380017/111111离心20min,取上清液,用磷酸回调pH至6. 0, 3800r/min离心15min,取上清液；所得上清液经灭 菌有沉淀产生，抽滤，去除沉淀，用NaOH调pH至6. 0，灭菌；⑶产油微生物的发酵培养①种子液的培养在无菌条件下从活化后的圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides As2. 1389)斜面上挑取1_2环菌体，接入到已灭菌的50mLYEro液体种子培养基中，于30°C、180r/min摇瓶培养至对数生长期，得到发酵种子液；所述的YEH)培养基的组成为酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH6. 0 ；固体培养基加入20g/L的琼脂。所述的YEH)培养基在121 °C条件下灭菌20min ；②发酵培养在步骤⑵制得的玉米秸杆稀酸水解液中加入固液比(g/mL)为0. 3%的(NH4) 2S04,0. 10% 的酵母粉，0. 2% 的 KH2PO4,0. 05% 的 Mg2SO4 IW2Q,充分溶解后，调 pH 至5.0，经121°C、20min灭菌后，作为发酵培养基，备用；在灭菌后的发酵培养基中接入步骤①所得的发酵种子液，接种量为15%，置于恒温摇床培养箱中培养，培养条件为30°C、180r/min，发酵周期144h，发酵结束后，4000r/min离心15min收集湿菌体，用蒸馏水洗涤两次后于45°C烘箱中干燥至恒重，获得干菌体，备用。⑷微生物油脂提取将步骤⑶得到的干菌体利用有机溶剂乙醚-石油醚提取法，对干燥的油脂微生物菌体细胞内的油脂进行提取，方法如下用酸热耦合超声波法对菌体细胞进行破碎，即每克菌体加入10mL、4mol/L盐酸，振荡混匀，室温下静置30min后沸水浴3min，立即置于-20°C环境中速冷；取出后再置于200W的超声清洗器中超声IOmin ;将破碎后的菌体细胞按照固液比(g:mL) 1:5的比例加入体积比为1:1的乙醚石油醚混合溶液萃取，充分振荡后，超声lOmin，抽滤，取滤液，旋转蒸发除去有机溶剂即得粗油脂。经检测，本发明所得微生物油脂的组成成分包括肉豆蘧酸(C14:tl)、十五碳酸(C15:tl)、棕榈油酸(c16:1)、反式棕榈油酸(c16:1)、棕榈酸(c16:tl)、十七碳酸(c17:tl)、亚油酸(c18:2)、油酸(C18:1)、硬脂酸(C18:tl)。主要成分为C16和C18系脂肪酸，其中棕榈酸、油酸、亚油酸的含量相对较高，与植物油的组成相似，可以作为原料油脂用于生产生物柴油及其它相关化工行业。经检测，所得玉米秸杆稀酸水解液中的还原糖含量为38. IlgfL0发酵结束后菌体生物量达到12. 4g/L，油脂产量4g/L，油脂含量为32. 26%，还原糖利用率91. 08%。


本发明涉及一种利用玉米秸秆水解液发酵生产微生物油脂的方法，步骤如下⑴将玉米秸秆通过酸水解制得玉米秸秆水解液；⑵向水解液中加入Ca(OH)2，调pH至10-11，3800r/min离心10-20min，取上清液，用磷酸回调pH至6.0，3800r/min离心10-20min，取上清液，再将上清液灭菌、抽滤，所得滤液用NaOH调pH至6.0；⑶产油微生物的发酵培养⑷步骤⑶中干菌体经破碎、提取即得微生物油脂。本发明微生物油脂的生产方法利用稀硫酸水解玉米秸秆得到木质纤维素水解液，经Ca(OH)2脱毒处理后可有效减少或抑制水解液中的发酵抑制物，从而促进微生物发酵，得到含量较高的微生物油脂，可进一步转化为生物柴油。