专利名称：奶牛fgf2基因的单核苷酸多态性序列及其检测方法奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列及其检测方法技术领域本发明属于基因工程技术领域，具体涉及奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列及其检测方法。FGF2是纤维母细胞生长因子家族成员，通过细胞表面的FGF受体(FGFR)调节机体的生长和发育。FGF2诱导的信号转导是正常细胞生长分化所必需的，参与血管新生、胚胎发育、骨骼形成等生理过程。此外，有研究表明，FGF2在某些情况下也可以诱导ES细胞向神经系统分化。成纤维细胞生长因子(FGF)家族调控不同生理时期牛的乳腺发育，而且FGF2 在牛发情期和怀孕早期的子宫内膜表达，能够增加滋养外胚层IFN-tau(IFN- τ )的mRNA和蛋白质丰度。IFN-τ是反刍动物怀孕建立的因子，激活子宫内膜腺体中的JAK-STAT通路， 是JAK-STAT信号传导途径中的重要一员，在受精和早期胚胎发育中具有重要作用，能够促进反刍动物怀孕的持续，而且多个信号通路都跟IFN- τ的表达有关。目前国内外对FGF2基因与奶牛的繁殖性状和产奶性状相关性的研究很少。单核苷酸多态性(SNPs)和生产性状间的关联分析表明FGF2基因与奶牛体细胞数、生产使用年限和胚胎死亡率等性状间存在显著相关，为奶牛的标记辅助选择育种提供理论依据。发明内容本发明所要解决的技术问题是提供FGF2基因第一内含子中的SNP位点、其确定方法及应用，为提高奶牛的繁殖率和使用年限以及奶牛的分子育种提供理论依据。本发明的技术方案如下奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列，其中，所述奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列包括奶牛FGF2基因第一内含子第11646位为A或G的单核苷酸多态性序列。—组检测权利要求1所述奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列的引物，其中，所述引物对的上游引物FGF2-F的序列如序列表3所示，所述引物对的下游引物FGF2-R的序列如序列表4所示。上述技术方案所述的奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列的检测方法，包括下述步骤
以奶牛基因组池DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶牛FGF2基因；对纯化的PCR产物进行测序，确定奶牛FGF2单核苷酸多态性位点；
所述的引物对P的上游引物FGF2-Inl的序列如序列表1所示，下游引物FGF2_In2 的序列如序列表2所示，具体的为
上游引物FGF2-Inl :5，TCAGTCTTCACATCCGTCTCAG 3，，
下游引物FGF2-In2 :5，TCATACACTGAAGCCTGAAGC 3，。
上述技术方案所述的奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列的检测方法，其中，所述检测方法还包括对奶牛FGF2基因单核苷酸多态性序列的鉴定步骤，包括以奶牛FGF2基因为模板，以引物对F为引物，进行PCR扩增；PCR产物用Csp6I限制性内切酶进行酶切后用琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定，根据电泳结果鉴定奶牛FGF2基因第11646位的单核苷酸多态性为A等位基因为207bp，G等位基因为171bp ；
所述引物对F的上游引物FGF2-F的序列如序列表3所示，所述引物对F的下游引物FGF2-R的序列如序列表4所示，具体为
上游弓ι 物 FGF2-F 5，CATAGTTCTGTAGACTAGAAG 3，，
下游引物FGF2-R :5，CCTCTAAAGAAGGATTAAGTCAAAATGGGGCTGGTA 3，；
在本技术方案中为了引入Csp6I限制性内切酶的识别位点，所述引物对F为突变引物，下游引物FGF2-R的G碱基为突变碱基(A突变为C)。
上述技术方案所述的奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列的检测方法，其中，所述鉴定步骤中的PCR反应过程为95°C变性5min，然后94°C 45s，退火温度63到50°C 45s, 72 °C 45s，32个循环，每个循环降低2°C，然后72°C延伸Snin。
上述技术方案所述的奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列的检测方法，其中，琼脂糖凝胶的浓度为2%。
本发明具有以下有益效果
本发明的奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性位点是首次发现的新位点，通过对 2773个个体的基因型与性状间的关联分析表明该SNP位点与乳脂量和乳脂率、体细胞计数、繁殖力有关；通过对4542个个体外受精胚胎的基因型分析，发现该SNP位点与胚胎成活率有关，通过对该基因多态性的研究，可用于奶牛分子标记辅助育种以及提高体外受精胚胎成活率。


1、图 1 为 FGF2 gene 11646 位点的 A/G 突变2、图2为限制性内切酶Csp6I酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1 :FGF2基因的SNP位点的检测方法与鉴定
(一)本发明FGF2基因的SNP位点(即第一内含子11646位点的A/G突变)确定步骤
本发明的FGF2基因第一内含子中的SNP位点的确定方法，包括步骤
(1)采集2773奶牛个体的血液、牛奶和精液，分别从血液、牛奶和精液中提取奶牛的基因组DNA，利用GFX基因组DNA纯化试剂盒提取(操作步骤按照试剂盒的操作说明进行)，奶牛个体样品采集和来源见表1 ；
表1样品采集及来源


本发明奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列及其检测方法，属于基因工程技术领域，所述奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列包括奶牛FGF2基因第一内含子第11646位为A或G的单核苷酸多态性序列。所述检测方法为以奶牛基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶牛FGF2基因；对纯化的PCR产物进行测序，确定奶牛FGF2单核苷酸多态性位点为第11646位A或G。本发明的奶牛FGF2基因的SNP位点与乳脂量和乳脂率、体细胞计数、繁殖力有关；通过对体外受精胚胎的基因型分析，发现该SNP位点与胚胎成活率有关，通过对该基因多态性与性状的关联分析研究，可将该标记位点用于奶牛分子标记辅助育种以及提高体外受精胚胎成活率。