具有降低的α－D－半乳糖苷酶活性的咖啡植物制作方法

P·马拉奇尼, A·德塞, J·罗杰斯

2005年7月6日

2002年8月15日

2001年10月10日

雀巢产品有限公司

C12N15/82GK1635895SQ02820086

糖苷酶 半乳 活性 降低 具有

1.产生半乳甘露聚糖的咖啡植物细胞，其中半乳糖分支增加2.根据权利要求1的咖啡植物细胞，其中α-D-半乳糖苷酶活性的内源性水平降低3.根据权利要求1或2的咖啡植物细胞，其包含转录为以下核糖核酸的核酸，其中所述的核糖核酸与由α-D-半乳糖苷酶基因产生的mRNA或其部分反义4.根据权利要求3的咖啡植物细胞，其中转录为以下核糖核酸的核酸位于组成型或诱导型启动子的调控下，其中所述的核糖核酸与由α-D-半乳糖苷酶基因产生的mRNA或其部分反义5.根据权利要求5的植物细胞，其中启动子为咖啡csp1启动子6.包含根据以上权利要求中任意一项所述的植物细胞的咖啡植物7.制备可溶性咖啡的方法，其包括使用来自根据权利要求6的咖啡植物的咖啡豆的步骤8.增加咖啡可溶性的方法，其包括使用来自根据权利要求6的植物的咖啡豆的步骤9.来自根据权利要求6的咖啡植物的咖啡豆的用途，用于制备可溶性咖啡

本发明涉及通过降低α-D-半乳糖苷酶活性的内源性水平而修饰生咖啡豆中存在的半乳甘露聚糖具体地说本发明涉及具有降低的α-D-半乳糖苷酶活性的植物细胞和含有该植物细胞的植物在咖啡粒中，细胞壁多糖占成熟咖啡豆干重的大约48％，其中甘露聚糖占大约一半这些多糖的纯化形式基本上是不溶的并且具有很低的半乳糖分支(Bradbury和Haliday，农业食品化学杂志(J.agric.Food Chem.)38(1990)，389-392)认为甘露聚糖聚合物是在制备可溶性咖啡饮料时造成原来的生咖啡重量大量损失的主要原因这些损失出现在最初提取时不溶解的物质仍为沉淀或在咖啡溶液贮存时产生沉淀和凝胶形式甘露聚糖也显示是咖啡饮料放置期间形成混浊和沉淀的主要组分在一些植物中，认为甘露聚糖链上的半乳糖支化度部分取决于α-D-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)的活性该酶能从贮存在植物种子贮藏组织或成熟的半乳甘露聚糖释放α-1，6-连接的半乳糖单元(Buckeridge和Dietrich，植物科学(Plant Sci.)117(1996)，33-43)并且，在一些植物的胚乳或子叶组织中具有很低半乳糖/甘露糖比率的半乳甘露聚糖的累积显示出与这些组织成熟期间α-D-半乳糖苷酶活性高峰相关，并且与其硬化和干燥有关(Kontos和Spyropoulos，植物生理生化(Plant Physiol.Biochem.)34(1996)，787-793)α-D-半乳糖苷酶活性也与去除和半乳甘露聚糖多糖以α-1，6-连接的半乳糖残基的能力有关，该活性导致所述聚合物的溶解性降低(McCleary，Carb.Res.92(1981)，269-285)此外，从半乳甘露聚糖去除半乳糖侧链似乎增强它与其它多糖相互作用的能力，例如与瓜尔豆中的黄原胶相互作用，伴随复合胶的形成在成熟过程中，咖啡粒甘露聚糖上的半乳糖分支从未成熟粒中的大约40％降低到在成熟粒中以低水平存在同时，在咖啡粒成熟过程中α-D-半乳糖苷酶的酶活性增强已经克隆了咖啡的α-D-半乳糖苷酶cDNA(Zhu和Goldstein，基因(Gene)140(1994)，227-231)根据由其获得的信息推断成熟咖啡豆α-D-半乳糖苷酶由363个氨基酸组成，并合成为420个残基的前酶原生物合成后，两个蛋白酶切割去除一个分泌信号(38个残基)和另一个信号肽(19个残基)，以产生显示有活性酶的N-末端氨基酸序列特征的蛋白质由于已知半乳甘露聚糖对可溶性咖啡的制备和/或耐贮性的作用，需要在本领域中改善这种状况因此，本发明的一个目的是提供制备可溶性咖啡的改良方法，并同时避免贮存咖啡溶液时公知的缺陷以上问题通过分别提供其中半乳甘露聚糖的半乳糖分支增加的咖啡植物细胞、咖啡植物而得到解决根据一个优选的实施方案本目的可通过降低α-D-半乳糖苷酶活性的内源性水平而达到这可使用本领域有用的技术通过突变和筛选的常规方法来达到因此，可对植物细胞进行诱变处理，例如通过将它们暴露于化学品或辐射使细胞的DNA改变对这样处理的细胞随后进行筛选以获得所需特性根据另一个优选的实施方案降低α-D-半乳糖苷酶活性的内源性水平可通过将包含这样的核酸或其部分的构建体导入到咖啡植物细胞而获得，其中所述的核酸转录为α-D-半乳糖苷酶基因编码的mRNA的反义拷贝为了这个目的，α-D-半乳糖苷酶基因编码的mRNA的反义拷贝可为能在生理条件下形成二聚体的任意核糖核酸，即在细胞的优势条件下其可与α-D-半乳糖苷酶基因编码的mRNA杂交因此，反义拷贝不必与相应的配对物100％同源，但需要提供足够的结合用以形成二聚体因此，通过核苷酸的替换、缺失和/或插入而修饰的反义拷贝(和由它们转录的相应核酸)均正好在本发明的范围内在这方面，也值得一提的是反义拷贝可代表α-D-半乳糖苷酶基因编码的mRNA的全长配对物，即它可提供与编码α-D-半乳糖苷酶多肽的mRNA基本上具有相同长度的RNA分子另一方面，反义拷贝可只覆盖编码α-D-半乳糖苷酶多肽的mRNA的一部分编码如下核糖核酸的核酸可处于组成型或诱导型启动子的控制下，其中所述核糖核酸与α-D-半乳糖苷酶基因编码的mRNA或其部分反义，这样可便于控制反义RNA的水平但是，在所有的情况下反义拷贝的水平应足够高以至于降低可到达核糖体的编码α-D-半乳糖苷酶多肽的mRNA拷贝数根据一个优选的实施方案，使用的启动子是产生足够高转录率的咖啡cspl启动子因此本发明分别提供了这样的经修饰咖啡植物细胞和咖啡植物，其中α-D-半乳糖苷酶活性水平降低使最终的半乳-甘露聚糖上半乳糖分支增加根据一个优选的实施方案该植物为转基因植物，其细胞含有能提供来源于α-D-半乳糖苷酶基因的mRNA或其部分的反义拷贝的构建体本发明也提供了制备可溶性咖啡的方法，它包括使用来源于显示有降低的α-D-半乳糖苷酶活性的植物的咖啡豆的步骤在这方面本发明也提供了通过增加半乳糖分支增加咖啡可溶性的方法本发明目的在于通过增加半乳-甘露聚糖的半乳糖分支增加咖啡半乳-甘露聚糖的可溶性所采用的策略是降低α-D-半乳糖苷酶活性的内源性水平，优选地通过在咖啡cspl启动子控制下导入所述酶cDNA的反义拷贝已经对该csp1启动子的特性进行了描述(Marraccini等人，植物生理生化(Plant Physiol.Biochem.)37(1999)，273-282)，该启动子调控编码咖啡11S贮藏蛋白的基因的表达构建了包含所述启动子的盒并导入到来源于pTiT37质粒(Bevan，核酸研究(Nucl.Acids Res)12(1984)，8711-8721)的转化用双元载体的T-DNA区该重组载体导入到用于转化咖啡外植体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)内将含有插入其基因组的T-DNA的咖啡植物进行再生并分析其咖啡粒中的α-D-半乳糖苷酶活性I.成熟期间咖啡粒中α-D-半乳糖苷酶活性的分析从温室(温度大约25℃、湿度70％及自然光)中生长的阿拉伯咖啡(Coffea arabica)卡图拉T2308(Caturra T2308)品种成熟的不同阶段(年龄表示为开花后的周数WAF)收获果实收获后的樱桃样果实于液氮中冷冻并置于-85℃保存直至应用对于成熟研究，将胚乳和外胚乳组织进行分离将植物材料在液氮中研碎并用冰冷的酶提取缓冲液(甘油10％ v/v、偏亚硫酸氢钠10mM、EDTA 5mM、MOPS(NaOH)40mM、pH 6.5)以大约20mg每100μl的比例进行提取混合物置冰上搅拌20分钟，离心(12,000g×30分钟)，分装并置于-85℃保存直至应用用底物对硝基苯基-α-D-半乳吡喃糖苷(pNGP)在分光光度计上检测α-D-半乳糖苷酶活性反应混合物包含200μl在McIlvain′s缓冲液(柠檬酸100mM-Na2HPO4200mM pH 6.5)中的pNGP 100mM，用酶提取物加至终体积1ml在26℃维持反应，加入酶起始反应以及加入4倍体积的终止液(Na2CO3-NaHCO3100mM pH 10.2)终止反应在405nm读吸光值硝基苯基的形成用摩尔消光系数ε＝18300(pH 10.2时的特定值)进行计算并转换为mmol/分钟/mg蛋白质通过Bradford法(生物化学分析(Anal.Biochem.)72(1976)，248-254)对含水缓冲液提取的样品的总蛋白量进行测定对于活性的表达，将每一样品进行提取并分装，每个分析进行3次重复，结果用平均值表示在未成熟粒阶段α-D-半乳糖苷酶活性非常低或检测不到，该酶活性在果皮颜色变红的同时达到高峰在晚期阶段当樱桃样果实仍然为红色时活性降低对咖啡植物的不同组织中的活性进行了比较外胚乳、根和叶中的活性特别低，接近最低检出量但是，胚乳中记录到高活性，活性在大约36 WAF达到高峰，吸水后的发芽粒也记录到高活性II.从阿拉伯咖啡分离α-半乳糖苷酶全长cDNA虽然在文献可获得几种咖啡α-D-半乳糖苷酶cDNA序列，但其中咖啡材料的来源没有指明为了了解阿拉伯咖啡和坎尼佛拉咖啡(C.canephora)之间氨基酸和核酸序列的差异，决定对两个物种的α-D-半乳糖苷酶cDNAs进行克隆根据Rogers等人所述(植物生理生化(Plant Physiol Biochem)，37(1999)，261-272)用在开花后30周提取的polyA+mRNA构建了阿拉伯咖啡卡图拉T2308品种的cDNA文库该质粒cDNA文库(10ng)用直接从咖啡α-D-半乳糖苷酶cDNA序列(Zhu和Goldstein，1994)推导的引物BETA1(SEQ ID NO2)和BETA3(SEQ ID NO3)进行PCR检测引物BETA1位于SEQ ID NO1序列内的核苷酸177和193位之间引物BETA3位于SEQ ID NO1序列内的核苷酸1297和1313位之间用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，11011 North Torrey Pines Road，La Jolla，加利福尼亚92037，美国)在适当的1X缓冲液、每种dNTP 0.2mM和每种寡核苷酸0.25μM中进行PCR反应变性、退火和延伸温度分别为94℃、30秒，46℃、30秒和72℃、3分钟该循环用Robocycler Statagene(美国)重复30次PCR产物用Microcon 100(Millipore SA，BP307 SaintQuentin Yvelines cedex 78054，法国)柱纯化并按Stratagene(美国)所述连接到pCR-Script SK(+)中然后将连接混合物转化大肠杆菌菌株XLl-Blue MRF′并将包含α-D-半乳糖苷酶片段的重组载体进行纯化并克隆至pCR-Script SK Amp(+)的SfrI位点其序列位于序列SEQ ID NO1的177和1313位之间根据文献，α-D-半乳糖苷酶cDNA的5′末端包含位于引物BETA1 5′末端上游的198bp为了从我们的基因型中克隆该序列，我们用引物BETA100(SEQ ID NO3)和BETA101(SEQ ID NO4)又进行了一次如前所述的PCR将该阿拉伯咖啡序列克隆至pCR Script Amp SK(+)载体得到pLPl，其对应于SEQ ID NO1获得的cDNA包含一个1263bp的开放读码框，在序列SEQ ID NO1的51位起始并在1313位结束该翻译产物对应于序列SEQ ID NO2，提示咖啡α-D-半乳糖苷酶用51位的翻译起始密码ATG而不是126位的ATG合成前酶原另一方面，对从坎尼佛拉咖啡克隆的α-D-半乳糖苷酶cDNA的分析显示其翻译产物与阿拉伯咖啡发现的蛋白质非常同源(相似性＞99％)III.咖啡粒成熟期间α-D-半乳糖苷酶基因的表达对不同发育阶段，即开花后(WAF)9、12、16、30和35周收获的阿拉伯咖啡卡图拉咖啡豆中编码α-半乳糖苷酶基因的表达进行监控为此，这些咖啡豆的10μg总RNAs在存在甲酰胺(50％)和甲醛(终浓度0.66M)的1xMOPS缓冲液(20mM MOPS、5mM乙酸钠、1mM EDTA、pH 7)中65℃变性15分钟然后将它们在存在1xMOPS缓冲液时，于包含终浓度为2.2M甲醛的1.2-％琼脂糖凝胶上，以2.5V/cm电泳6小时进行分离迁移后，根据Sambrook等人所述(分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，美国1989，9.31至9.51章)将RNAs用溴化乙锭(BET)染色这使沉积在凝胶上的18S和25S核糖体RNAs的荧光强度的量能标准化根据Boehringer Mannheim(Roche-Boehringer Mannheim GmbH，Biochemica，Postfach 310120，Mannheim 31，DE)提供的建议，然后将总RNAs转移并固定到带正电荷的尼龙膜上根据上述条件进行预杂交和杂交Northern印迹结果证实在胚乳发育的早期阶段有基因表达高峰在温室条件下特异mRNA表达峰出现在约26WAF，并与酶活性开始增强相应mRNA表达的高峰阶段与在这些条件下成熟粒内发生的胚乳扩张和硬化的主要时期相应α-半乳糖苷酶特异的mRNA的峰表达与11S粒贮藏蛋白mRNA的峰表达一致或稍晚这些结果导致了构建在11S咖啡启动子控制下编码α-半乳糖苷酶的咖啡cDNA的反义盒，以降低成熟咖啡粒中α-半乳糖苷酶活性水平IV.α-半乳糖苷酶反义盒的构建用与序列SEQ ID NO7相应的特异引物UP210-1和与序列SEQ IDNO8相应的特异引物BAGUS2，对咖啡的11S启动子序列(Marraccini等人，植物生理生化37(1999)，273-282)进行扩增寡核苷酸UP210-1与Marraccini等人(见上)发表的核苷酸24和76位之间的序列相应，并且在其5′末端包含合成序列CGGGGTACCCCG，其中所述合成序列包含一个KpnI限制性位点并与序列SEQ ID NO9对应引物BAGUS2在其5′末端包含的合成序列CGCGGATCCGCG与有一个BamHI限制性位点的序列SEQ ID NO10对应该引物也包含Marraccini等人(1999)所发表序列的核苷酸998至976位该反应在存在Pfu DNA聚合酶(3个单位)，含10ng pCSPP4(WO99/02688)，10mM KCl、6mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl，pH 8.0、0.1％ Triton X-100、2mM MgCl2、10μg/ml BSA、每种dNTP 0.2mM、每种寡核苷酸0.25μM，终体积为50μl时如上所述进行然后将该反应混合物孵育30个循环(94℃、60秒，55℃、60秒，72℃、3分钟)接着72℃、7分钟进行最后的延伸循环约950bp的PCR片段在Mieroeon 100柱(Millipore，法国)上进行纯化，并根据供应商提供的建议，在T4 DNA连接酶存在下连接至pCR-Script Amp SK(+)载体(Promega Corporation，2800 Woods HollowRoad，Madison，威斯康辛53711美国)然后，将所有的连接混合物转化大肠杆菌菌株XL1-Blue MRF′筛选一个转化子并纯化其质粒，对插入序列进行测定，以确定PCR片段的方向该分析使筛选质粒pLP7成为可能除了用具有核酸序列SEQ ID NO11的引物UP213-1代替引物UP210-1外，用同样的方法扩增较短的11S启动子该引物与Marraccini等人(见上)发表的核苷酸754和777位之间的序列对应，并在其5′末端包含合成序列SEQ ID NO9这导致扩增出p11S咖啡启动子的250bp片段，将该片段按如前所述进行克隆获得质粒pLP8除了应用具有核酸序列SEQ ID NO12的引物TNOS1和具有核酸序列SEQIDNO13的引物TNOS2外，按扩增p11S启动子所描述的方法扩增TNOS终止子TNOS1在其5′末端包含序列SEQ ID NO10TNOS2在其5′末端包含序列SEQ ID NO9这些引物导致从p35SGFP商品化载体(Clontech Laboratories Inc.，1020 East Meadow Circle，Palo Alto，加利福尼亚94303-4230美国)扩增到TNOS序列如上所述，将该PCR产物克隆至pCRScript Amp SK(+)载体，获得名为pLP32的重组载体并进行测序以确定其方向该载体然后用BamHI消化以移出TNOS序列，然后将该TNOS序列用T4 DNA聚合酶处理以提供平端另一方面，pLP7和pLP8载体用EcoRI线性化并也用T4 DNA聚合酶处理以提供平端然后将TNOS终止子以正确的方向克隆至pLP7和pLP8载体，分别获得载体p11STNOS7和p11STNOS7+除了应用具有核酸序列SEQ ID NO14的引物BETA100B1和具有核酸序列SEQ ID NO15的引物BETA101B1外，用上述条件从之前分离的载体pLP1扩增α-半乳糖苷酶cDNA这些寡核苷酸对应于之前所用的引物BETA 101和BETA 100，只不过是在这些寡核苷酸的5′末端导入了对应于序列SEQ ID NO10的BamHI限制性位点如前所述，将该PCR产物克隆入pCR-Script Amp SK(+)载体，获得重组载体pLP20质粒用BamHI消化以释放α-半乳糖苷酶cDNA在另一面，受体载体p11STNOS7和p11STNOS7+独立地用同样的限制性酶消化并根据供应商建议(Promega，美国)用CIAP处理去磷酸化将该α-半乳糖苷酶cDNA以反义方向分别克隆至p11STNOS7和p11STNOS7+载体，获得名为pALPHAl和pALPHA9的载体为了将这些盒克隆入咖啡细胞悬液转化期间应用的双元载体内，用具有核酸序列SEQ ID NO16的引物UPSAL1和具有核酸序列SEQ ID NO17的引物UPSAL2，使用pfu DNA聚合酶进行最后的PCR反应这两条寡核苷酸都包含一个SalI限制性位点并识别pCR Script Amp SK(+)载体中11S启动子和NOS终止子(TNOS)DNA区侧翼的DNA序列此外，该限制性位点在欲导入到双元质粒的T-DNA的序列中不存在这些PCR产物再克隆至pCR-Script Amp SK(+)载体，该载体用SalI消化以证实该限制性位点在盒的侧翼获得的质粒称为pALP414和pALP50，分别来自于pALPHAl和pALPHA9V.克隆该α-半乳糖苷酶反义盒于用于转化的双元载体中对载体pALP414和pALP50包含的α-半乳糖苷酶盒进行序列测定以验证其完整性，特别是确定在PCR扩增循环期间没有发生点突变或重排然后通过将pALP414和pALP50载体用SalI限制性酶消化而对这些盒进行纯化并单独克隆到pBin 19衍生质粒，所述质粒涉及Leroy等人所述的载体(Plant Cell Rep.19(1999)，382-389)，除了crylAc基因不存在外为此，载体用可识别uidA和csr1-1基因之间单一位点的SalI限制性酶消化并去磷酸化连接后，对载体pBIA121、pBIA126和pBIA9进行筛选在pBIA121载体中，从pALP414获得的SalI盒以[LB]Gus-内含子＞p11S(长)反义α-半乳糖苷酶cDNA＞csr1-1[RB]的方向进行克隆但是，同样的盒以反方向克隆至pBIA126载体中另一方面，从pALP50获得的SalI盒以下列方向克隆至pBIA9载体中[LB]Gus-内含子＞p11S(短)反义α-半乳糖苷酶cDNA＞csr1-1[RB]VI.根癌农杆菌的转化根据An等人所述的直接转化法(植物分子生物学手册(Plant Mol.Biol.Manuel)，Gelvin，Schilperoort和Verma编辑，Kluwer Academic PublishersDordrecht，荷兰 A3(1993)，1-19)，将上述用于转化的pBIA121、pBIA126和pBIA9双元载体独立地导入到卸甲根癌农杆菌菌株LBA4404中对于每次转化，重组根癌农杆菌克隆在添加卡那霉素(50μg/ml)、链霉素(100μg/ml)和利福平(50μg/ml)的LB培养基上进行筛选为了检查导入到根癌农杆菌中的质粒的结构，将质粒通过快速小量制备技术进行提取并在反转化至大肠杆菌菌株XL2 Blue MRF′后通过限制性图谱进行分析VII.咖啡物种的转化将叶外植体进行培养并每隔5周进行传代培养，培养3至5个月直至外植体边缘出现体细胞胚在鱼雷期收获体细胞胚，用无菌手术刀割破并在包含OD600nm为0.3至0.5的重组根癌农杆菌菌株LBA4404的0.9％NaCl溶液中浸泡2小时在黑暗中于没有激素的半固体MS培养基上共培养3天，然后用包含头孢噻肟(1gr/l)的液体MS培养基在持续但温和的搅拌下洗涤3至5小时胚在存在头孢噻肟(400mg/l)的含5μM BAP、90μM蔗糖的半固体培养基上在低光照条件下(每天16小时的光周期)进行培养3至4周后，将它们转移到添加头孢噻肟(400mg/l)和氯磺隆(chlorsulfuron)(80mg/l)的MS选择培养基然后，每个月将它们转移到新的选择培养基直至愈伤组织再生然后将愈伤组织周围生长的转化胚在有Morel维生素(1μM BAP和30μM蔗糖)的半固体MS培养基上进行培养以诱导它们发芽这个步骤后，将它们转移到上述没有BAP的培养基所对应的生根培养基上为检查转化的效果，通过GUS组织化学法(Jefferson等人，欧洲分子生物学组织杂志(J.EMBO)6(1987)，3901-3907)对愈伤组织、茎干、根和叶常规检测uidA报道基因的表达在这个步骤后，筛选几株单植株并通过微切体外繁殖它们中的一些转移到温室内完成它们的发育没有观察到形态学异常VIII.来自转化咖啡植物的体细胞胚的分析也从叶外植体诱导体细胞胚以检测α-半乳糖苷酶反义mRNA的存在在体细胞胚内也检测到了11S咖啡贮藏蛋白(Yuffa等人，Plant Cell Rep.13(1994)197-202)，提示cspl启动子在该组织内有活性如果这样的话，从未成熟转基因咖啡植物的叶诱导的体细胞胚的分析使得检测α-半乳糖苷酶反义mRNA的存在要比检测咖啡豆中的存在早然后按上述从100mg经转化的体细胞胚提取总RNAs并用AccessRT-PCR系统试剂盒(Promega，美国)进行RT-PCR检测首先，11S特异mRNA的存在通过用位于11S cDNA编码序列中的引物进行RT-PCR得到证实用对应于序列SEQ ID NO18的引物SO11和对应于序列SEQID NO19的引物SO2-1进行该反应引物SO11对应于Marraccini等人(见上文)所发表序列的核苷酸1035和1059位之间的序列另一方面，引物SO2-1对应于所发表序列的最后24个核苷酸第一链cDNA的合成(反转录步骤)按供应商所述进行(48℃、45分钟)PCR反应应用下列参数45个循环(变性94℃、60秒，退火52℃、90秒，延伸68℃、4分钟)最后68℃延伸7分钟从本实验获得了侧翼为引物SO11和SO2-1的11S cDNA序列相对应的1590bpPCR产物结果证实检测的所有组织即根、叶、花都不存在11SmRNA，但11S mRNA在坎尼佛拉咖啡的体细胞胚和在27WAF的咖啡豆中有效存在其次，在反转录阶段(条件1)期间，只用对应于序列SEQ ID NO21的引物B33进行RT-PCR反应检测α-半乳糖苷酶有意义mRNA的存在该引物对应于序列SEQ ID NO1的核苷酸1286至1314位的互补序列平行地，在反转录阶段(条件2)期间，只用引物B11进行α-半乳糖苷酶反义mRNA的检测该引物对应于序列SEQ ID NO1的核苷酸50至78位之间的序列反转录后(48℃、45分钟)，反应混合物94℃处理1分钟以灭活MMLV反转录酶加入条件1中消耗的寡核苷酸B11和条件2中消耗的寡核苷酸B33，并继续进行PCR反应45个循环(变性94℃、60秒，退火45℃、90秒，延伸68℃、4分钟)最后68℃延伸7分钟用来自未转化阿拉伯咖啡的体细胞，在条件1但不是条件2的实验观察到1310bp的扩增产物但是，对于从pBIA9载体转化的咖啡苗获得的体细胞胚，在实验用的条件2期间可检测到扩增产物，证实存在α-半乳糖苷酶反义mRNA序列表<110>雀巢产品有限公司<120>具有降低的α-D-半乳糖苷酶活性的咖啡植物<130>80331WO<150>EP 01124160<151>2001-10-10<160>21<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1442<212>DNA<213>阿拉伯咖啡(Coffea arabica)<400>1tgctccacaa agcagtggca attgagttga ttgatcaaca ccaatttacc atggccgctg60cttattacta ccttttttct agtaaaaaaa gccaccaaaa gctggtgctc cgagcttcgt 120tattgatgtt tttatgtttc ttggcggttg aaaacgttgg tgcttccgct cgccggatgg 180tgaagtctcc aggaacagag gattacactc gcaggagcct tttagcaaat gggcttggtc 240taacaccacc gatggggtgg aacagctgga atcatttcag ttgtaatctt gatgagaaat 300tgatcaggga aacagccgat gcaatggcat 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tccacggcag 1200tggttaatgc acgagactta tgggcgcatt caaccgaaaa atcagtcaaa ggacaaatct 1260cagctgcagt agatgcccac gattcgaaaa tgtatgtcct aaccccacag tgattaacag 1320gagaatgcag aagacaagtg atggttggct ctttcaagga tttgattacc ttaaagaatt 1380tttcacatgt tatgaatcaa ttcaaagcaa ttatgtgttt tgaagagatt aagtcaataa 1440at 1442<210>2<211>420<212>PRT<213>阿拉伯咖啡<400>2Met Ala Ala Ala Tyr Tyr Tyr Leu Phe Ser Ser Lys Lys Ser His Gln1 5 10 15Lys Leu Val Leu Arg Ala Ser Leu Leu Met Phe Leu Cys Phe Leu Ala20 25 30Val Glu Asn Val Gly Ala Ser Ala Arg Arg Met Val Lys Ser Pro Gly35 40 45Thr Glu Asp Tyr Thr Arg Arg Ser Leu Leu Ala Asn Gly Leu Gly Leu50 55 60Thr Pro Pro Met Gly Trp Asn Ser Trp Asn His Phe Ser Cys Asn Leu65 70 75 80Asp Glu Lys Leu Ile Arg Glu Thr Ala Asp Ala Met Ala Ser Lys Gly85 90 95Leu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Tyr Ile Asn Leu Asp Asp Cys Trp Ala100 105 110Glu Leu Asn Arg Asp Ser Gln Gly Asn Leu Val Pro Lys Gly Ser Thr115 120 125Phe Pro Ser Gly Ile Lys Ala Leu Ala Asp Tyr Val His Ser Lys Gly130 135 140Leu Lys 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