专利名称：大体上不含半乳甘露聚糖且含有哌拉西林(piperacillin)和他唑巴坦(tazobactam)的组合物的制作方法 Zosyn?是一种美国的抗生素商品且在许多其他国家以商品名Tazocin上市，其含有哌拉西林(piperacillin)钠和他唑巴坦(tazobactam)钠。所述产品揭示于美国专利第4,562,073号中。美国专利第4,477,452号和第4,534,977号揭示冻干形式的哌拉西林。Zosyn?是一种用于治疗中度至重度感染的抗生素。详细来说，Zosyn?是用于治疗由下列情形所引起的中度至重度感染在诸如由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的医院肺炎的情况下，微生物的哌拉西林抗药性、易受哌拉西林/他唑巴坦影响的产生β-内酰胺酶的菌株；由大肠杆菌(Escherichia coli)引起的腹内感染，尤其是阑尾炎(并发破裂或脓肿)和腹膜炎；由金黄色葡萄球菌引起的皮肤和皮肤组织感染，包括脂肪团、皮肤脓肿和缺血性/糖尿病性足部感染；及由大肠杆菌引起的妇科感染，尤其是产后子宫内膜炎或感染性盆腔疾病。这些感染的严重性突出对易于利用和可靠的治疗方法的需要。不仅能将药剂调配成乳液、悬浮液或溶液，也能将其调配成使用前重构的冻干制剂。有利地，冻干制剂稳定，可储存且易于重构。而且，冻干制剂可保持无菌状态，同时基本上不含不可溶的物质。Zosyn?是以粉末的形式(冻干产品)来利用，在静脉内投药之前其是通过添加可相容的重构稀释剂得以重构。已发现Zosyn?含有痕量半乳甘露聚糖，所述半乳甘露聚糖是一种衍生自真菌细胞壁且于发酵过程中形成的碳水化合物聚合物。已表明半乳甘露聚糖的存在干扰侵袭性曲菌病(IA)的某些诊断测试并提供假阳性反应。尽管存在半乳甘露聚糖，但其不会使患者的健康风险增加。本发明克服Zosyn?医药组合物中存在半乳甘露聚糖的不利之处。
已发现Zosyn?含有痕量半乳甘露聚糖，即一种衍生自真菌细胞壁的碳水化合物聚合物。然而，虽然存在半乳甘露聚糖，但不会使患者的健康风险增加。侵袭性曲菌病(IA)是一种最常见于免疫损害患者中的致命性真菌感染。血清中循环曲菌半乳甘露聚糖抗原的存在是侵袭性曲菌病(IA)(即一种致命性真菌感染)的指示。通常使免疫损害患者经受Zosyn?的预防性治疗以预防细菌感染。对患者体内侵袭性曲菌病的诊断通常是基于血清学方法通过检测曲菌半乳甘露聚糖的存在来进行。然而，当使用某些诊断试剂盒时，Zosyn?中痕量半乳甘露聚糖的存在导致对IA的假阳性测试结果。将半乳甘露聚糖自Zosyn?中移除对于消除或减少使用所述试剂盒时可能的IA假阳性诊断测试结果极为有益。
本发明向此项技术中提供一种预混合哌拉西林或哌拉西林-他唑巴坦的新型医药组合物，其避免半乳甘露聚糖的存在，且可用于治疗或控制由非经肠投药所引起的细菌感染，所述组合物包含有效量的(a)哌拉西林或其医药学可接受的盐(通常为哌拉西林钠)，和(b)他唑巴坦或其医药学可接受的盐(通常为他唑巴坦钠)。根据本发明的医药组合物可为(A)在非经肠投药之前可通过添加可相容的重构稀释剂重构的粉末形式，(B)现成用于非经肠投药的形式，或(C)可经解冻且现成用于非经肠投药的冷冻形式。本发明提供大体上不含半乳甘露聚糖的本发明组合物。
本发明进一步包括一种用于制备大体上不含半乳甘露聚糖的冻干医药组合物的方法，所述方法包含下述步骤a)在水性溶剂中溶解哌拉西林及他唑巴坦形成溶液，且将pH值调至约6.5；b)使所述溶液通过一截止过滤器过滤；c)收集滤液；d)在一冷冻干燥器中将所述滤液冷冻至-35℃以下的温度；e)将所述冷冻干燥器抽空至约300μM Hg(微米汞柱)(40帕斯卡(pascal))的压力，且将所述冷冻干燥器加热至约+5℃；f)保持所述温度和压力一段足以将水自所述水性溶剂中移除的时间，形成冻干固体；g)在约+45℃下，干燥所述冻干固体。
本发明也包括一种用于制备医药组合物的方法，所述医药组合物为可在向哺乳动物投药前通过添加可相容的重构稀释剂重构的粉末形式，或为在向哺乳动物投药前当解冻时可经可相容稀释剂稀释的冷冻组合物形式，所述方法包含冷冻或冷冻干燥在水性媒剂中大体上不含半乳甘露聚糖而含有有效量(a)哌拉西林或其医药学可接受的盐，(b)他唑巴坦或其医药学可接受的盐的溶液。


无

本发明组合物提供用于投药的优于哌拉西林和哌拉西林-他唑巴坦其他形式的益处。详细来说，本发明提供一种大体上不含半乳甘露聚糖的组合物。在Zosyn?组合物中不存在半乳甘露聚糖的情况下，也不存在对用于测定侵袭性曲菌病的抗体测试的干扰和假阳性测试结果。移除或减少半乳甘露聚糖的关键在于约3kD mw至约10kD mw的适当截止过滤器的使用。半乳甘露聚糖于所述过滤器上收集，而哌拉西林或哌拉西林-他唑巴坦则穿过所述过滤器且存在于所收集的滤液中。优选为约3kD分子量的截止过滤器。更优选为约5kD的截止过滤器。
移除或减少半乳甘露聚糖是以下述方式进行制备约(10mg/ml)的Zosyn?水溶液。将所述溶液应用于数个微型离心过滤器装置(Pall Life Sciences)上，并且以10,000×g离心所述过滤器。此程序促使所述溶液穿过超滤膜。通过所述膜基于分子量分离溶质。诸如哌拉西林和他唑巴坦的低分子量材料穿过超滤膜(滤液)，而分子量大于所述膜截止分子量的材料由过滤器有效地保留下来(保留物)。据报导，半乳甘露聚糖具有25,000至75,000的高分子量；哌拉西林和他唑巴坦具有＜1000的低分子量。当将含有半乳甘露聚糖的Zosyn?溶液应用于3000mw的截止过滤器上并旋转时，发现半乳甘露聚糖存在于保留物(R)中。滤液(F)含有哌拉西林和他唑巴坦组份，且测试所述滤液的半乳甘露聚糖呈阴性。类似结果也见于用5-kD膜之情形。使用10-kD截止过滤器所发现的结果表明发现滤液中存在少量半乳甘露聚糖。重要的是，虽然如此，但当与原材料相比较时，滤液中哌拉西林和他唑巴坦的强度并无损失。在所述进展之后为高压液相色谱(HPLC)的典型实验中，在超过滤之后获得下述结果。
1.Zosyn?他唑巴坦的回收率—100.3％哌拉西林单水合物的回收率—99.0％2.哌拉西林—100.1％3.氨比西林(Ampicillin)—99.8％此方法易适合于使用当前可用的超过滤(UF)装置和膜的商业操作的生产规模。
可通过超过滤将半乳甘露聚糖自Zosyn?有效地移除。工作已显示过滤穿过适当的分子截止膜过滤器使高分子量的半乳甘露聚糖与低分子量的Zosyn?组份分离。在商业操作中，可使用透滤法以作为截止过滤器超过滤的一部分的膜过滤器进一步实现半乳甘露聚糖的进一步移除及哌拉西林和他唑巴坦回收率的增加。透滤作用中的膜过滤器保留半乳甘露聚糖，且允许Zosyn?组份穿过并在滤液中得以收集。也可通过适当的膜过滤器将半乳甘露聚糖自6-氨基青霉素酸(6-APA)和氨比西林中移除。
实验方案标题使用BIO-RAD Platelia? Aspergillus EIA法评估Zosyn?、活性医药成份(API′s)和其他抗生素中半乳甘露聚糖的存在1.目标此方案的目标是描述使用BIO-RAD Platelia? Aspergillus EIA试剂盒评估不同批次Zosyn?、API和其他抗生素中半乳甘露聚糖抗原存在的实验设计。
2.材料和设备2.1样品和试剂1.样品Zosyn?2.250克/瓶Zosyn?4.5克/瓶Tazoxil 4.5g(Zosyn?类)，来自BrazilTazac 4.5g(Zosyn?类)，来自India哌拉西林他唑巴坦4.5g(Zosyn?类)Richet(Argentina)此方案中包括其他产品以评估其在BIO-RAD Platelia? Aspergillus EIA诊断试剂盒中的反应。
2.Platelia? Aspergillus EIA(BIO-RAD，Redmond，WA)，第62793号(96测试试剂盒)或第62794号(480测试试剂盒)2.2设备1.微板读数器Dynex MRX ELISA板读数器2.Ultrawash II自动洗涤器/通风器，Dynex3.生物安全柜4.沸水浴5.培养箱6.涡动搅动器7.无菌管、无菌手套和无菌移液管头8.微量吸管3.环境控制试剂、样品和样品稀释液的制备将在生物安全柜中于无菌条件下进行。
4.测试地点在Chemical Process Development Biochemistry Laboratory，Wyeth Research，PearlRiver，NY.进行Zosyn?实验。
5.分析原理和程序5.1分析原理Platelia? Aspergillus EIA是一种用于检测人类血清中半乳甘露聚糖的三明治式免疫酶微板一步分析法(one-stage immunoenzymatic sandwich microplate assay)。使用大鼠单克隆抗体EBA-2俘获抗原，接着使用过氧化酶偶联抗体检测所述抗原。将样品的吸光度值与“截止”控制的吸光度值相比较，由此测定半乳甘露聚糖的指数/相对浓度。
5.2程序参考描述试剂制备、逐步的分析程序及处理所述试剂和样品的安全说明的BIO-RADPlatelia? Aspergillus EIA试剂盒用户指南。
样品制备在USP级(美国药典)注射用(WFI)水或任何其他适当的稀释剂中重构，并制得所需浓度的稀释液。
样品的稀释可因上述试验的结果而改变。
6.实验设计6.1产品评估1.Zosyn?评估分析注射用水(WFI)/磷酸盐缓冲溶液(PBS)或其他适当基质中所需浓度的Zosyn?的瓶。
2.评估活性医药成份(API)分析注射用水(WFI)/磷酸盐缓冲溶液(PBS)中哌拉西林和他唑巴坦以及其他可用中间物的瓶。
3.Zosyn?类和/或其他抗生素分析WFI/PBS中所需浓度的其他可用Zosyn?类/抗生素。
6.2过滤研究Zosyn?1.使用适当的分子量截止旋转过滤器过滤经重构的样品，并测试所需浓度下的滤液。适当时评估其他有关过滤效力的研究。
3.验收标准截止控制每一(2)截止控制血清孔的光学密度(OD)450必须介于0.3与0.8之间。每一个别值应符合说明书规定。
平均截止控制是两个孔读数的平均值(参看BIO-RAD试剂盒说明)。
阳性控制阳性控制血清的指数必须大于2。
阴性控制阴性控制血清的指数必须小于0.4。
所述控制的任一者不满足所述标准即使得分析无效。
为测定实验样品的指数，通过平均截止控制划分测试样品的吸光度(OD450)。认为大于0.5的指数为阳性结果。认为小于0.5的指数为阴性结果。
4.参考说明Platelia? Aspergillus EIA指南(BIO-RAD，Redmond，WA)I＝OD阳性控制(R5)＞2平均截止控制ODI＝OD阴性控制(R3)＜0.4平均截止控制OD通过高效液相色谱测定水性样品中的ZOSYN?(哌拉西林/他唑巴坦)强度和其鉴定1.方法概述溶解一部分Zosyn?样品并用稀释溶剂加以稀释，随后于反相管柱上进行层析分离(USP 23 NF18，第25卷，第7497页，增刊6，第3722页)。通过将样品制剂色谱图中的个别峰响应与伴随获得的标准色谱图的个别峰响应相比较来测定哌拉西林和他唑巴坦的强度。通过将样品制剂色谱图中个别峰的保留时间与标准制剂色谱图中个别峰的保留时间相比较来鉴定哌拉西林和他唑巴坦。哌拉西林注射溶液的方法报告极限为0.16μg/mL。他唑巴坦注射溶液的方法报告极限为0.077μg/mL。
2.特殊设备色谱柱—长约25cm，内径约4.6mm，填充有Phenomenex Luna C18(2)，5μm大小的颗粒。
注意可使用长150mm至300mm的管柱，但限制条件为满足系统适用性的要求。
泵—能够在高达5000psi的压力下操作的恒流量泵。
检测器—能够在220nm下操作具有约1.0满刻度吸光度单位的灵敏度的紫外分光光度计检测器。
注射器—能够重现注射并保持5℃样品盘温度的任何手工注射器或自动注射器。
积分器—优选为电子积分。
记录器—任选。与所述检测器的操作输出电压相匹配的记录装置。
膜过滤器—孔径0.45μm，尼龙-66膜过滤器。
管柱温度控制器—能够维持30℃的管柱温度。
3.试剂和材料甲醇—HPLC级。
单碱磷酸钠—(NaH2PO4)试剂级。
四丁基氢氧化铵0.4M—试剂级。
磷酸—85％，试剂级。
水—HPLC适用。
0.2M单碱磷酸钠缓冲溶液—称取27.6g单碱磷酸钠并用水稀释至1L。
20％磷酸溶液—用水将23.5mL 85％的磷酸稀释至100mL并混合。
2％磷酸溶液—用水将2.4mL 85％的磷酸稀释至100mL并混合。
稀释溶剂—流动相。
流动相—测量447mL水，添加100mL0.2M单碱磷酸钠缓冲溶液，移入3.0mL四丁基氢氧化铵并添加450mL甲醇。混合。冷却至室温。用20％磷酸溶液将溶液的pH值调至约5.6，且接着用所述2％磷酸溶液调至5.50±0.02。如果需要，则使其过滤穿过0.45μm孔径的膜过滤器。需要时脱气。
哌拉西林参考标准品—已知强度(S)的哌拉西林。
他唑巴坦参考标准品—已知强度(S)的他唑巴坦。
4.设备准备1.将检测器的波长设定至220nm且灵敏度为约1.0的满量程吸光度单位。(所述灵敏度设定可视所使用的设备而变化)。
2.将流率设定为每分钟0.8mL(每分钟0.5-1.2mL是可接受的)。
3.将管柱温度控制器设定至30℃。
4.将注射器/自动进样器的温度控制器设定为5℃。
5.通过管柱泵入流动相直至获得稳定的基线(通常约15×管柱体积)。
5.标准品的制备1.准确称取约24mg他唑巴坦参考标准品及20mg哌拉西林参考标准品于2个独立的50ml容量瓶中。
2.用数滴甲醇溶解所述标准品(需要时用声波处理)，并用稀释溶剂将他唑巴坦稀释至容积。此为他唑巴坦标准储备溶液。
3.将5.0mL他唑巴坦标准储备溶液移入哌拉西林的烧瓶中。用稀释溶剂稀释至容积并混合。此为哌拉西林/他唑巴坦标准制剂，(分别为约400和48μg/mL)。这些都用于单一点的标准计算。
4.(仅当分析媒剂/对照样品时需要此步骤。)将2.0mL哌拉西林/他唑巴坦(400/48μg/mL)标准制剂移入100mL容量瓶中，并用稀释溶剂稀释至容积。将2.0mL所述溶液各移入100和25mL容量瓶中，并用稀释溶剂稀释至容积。这些溶液分别为哌拉西林和他唑巴坦的报告极限标准制剂(第一个溶液为约0.16μg/mL哌拉西林且第二个溶液为0.077μg/mL他唑巴坦)。对于每一个所述制剂而言，仅使用相应的浓度。
注意1已确定哌拉西林的线性度为100至500μg/mL。已确定他唑巴坦的线性度为10至100μg/mL。可采用成比例变小或变大的标准质量，其限制条件为由此调整任何随后的稀释以得到处于线性范围内的标准制剂浓度。如果如此，则必须对计算进行适当的调整。
注意2其他稀释方案也是可能的，但限制条件为最终的稀释和注射浓度处于所述线性范围内。如果如此，则必须对计算进行适当的调整。
6.样品制备基于所要求的样品浓度，在稀释溶剂中进行必需的稀释以获得接近哌拉西林和他唑巴坦的单一点标准浓度(分别为约400和48μg/mL)的样品溶液浓度。对于典型的±2mL预测量样品而言，定量地转移整个样品。漂洗瓶、瓶盖和瓶颈外侧，将漂洗液加入稀释瓶中。
如果需要，则在漂洗过程中涡旋搅动所述样本瓶以移除所有样品。用稀释溶剂稀释至容积并良好混合。随后的任何稀释也应在稀释溶剂中进行。一次应处理一个样品以使注射前的时间减至最少。
注意1非典型样品可能需要一替代的制备程序。举例而言，采用等分的样品体积或浓度可为必需。
注意2对于哌拉西林的典型2mL样品以2∶10的比率稀释媒剂/对照物。对于他唑巴坦进一步以2∶10稀释样品。
如果预先称取样品，则应使用如下密度来计算初始样品的体积样本体积(mL)＝样品质量(g)/密度(g/mL)7.系统适用性1.在已获得一稳定基线后，注射10μL哌拉西林/他唑巴坦标准制剂三次，并获得哌拉西林/他唑巴坦参考标准品的色谱图。将这些注射用于系统适用性和计算。
2.计算哌拉西林的容量因子k′。所述容量因子必须为3.5或更高。如果并非如此，则制备新鲜的流动相，或替换管柱。
注意ta值(未保持的峰值的保留时间)可通过将60％管柱体积除以毫升/分钟为单位的流率来估算。对于规定的Phenomenex管柱而言，ta估算值为2.5毫升/(以毫升/分钟为单位的流率)。
3.根据USP指导，计算管柱的拖尾因子T。管柱拖尾因子必须不超过1.5。如果超过，则修复色谱系统和/或替换管柱。
4.根据USP指导，计算理论塔板数N。N值必须大于或等于3000。如果小于，则在可允许的范围内降低流率，替换管柱和/或修复色谱系统。
5.计算哌拉西林三次重复注射的RSD。所述RSD必须大于2.0％。
8.程序A.强度1.(仅当分析媒剂/对照样品时需要此步骤)。在分析过程中的某时刻，注射10μL稀释溶剂以获得空白色谱图。
注射10μL样品制剂和报告极限标准制剂，且在相关峰的保留时间时获得响应。
2.注射10μL样品制剂，且获得相关峰的响应。
B.鉴定1.注射哌拉西林/他唑巴坦各10μL，并获得个别峰的保留时间。
2.注射10μL样品制剂，并获得个别峰的保留时间。
9.计算A.强度1.由下述等式计算标准制剂的哌拉西林/他唑巴坦的浓度哌拉西林的毫克数/毫升＝(Wr)(S)/(50)他唑巴坦的毫克数/毫升＝(Wr)(S)(V1)/(50)(V2)其中Wr＝个别参考标准品的质量，mgS＝个别参考标准品的强度，十进制单位(decimal)V1＝用于制备标准制剂的标准储备溶液的体积，mL50＝标准储备溶液或标准制剂的体积，mLV2＝标准制剂的体积，mL2.哌拉西林和他唑巴坦由下述等式计算强度
哌拉西林或他唑巴坦的毫克数/毫升＝(Cs)(Rspl)(Dspl)/(Rstd)其中Cs＝由1起个别标准品的浓度，mg/mLRspl＝样品制剂的响应Dspl＝样品制剂的稀释因子Rstd＝个别标准制剂的平均响应B.鉴定1.使用下述表达式计算样品制剂色谱图中个别峰的相对保留值(Rr)Rr＝来自样品色谱图的个别峰的Rt/来自标准色谱图的个别峰的RtRt＝保留时间，分钟2.如果Rr为1.0±0.05，则报导恒等式为正，否则报导所述恒等式为负。
10.报告极限对此方法而言，哌拉西林注射溶液的报告极限为0.16μg/mL。
对于由2mL稀释至10mL的2mL媒剂/对照样品而言，此为0.8μg/mL。此方法的他唑巴坦注射溶液的报告极限为0.077μg/mL。对于由2mL稀释至10mL接着由2mL再次稀释至10mL的2mL媒剂/对照样品而言，此为1.92μg/mL。
过滤研究以100mg/ml将Zosyn?(一般商业样品)溶解于水中。以100mg/ml将哌拉西林溶解于饱和碳酸氢钠中。使用USP水将Zosyn?和哌拉西林稀释至10和1mg/ml。将10和1mg/ml Zosyn?(300μl)以及哌拉西林转移至具有10kD或3kD分子量截止过滤器的nanosep型旋转装置中。将样品放置于eppendorf离心机中并以10,000rpm离心10分钟。在离心的后期，收集通过物(pass-through)中的样品。使nanosep型旋转装置上部所保留的半乳甘露聚糖再悬浮于300μl水中用于分析。一般结果显示于以下实例1-4中。每一实例都显示半乳甘露聚糖的光学密度(OD)，以及所测定的实验样品指数。
结果Neg.CTL0.078，指数＝0.14C-O CTL0.534，0.554，平均光学密度(OD)＝0.544Pos CTL2.009，指数3.69实例110k(10kD)过滤器

*(R)为保留物(保留于过滤器上)**(F)在滤液中实例23K(3kD)过滤器

*(R)为保留物(保留于过滤器上)**(F)在滤液中实例310k(10kD)过滤器

*(R)为保留物(保留于过滤器上)**(F)在滤液中实例43k(3kD)过滤器

*(R)为保留物(保留于过滤器上)**(F)在滤液中实例5
实验活动包括(1)使用10L的批量大小调配Zosyn?本体产品；(2)通过具有至少5μm孔径的过滤器过滤所述本体溶液；和(3)通过超过滤/透滤技术将半乳甘露聚糖内容物自本体溶液中移除。在超过滤处理本体溶液期间进行多达10个浓度(10X)和6个透滤(6DV)过程的取样加工。
本体调配以浓度250mg/mL的哌拉西林和浓度31.25mg/mL的他唑巴坦调配发展批量的Zosyn?本体产品的本体溶液，且哌拉西林过量2％以驱动反应完成。此项研究中使用测试为半乳甘露聚糖(GM)阳性(使用Bio-Rad PlateliaTMEIA)的哌拉西林单水合物(PMH)原材料、批号2000084742。基于化学计量添加碳酸氢钠(限量试剂)。总批量大小为10L。称重数据概括于原材料表中。如所预期的，本体配方执行良好。出于方案的目的，未使所述产品本体溶液达到最终体积(Qs)。由于所述溶液达到6.0的pH值(可接受的pH极限值为6.8或更低)，故认为反应完成。在qs之前获得约八升(8L)的本体产品体积。出于此项研究的目的，未使所述产品本体溶液达到最终体积。原材料表中概括用于制备实验批料的不同调配成份。
原材料表

a.预期重量是使用方案CR-0169/04中所包括的相应等式计算得到。
b.材料是使用编号C1833A的台秤称取。
c.BMS是Bristol-Myers Squibb。
过滤一旦反应完成且在达到10L的最终体积之前，使本体产品通过0.2μm孔径的尼龙膜(CUNO? LifeASSURETM膜片)过滤器过滤。
超过滤/透滤方法通过使用5-kD Omega?膜(部件#OS005G02)进行超过滤(UF)过程。由于GM移除效率大于1、3和10kD膜，故选择以上膜尺寸。
使用总体积为6L的Zosyn?本体溶液来评估过滤系统的操作效率。UF系统是以37psi(42psi，最大压力)的进料压力和35psi(39psi，最大压力)的保留物压力来操作。在超过滤过程中，采用2X、4X、8X和10X浓度的渗透池样品。如表A所示，达成10X的浓度后，获得96％哌拉西林和86％他唑巴坦的回收率。
接着进行透滤处理，且通过完成6个透滤体积(2DV、4DV、5DV和6DV)来执行。如表B所示，所收集的数据证实四个透滤体积(4DV)后，哌拉西林和他唑巴坦都获得100％的回收率。
表A超过滤的质量平衡

表B透滤的质量平衡

目前，已对表A和表B中所包括的每一个样品进行GM检测测试。所获得的GM检测测试结果显示于表C中。
表C半乳甘露聚糖Bio-Rad PlateliaTM测试结果

表C半乳甘露聚糖Bio-Rad PlateliaTM测试结果

注意0.718，截止对照品的平均OD渗透池样品得到半乳甘露聚糖的阴性结果。所有测试结果都正好在已制定的说明书之中。


本发明涉及大体上不含或具有减少含量的半乳甘露聚糖的Zosyn