专利名称：光学活性的丙氧基苯胺衍生物的制备方法 S-(-)-9-氟-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧-2，3-二氢-7H-吡啶并[1，2，3-de][1，4]苯并噁嗪-6-羧酸(左氟沙星，LVFX；JP 62-252790 A)被认为是优异的合成抗菌剂。有一种化合物已知作为制备此合成抗菌剂的中间体，它用下式(V)表示 其中X1和X2分别独立地代表卤原子(以下称为“化合物(V)”；将使用类似的符号标记其他结构式)。已知可以通过以下方法制备此化合物(JP 1-250369 A和JP 2-723 A)。 这就是说，可以通过还原化合物(A)合成化合物(V)，通过预先用四氢吡喃基保护市售可得的乳酸酯的羟基制得化合物(A)、用氢化锂铝得到化合物(B)，在氢化钠存在的条件下处理化合物(B)和化合物(C)得到化合物(D)，然后除去四氢吡喃基，随后将硝基还原。乳酸酯作为化合物(A)的原料可以低成本市售得到，但这些酯的光学纯度多数局限在至多97％ee，所以它们不足以作为左氟沙星化合物的原料，后者需要满足至少99％ee的高纯度。对于制备化合物(B)，也发展了另一种不用任何乳酸酯方法(JP2-265701 A)。另一方面，由于安全性问题，大量氢化锂铝也难于进行还原操作。上述制备方法也需要较多的步骤。另外也有报道，从化合物(D)除去四氢吡喃基会产生不必要的消旋化(S.Chladek，Chem.Ind.(伦敦)，1719(1964))。由于上述问题，至今已用化合物((R)-2-苄氧基丙酸酯)进行了一些研究，其结构接近于化合物(A)，但不同之处在于用苄基代替四氢吡喃基。然而，除光学纯度至多达97％ee的低光学纯度的化合物外，尚不能得到其他任何化合物。左氟沙星作为药物需要有至少为99％ee的更高的光学纯度，但在中间步骤中非常难于提高光学纯度。光学纯度为97％ee或更低的(R)-2-苄氧基丙酸酯不能作为左氟沙星的原料。
因此，长期以来一直需要开发不受这些问题影响的制备方法。
本发明的另一个目的是提供制备作为抗菌剂的具有光学活性的丙氧基苯胺衍生物和左氟沙星的一种经济而有效的方法，并提供用于上述过程的中间体的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种有非对称的酯-水解能力，并通过使具有非对称酯水解能力的微生物的细胞在高压下破裂，然后用强阴离子色谱法、疏水性色谱法和强阴离子色谱法连续纯化这样破裂的细胞所得到的酶。
发明公开作为多方面研究的结果，本发明已发现一种方法，其特征在于用有非对称性酯水解能力的酶处理外消旋的乳酸衍生物，然后具体地水解作为此外消旋衍生物的成对化合物存在的异构体的酯部分，并且本发明还发现，当用通过此水解作用得到的化合物作为中间体时，有可能以比任何其他方法更低成本地，并通过较少的步骤，产生光学活性的丙氧基苯胺衍生物。另外，本发明已发现一种将在非对称的酯水解反应过程中作为不利的副产物的光学异构体通过将其外消旋化而再循环成底物的方法。基于这些发现，本发明人已发现可以高效率地制备有高光学纯度的左氟沙星化合物。因此，完成了本发明。
具体地，本方面发明提供了制备用下式(I-a)表示的光学活性化合物的方法 其中R1代表有1-6个碳原子的烷基，R2代表羟基保护基团，该方法包括用有非对称性酯水解能力的酶、培养的有非对称性酯水解能力的微生物的培养基、所述微生物的细胞或微生物细胞的加工产物处理用下式(I)代表的化合物，
其中，R1和R2有与上述定义相同的意义，得到混合物，并从混合物中分离和收集光学活性化合物(I-a)。
本发明也提供制备用下式(V)代表的化合物的方法 其中X1和X2各自独立地代表卤原子，此方法包括用有非对称性酯水解能力的酶、培养的有非对称性酯水解能力的微生物的培养基、所述微生物的细胞或所述微生物细胞的加工产物处理用下式(I)代表的化合物， 其中R1和R2有与上述定义相同的意义，得到混合物，并从混合物中分离、收集和得到用下式(I-a)代表的光学活性化合物 其中R1和R2有与上述定义相同的意义；在有存在于非醇溶剂中的伯醇的条件下，用金属氢硼化物处理化合物(I-a)，得到用下式(II)代表的化合物 其中R2有与上述定义相同的意义；在有碱存在的条件下处理化合物(II)和用下式(III)代表的化合物 其中X1和X2有与上述定义相同的意义，X3独立地代表卤原子，得到用下式(IV)代表的光学活性化合物 其中R2、X1和X2有与如上定义相同的意义；并且将化合物(IV)中的硝基转化处理成氨基，并同时除去R2。
本发明也提供了制备用下式(XII)代表的化合物的方法 其中X1有与如上所述相同的意义，此方法包括用有非对称性酯水解能力的酶、培养的有非对称性酯水解能力的微生物的培养基、所述微生物的细胞或微生物细胞的加工产物处理用下式(I)代表的化合物， 其中R1和R2有与上述定义相同的意义，
得到混合物，并从混合物中分离、收集和得到用下式(I-a)代表的光学活性化合物 其中R1和R2有与上述定义相同的意义；在有存在于非醇溶剂中的伯醇的条件下，用金属氢硼化物处理化合物(I-a)，得到用下式(II)代表的光学活性化合物 其中R2有与上述定义相同的意义；用碱处理化合物(II)和用下式(III)代表的化合物 其中X1和X2及X3有与上述定义相同的意义，得到用下式(IV)代表的光学活性化合物 其中R2、X1和X2有与如上定义相同的意义；将化合物(IV)中的硝基转化处理成氨基，并同时除去R2，得到用下式(V)代表的化合物
其中X1和X2有与上述定义相同的意义，使化合物(V)与用下式(VI)代表的化合物反应， 其中Y代表有1-6个碳原子的烷氧基、卤原子或二(C1-C6烷基)氨基，R3和R4分别独立地代表有1-6个碳原子的烷基，得到用下式(VII)代表的化合物 其中X1、X2、R3和R4有与上述定义相同的意义；使化合物(VII)与磺酰化合物反应，得到用下式(VIII)代表的化合物 其中R5代表取代或非取代的烷基磺酰基团或取代或非取代的芳香基磺酰基团，X1、X2、R3和R4有与上述定义相同的意义；在碱性条件下使化合物(VIII)进行闭环反应，得到用下式(IX)代表的化合物 其中X1、X2、R3和R4有与上述定义相同的意义；在有或无硼化物的条件下加热化合物(IX)，得到用下式(X)代表的化合物 其中R6代表有1-6个碳原子的烷基或BZ2-其中Z代表卤原子、C1-C6烷氧基或C2-C7烷基羰基氧基(alkylcarbonyloxy)，X1和X2有与上述定义相同的意义；使化合物(X)与4-甲基丙拉嗪反应得到用下式(XI)代表的化合物 其中X1和R6有与上述定义相同的意义；并水解化合物(XI)。
本发明也提供了有非对称性酯水解能力的酶，并在高压下通过使有非对称性酯水解能力的微生物的细胞破裂，然后用强阴离子色谱、疏水性色谱和强阴离子色谱连续纯化如此破裂的细胞而得到。
实施本发明的最佳方式根据本发明，用有非对称性酯水解能力的酶、培养的有非对称性酯水解能力的微生物的培养基、所述微生物的细胞或微生物细胞的加工产物处理化合物(I)，得到混合物。从混合物中分离和收集化合物(I-a)。然后用金属氢硼化物处理此化合物(I-a)，得到化合物(II)。在碱存在的条件下处理化合物(II)和化合物(III)，得到化合物(IV)。通过还原反应，经过单一步骤将此化合物(IV)转化成光学活性丙氧基苯胺衍生物。然后从化合物(IV)制备用作抗菌剂的化合物(XII)。
本发明从化合物(I)至化合物(XII)的反应流程图如下所示。

以下描述反应流程中的取代基。
X1、X2和X3分别独立地代表卤原子。作为卤原子，优选氟原子。
R1、R3和R4分别独立地代表烷基，它可以是线性、分支或环状的。其碳数可优选为1-6。特别优选的是甲基、乙基和异丁基。
R2代表羟基保护基团。只要此保护性基团是通常使用的种类，对它没有其他特别的限制。说明性的实例有(取代的)烷氧基羰基、(取代的)芳烷氧基羰基、(取代的)酰基、(取代的)烷基、(取代的)烯基、(取代的)芳烷基和被一或多个烷基和/或芳烷基(可以相同或不同)取代的甲硅烷基[注意本文使用的术语“(取代的)”在此指化合物可以含有一或多个取代基]。具体的例子可以包括(取代的)烷氧基羰基，例如，叔-丁氧基-羰基和2，2，2-三氯乙氧基羰基；(取代的)芳烷氧基羰基，例如苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基和对硝基苄氧基羰基；(取代的)酰基，例如乙酰基、甲氧乙酰基、三氟乙酰基、氯乙酰基、新戊酰基、甲酰基和苯甲酰基；(取代的)芳烷基，例如叔丁基、烯丙基(丙烯基)、苄基、对硝基苄基、对甲氧基苄基、三苯甲基和苯乙基；(取代的)烯基和(取代的)芳烷基；醚基，例如甲氧甲基、叔-丁氧基甲基、四氢吡喃基和2，2，2-三氯乙氧甲基；和取代的甲硅烷基，例如三甲基甲硅烷基、异丙基二甲基甲硅烷基、叔-丁基二甲基甲硅烷基、三苄基甲硅烷基和叔-丁基二苯基甲硅烷基。在上述示例性的保护基团中，优选R2是(取代的)芳烷基，更优选具有苄基结构的(取代的)芳烷基。特别优选苄基。
R5代表(取代的)烷基磺酰基或(取代的)芳基磺酰基，优选有1-6个碳原子的烷基磺酰基或(取代的)苯磺酰基。在这些取代基中，特别优选甲磺酰基和对-甲苯磺酰基。
R6代表C1-C6烷基或BZ2，其中Z代表卤原子、C1-C6烷氧基或C2-C7烷基羰基氧基。有1-6个碳原子的烷氧基的例子可以包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基和叔丁氧基。卤原子的例子可以包括上述与X1、X2和X3相关的例子。C2-C7烷基羰基氧基的例子可以包括乙酰氧基、丙酰氧基和丁酰氧基(butylyoxy)。其中，R6特别优选为BF2。
Y代表有1-6个碳原子的烷氧基、卤原子或二(C1-C6烷基)氨基。优选有1-6个碳原子的烷氧基，特别优选甲氧基和乙氧基。
在上述反应流程中，仅显示了一种异构体的制备方法。使用与化合物(I-a)相似而构型相反的化合物，也可以类似地合成其他异构体。另外，使用化合物(I)能得到外消旋形式的化合物(V)。
以下将逐步详细地描述本发明。
步骤(a)步骤(a)是用有非对称酯水解能力的酶、有非对称酯水解能力的培养的微生物的培养基、微生物的细胞或此微生物细胞的加工产物处理化合物(I)得到化合物(I-a)的步骤。
首先，将化合物(I)悬浮在适宜的缓冲剂中，再加入酶、培养的微生物的培养基、微生物的细胞或此微生物细胞的加工产物。将得到的混合物搅拌进行处理。对在此反应中使用的酶没有特别的限制，只要它具有非对称酯水解的能力。这类酶的例子是源自微生物、动物或植物的商品酶制剂。
作为本发明使用的酶，优选脂酶。脂酶可以为固定化的形式。
微生物的例子是例如枝孢属真菌、犁头霉属真菌、奈尼兹皮属真菌、曲霉属真菌、根霉属真菌和毛霉菌属真菌等霉菌；酵母，例如Zygoacus酵母菌、假丝酵母菌和糖酵母属酵母等；和例如芽孢杆菌属细菌、微杆菌属细菌、微球菌属细菌、假单胞菌属细菌、棒状杆菌属细菌和链霉菌属细菌等细菌。在这些微生物中，优选细菌，更优选芽孢杆菌属细菌和微杆菌属细菌，还更优选蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)和产左聚糖微杆菌(Microbac terium laefaniformas)，特别优选蜡状芽孢杆菌(DSC 0007)、蜡状芽孢杆菌(ATCC 14579)和产左聚糖微杆菌(IFO 14471)。
另一方面，微生物细胞的加工产物的例子是破裂的微生物细胞混合物及其纯化产物。
在本发明中，从反应效率的角度优选使用这些微生物，特别是从细菌细胞纯化得到的酶。特别优选的纯化酶是通过在高压下使细胞破裂，并用强阴离子色谱、疏水性色谱和强阴离子色谱连续纯化得到的种类。
这些纯化酶可以是通过如上处理细胞得到的，它们也可以在其他宿主例如大肠杆菌中通过重组DNA技术产生。为通过重组DNA技术得到酶，可以作为例子提到以下过程。首先，用反相色谱进一步纯化上述纯化酶，并测定其蛋白质的氨基酸序列。根据氨基酸序列，制备探针，并从细胞的DNA片段，克隆出编码非对称水解酶活性中心的DNA。然后通过PCR将DNA扩增，制备重组质粒。将此重组质粒引入大肠杆菌等细菌中。培养大肠杆菌等细菌得到目标酶。
通过上述处理，选择性地水解以下化合物(I)的一种光学异构体 其中R1和R2有与以上定义相同的意义，形成下述化合物(I-b) 其中R2有与以上定义相同的意义，可以从混合物中分离出以下未反应的化合物(I-a)
其中R1和R2有与以上定义相同的意义。
特别说明，可以向混合物中加入有机溶剂如乙酸乙酯或氯仿，然后进行处理，例如搅拌和分离，而分离并收集化合物(I-a)。顺便地，可以通过过滤或类似方法在提取化合物(I-a)之前优选去除在处理过程使用的酶、细胞等物质。
这些水解和分离的各自的处理温度一般可以在5℃-60℃的范围内，优选20℃-40℃的范围。各种处理溶液的pH可以在4-9范围内，优选6-8的范围。每个处理时间可以在1小时-7天的范围内，优选1小时-30小时的范围。一般将各处理溶液中化合物(I)的浓度控制在0.1％-10％重量，优选0.5％-5％重量的范围内进行处理。不特别限定酶、培养的微生物的培养基、微生物的细胞或微生物细胞的加工产物的用量，但按干重相当于化合物(I)的0.05倍至0.5倍的重量比使用酶、培养的微生物的培养基、微生物的细胞或微生物细胞的加工产物是适宜的。
另一方面，可以回收利用从反应混合物中分离的化合物(I-b)，在酯化后使化合物(I-b)经过其外消旋化再接受非对称酯水解反应。
步骤(b)步骤(b)是在有存在于非醇溶剂中的伯醇存在下，用金属氢硼化物处理化合物(I-a)，得到化合物(II)的过程。
金属氢硼化物的例子是硼氢化钠、硼氢化锂、硼氢化钙、硼氢化钾、硼氢化锌、硼氢化镁和氰基硼氢化钠。其中优选硼氢化钠。金属氢硼化物的用量可以为化合物(I-a)摩尔数的1-5倍，优选1.1-2倍。
溶剂的例子是烃类溶剂，例如正己烷、正戊烷、环己烷和环戊烷；芳香烃溶剂，例如苯、甲苯和二甲苯；醚类溶剂，例如乙醚、异丙醚(IPE)、甲基叔丁醚(MTBE)、四氢呋喃(THF)、二甲氧基乙烷和1，4-二氧杂环乙烷；和卤代烃类溶剂，例如氯仿、二氯甲烷和1，2-二氯乙烷(EDC)。另外，也可以使用水、醋酸酯等溶剂。可以单独或联合使用这些溶剂。在这些溶剂中，优选芳香烃溶剂，例如甲苯和二甲苯。
对伯醇没有特别的限定，但优选甲醇。伯醇的用量可以在相当于化合物(I-a)摩尔数的3-15倍的范围内，优选4-8倍左右。
根据所用溶剂的不同，反应温度可以不同，但可在-78℃至溶剂沸点的范围内，优选10℃至溶剂的沸点。反应时间可以在1-24小时的范围内，优选2-16小时。
步骤(c)步骤(c)是在溶剂中有碱的条件下处理化合物(II)得到化合物(III)的步骤。
可使用各种溶剂作为溶剂。溶剂的例子是烃类溶剂，例如正己烷、正戊烷；芳香烃溶剂，例如苯、甲苯和二甲苯；醇类溶剂，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇(IPA)、正丁醇和叔丁醇；醚类溶剂，例如乙醚、异丙醚(IPE)、甲基叔丁醚(MTBE)、四氢呋喃(THF)、二甲氧基乙烷和1，4-二氧杂环乙烷；酰胺类溶剂，例如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)；和卤代烃类溶剂，例如氯仿、二氯甲烷和1，2-二氯乙烷(EDC)。另外，也可以使用水、乙腈、醋酸酯、丙酮等溶剂。可以单独或联合使用这些溶剂。在这些溶剂中，优选芳香烃溶剂，例如甲苯和二甲苯。
根据所用的碱和溶剂的不同，反应温度可以不同，但在-78℃至溶剂沸点的范围内，优选-10℃至溶剂的沸点。
碱可以是有机或无机碱。可以使用的碱的例子可以包括碱金属或碱土金属-例如钠、钾、锂、镁和钙的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、醇盐等；金属氢化物，例如氢化钠、氢化钾和氢化锂；烷基锂试剂，例如正丁基锂、甲基锂和二异丙基酰胺锂；叔胺，例如三乙胺和N，N-二异丙基乙胺；还有杂环化合物，例如1，8-重氮化二环[5，4，0]十一-7-烯(DBU)、1，8-重氮化二环[4，3，0]壬-5-烯(DBN)、二甲基苯胺和N-甲基吗啉。为促进反应，在某些情况下，可以在有以下物质的条件下进行反应季铵盐例如四丁基溴化铵或苄基三乙基氯化铵；碱金属或碱土金属碘化物，例如碘化钾或碘化钠；或冠醚。在这些碱中，优选碱金属或碱土金属碳酸盐，例如碳酸钾；碱金属或碱土金属氢氧化物，例如氢氧化钾；和碱金属醇盐，例如叔丁氧基钠和叔丁氧基钾。另外，也可以联合使用碱金属或碱土金属碳酸盐-例如碳酸钾，和碱金属或碱土金属氢氧化物-例如氢氧化钾。碱的用量在相当于化合物(III)摩尔数的0.1-15倍的范围内，优选1-5倍左右。
步骤(d)步骤(d)是通过还原反应将化合物(IV)中的硝基转化成氨基，并且同时除去R2，得到化合物(V)的过程。
可以通过通常的氢化反应完成还原反应。例如，可以是有催化剂的催化氢化反应。在此过程中可以使用的催化剂的例子为通常使用的金属催化剂。在这些金属催化剂中，优选钯-炭、阮内镍，和阮内钴。
只要不抑制反应进行，不特别限定溶剂。溶剂的例子可以包括烃类溶剂，如正己烷、正戊烷、苯、甲苯和二甲苯；和醇类溶剂，例如甲醇、乙醇、丙醇、丙醇、异丙醇(IPA)、正丁醇和叔丁醇。醚类溶剂的例子是乙醚、异丙醚(IPE)、甲基叔丁醚(MTBE)、四氢呋喃(THF)、二甲氧基乙烷和1，4-二氧杂环乙烷。酰胺类溶剂的例子是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)。卤代烃类溶剂的例子是氯仿、二氯甲烷和1，2-二氯乙烷(EDC)。另外，也可以使用水、乙腈、醋酸酯、丙酮等溶剂。可以单独或联合使用这些溶剂。在这些溶剂中，优选醇类溶剂，例如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇(IPA)；芳香烃溶剂，例如甲苯和二甲苯；和这些溶剂与水的混和溶剂。
作为氢的来源，也可以用甲酸铵代替氢气。甲酸铵的量可以在相当于化合物(IV)摩尔数的1-15倍，优选2-5倍左右的范围内。
根据所用碱和溶剂，反应温度可以不同，但可以在-78℃至溶剂沸点的范围内，优选室温至80℃。反应时间可以在1-24小时，优选2-16小时的范围内。
步骤(e)步骤(e)是通过使化合物(V)与式(VI)的亚甲基丙二酸酯化合物反应得到化合物(VII)的步骤。
可以使用的亚甲基丙二酸酯化合物(VI)可以包括乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯和甲氧基亚甲基丙二酸二甲酯。
可以优选用与化合物(V)等摩尔或更多的亚甲基丙二酸酯化合物(VI)进行此反应，然后在无溶剂状态中，在100-180℃左右将其搅拌加热，或在适当溶剂中将其回流加热。
只要对于反应是惰性的，不特别限定进行上述反应的溶剂。溶剂的例子是烃，例如苯、甲苯、二甲苯、正己烷、环己烷和正戊烷；低级醇溶剂，例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇；醚，例如乙醚、四氢呋喃、二氧杂环乙烷和1，2-二甲氧基乙烷；酰胺类，例如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮；和非质子(aprotonic)极性溶剂，例如二甲基亚砜和环丁砜。当使用某种溶剂时，可以在不高于溶剂沸点的温度下进行反应。
步骤(f)步骤(f)是通过使磺酰化合物与化合物(VII)反应得到化合物(VIII)的步骤。
可以使用的磺酰化合物可以包括对-甲苯磺酰氯、甲磺酰氯和氯代甲磺酰氯。
可以优选在有碱的条件下进行反应。碱的例子是叔胺，例如三乙胺、三丁胺和N，N-二异丙基乙胺；二烷基苯胺，例如N，N-二甲基苯胺和N，N-二乙基苯胺；杂环胺，例如嘧啶、N，N-二甲基氨基嘧啶和N-甲基吗啉；和1，8-重氮化二环[5，4，0]十一碳烯。
当使用溶剂时，需要非质子(aprotonic)溶剂。非质子(aprotonic)溶剂的例子是醚，例如乙醚、四氢呋喃、二氧杂环乙烷和1，2-二甲氧基乙烷；酰胺类溶剂，例如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮；和氯化烃类溶剂，例如二氯甲烷、氯仿和1，2-二氯乙烷。反应温度可以优选0-100℃左右。
步骤(g)步骤(g)是通过使化合物(VIII)在碱性条件下发生环闭合反应得到化合物(IX)的步骤。
在环合反应中可以使用的碱可以是无机碱或有机碱。无机碱的例子可以包括金属氢氧化物，例如氢氧化锂、氢氧化钠和氢氧化钾；金属碳酸盐，例如碳酸锂、碳酸钠和碳酸钾；和金属碳酸氢盐，例如碳酸氢钠和碳酸氢钾。另一方面，有机酸的例子包括叔烷基胺，例如三乙胺、三丁胺和N，N-二异丙基乙胺；二烷基苯胺，例如N，N-二甲基苯胺和N，N-二乙基苯胺；杂环胺，例如嘧啶、N，N-二甲基氨基嘧啶和N-甲基吗啉；金属醇盐，例如甲醇钠、乙醇钠、异丙醇钠和叔丁醇钾；另外还有1，8-重氮化二环[5，4，0]十一碳烯和N-苄基三甲基氢氧化铵。
反应溶剂的例子是低级醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇；醚，例如乙醚、四氢呋喃、二氧杂环乙烷、1，2-二甲氧基乙烷、2-甲氧基乙醚和乙二醇二乙醚；酰胺，例如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮；和非质子(aprotonic)极性溶剂，例如二甲基亚砜和环丁砜。
可以在室温至150℃的温度范围内进行反应。
对于环合反应，加入相当于丙氧基苯化合物当量的1/20或更多的碘化钾、碘化钠、冠醚等作为反应促进剂是有效的。
步骤(h)步骤(h)是通过在有或无硼化物的条件下加热化合物(IX)得到化合物(X)的步骤。
当在无硼化物的条件下进行反应时，得到式(X)化合物，其中R6是C1-C6烷基。当在有硼化物的条件下进行反应时，得到式(X)化合物，其中R6是BZ2。特定的硼化物的例子可以包括三氟化硼-四氢呋喃络合物和三氟化硼-乙醚络合物。
无硼化物的反应可以优选通过在100℃至200℃在溶剂-例如多磷酸-中加热化合物(IX)进行。另一方面，有硼化物的反应可以优选在溶剂-例如醋酸酐或丙酸酐中加入螯合剂-例如三氟化硼-四氢呋喃络合物和三氟化硼-乙醚络合物并在150℃至200℃加热化合物(IX)而进行。
步骤(i)步骤(i)是通过使化合物(X)与4-甲基-哌嗪反应得到化合物(XI)的步骤。当式(X)中的R6是C1-C6烷基时，优选在碱或酸性条件下将化合物(X)水解成其相应的羧酸后，与4-甲基-哌嗪反应。
可以优选在有碱的条件下进行反应。此处所用的碱可以是无机碱，也可以是有机碱。无机碱的例子是碱金属和碱土金属的碳酸盐和碳酸氢盐。有机碱的例子是三烷基胺和含氮的杂环化合物。具体地，可以使用过量的三乙胺、三丁胺、乙基二异丙胺、4-甲基吗啉、二甲氨基-嘧啶、4-甲基哌嗪等，而使它们也作为反应溶剂。可以用溶剂，例如二甲基亚砜进行此反应。
步骤(j)步骤(j)是通过水解化合物(XI)得到化合物(XII)的步骤。
可以，例如通过在无质子(aprotonic)溶剂中有碱的条件下加热化合物(XI)而进行此水解反应。例如，可以将在醇性溶剂中有三烷基胺的条件下加热作为示例性的条件。
具体地，可以在乙醇中有三乙胺存在的条件下简单搅拌加热化合物(XI)而完成水解反应。
其中X1是氟原子的式(XII)化合物是左氟沙星。
实施例以下将更具体地以实施例和对比实施例为基础描述本发明。然而，应记住本发明并不仅局限于这些实施例。
通过HPLC或GC测定得到的每个化合物的光学纯度(％ee)。通过与用不同方式合成的具有已知绝对构型的相应样品比较，测定所得的每个化合物的绝对构型。
实施例1 (R)2-苄氧基丙酸乙酯将2-苄氧基丙酸乙酯(300mg)悬浮在0.1M磷酸盐缓冲液中(pH6.5)(30mL)。加入“Lipase Fine Grade”(商标名，SEIKAGAKUCORPORATION产品，德列马根霉(Rhizopus delemer)；6mg)，然后在30℃搅拌24小时。向反应混合物中加入醋酸乙酯，通过硅藻土过滤除去变性的蛋白质。用1N氢氧化钠水溶液调节混合物至pH7.0，然后萃取。用5％碳酸氢钠水溶液洗涤有机层，然后用无水硫酸钠干燥。蒸馏除去溶剂得到油状的标题化合物(102mg，98.8％ee)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.30(3H，t，J＝6.8Hz)，1.44(3H，d，J＝6.8Hz)，4.05(1H，q，J＝6.8Hz)，4.22(1H，q，
J＝6.8Hz)，4.23(1H，q，J＝6.8Hz)，4.45(1H，d，J＝11.7Hz)，4.67(1H，d，J＝11.7Hz)7.23-7.42(5H，m)实施例2 (R)-2-苄氧基-1-丙醇在40℃，将硼氢化钠(21.8mg)悬浮在甲苯(0.8mL)中，并向此所得溶液中加入在实施例1中得到的存在于甲苯(0.8mL)中的(R)2-苄氧基丙酸乙酯(100mg，98.8％ee)。向反应混合物中加入甲醇(0.15mL)，随后在同样温度搅拌3小时。向反应混合物中加入水，用甲苯萃取所得混合物。用水和氯化铵的饱和水溶液洗涤有机层，然后用无水硫酸镁干燥。蒸馏除去溶剂后，将得到的残余物经过硅胶柱色谱，得到油状的标题化合物(79mg，99％ee)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.17(3H，d，J＝6.3Hz)，2.20(1H，bs)，3.43-3.72(3H，m)，4.48(1H，d，J＝11.7Hz)，4.64(1H，d，J＝11.7Hz)，7.22-7.44(5H，m)参考例1将产左聚糖微杆菌(IFO 14471)接种在营养肉汤(100mL，Sakaguchi烧瓶中)中，并在30℃摇荡培养过夜。通过离心收集细胞，然后冷冻干燥得到冷冻干燥的IFO 14471细胞。
实施例3 (R)2-苄氧基丙酸乙酯将2-苄氧基丙酸乙酯(2.0g，9.6mmol)悬浮在0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0)(100mL)中。加入按参考例1所述方法制备的IFO 14471的冷冻干燥细胞(100mg)，然后在30℃搅拌。由于随着反应的进行pH逐步降低(是形成羧酸的结果)，加入1N氢氧化钠以保持系统的pH在6.8和7.2之间。反应14小时后，加入醋酸乙酯(100mL)。然后搅拌片刻，通过硅藻土过滤除去细胞。分层后，用醋酸乙酯(100mL)进一步萃取。收集醋酸乙酯层，然后用5％碳酸氢钠水溶液洗涤2次，完全除去羧酸。干燥有机层，蒸馏除去溶剂，得到标题化合物
。化合物的1H-NMR光谱数据与实施例1中化合物的数据一致。
实施例4 (R)2-苄氧基丙酸乙酯将2-苄氧基丙酸乙酯(2.0g，9.6mmol)悬浮在0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0)(100mL)中。加入按与参考例1类似的方式制备的ATCC14579的冷冻干燥细胞(100mg)，然后在30℃搅拌。由于随着反应的进行pH逐步降低(是形成羧酸的结果)，加入1N氢氧化钠以保持系统的pH在6.8和7.2之间。反应16小时后，加入醋酸乙酯(100mL)。然后搅拌片刻，通过硅藻土过滤除去细胞。分层后，用醋酸乙酯(100mL)进一步萃取。收集醋酸乙酯层，然后用5％碳酸氢钠水溶液洗涤2次，完全除去羧酸。干燥有机层，蒸馏除去溶剂，得到标题化合物
。化合物的1H-NMR光谱数据与实施例1中化合物的数据一致。
实施例5 2-苄氧基丙酸乙酯(外消旋化步骤)收集在实施例3中用醋酸乙酯萃取时全部的水层，然后用10％盐酸调整至pH2。然后用醋酸乙酯(100mL)萃取水层2次。合并且干燥有机层后，蒸馏除去溶剂得到(S)-苄氧基丙酸
。将等份的(S)-苄氧基丙酸溶解在乙醇(10mL)中，随后加入浓硫酸(0.01mL)。然后将由此制备的混合物回流加热。8小时后，蒸馏除去溶剂，用醋酸乙酯(20mL)萃取残余物。用5％碳酸氢钠水溶液(10mL)和水(10mL)洗涤萃取物，干燥有机层，蒸馏除去溶剂得到(S)-苄氧基丙酸乙酯。它溶解在甲苯(10mL)中，并在冰冷却条件下搅拌，加入乙醇钠(0.33g，1.1eq)，然后在室温搅拌14小时。通过使用光学活性柱的气相色谱，证实完成了外消旋化。然后，将反应混合物滴加到10％柠檬酸水溶液(10mL)中。用水(10mL)洗涤有机层并干燥后，蒸馏除去溶剂得到标题化合物(0.74g)。化合物的1H-NMR光谱数据与实施例1中化合物的数据一致。外消旋体可以作为实施例1-4非对称酯水解的原料。
对比实施例1 (R)2-苄氧基丙酸甲酯在-30℃，溴化苄(9.86g)和60％氢化钠(2.11g)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)和四氢呋喃(THF)的混合溶液中(50mL，体积比3∶2)。向溶液中加入(R)乳酸甲酯(5.0g，99％ee)。在同样温度下，将所得混合物搅拌30分钟。然后，在室温将混合物搅拌30分钟，并进一步在50℃搅拌30分钟。向反应混合物中加入水和二异丙基醚，用水洗涤有机层，然后用无水硫酸镁干燥。蒸馏除去溶剂后，将所得残余物经过硅胶柱色谱得到黄色油状的标题化合物(8.87g，92.1％ee)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.44(3H，d，J＝6.8Hz)，3.75(3H，s)，4.07(1H，q，J＝6.9Hz)，4.45(1H，d，J＝11.7Hz)，4.69(1H，d，J＝11.7Hz)，7.22-7.37(5H，m)实施例6 (R)-3，4-二氟-2-(2-苄氧基丙氧基)硝基苯在冰冷却下，将氢氧化钾(5.40g)和碳酸钾(3.33g)悬浮在甲苯(180mL)中。向得到的悬浮液中加入在实施例2得到的(R)-2-苄氧基-1-丙醇(4.0g)的溶液，和2，3，4-三氟硝基苯(4.13g)的甲苯溶液(40mL)，然后在同样温度下搅拌1小时。向反应混合物中加入水，然后用甲苯萃取。用水洗涤有机层，然后用无水硫酸镁干燥。蒸馏除去溶剂后，将所得残余物经过硅胶柱色谱得到黄色油状的标题化合物(7.55g)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.29(3H，d，J＝6.4Hz)，3.93-4.
03(2H，m)，4.53-4.65(2H，m)，6.90-6.99(1H，m)，7.23-7.35(5H，m)，7.60-7.66(1H，m)实施例7 (R)-3，4-二氟-2-(2-苄氧基丙氧基)硝基苯在冰冷却下，将叔丁醇钠(63.6mg)悬浮在甲苯(0.5mL)中。向得到的悬浮液中加入在实施例2得到的(R)-2-苄氧基-1-丙醇(100mg)。然后在冰冷却下将得到的悬浮液加入2，3，4-三氟硝基苯(103.5mg)的甲苯溶液中(0.5mL)中，搅拌1小时。向反应混合物中加入水，然后用甲苯萃取。用水洗涤有机层，然后用无水硫酸镁干燥。蒸馏除去溶剂后，将所得残余物经过硅胶柱色谱得到黄色油状的标题化合物(161.2mg)。化合物的1H-NMR光谱数据与实施例6中化合物的数据一致。
实施例8 (R)-3，4-二氟-2-(2-羟基丙氧基)苯胺在室温，将在实施例6得到的(R)-3，4-二氟-2-(2-苄氧基丙氧基)硝基苯(1.0g)溶解在乙醇(10mL)中。加入7.5％Pd-C(1.0g)，然后在氢气氛中搅拌6小时。过滤除去Pd-C后，减压浓缩如此得到的滤液，将所得残余物经过硅胶柱色谱得到油状的标题化合物(600mg，99.0％ee)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.23(3H，d，J＝6.3Hz)，3.81-4.
89(1H，m)，4.06-4.17(2H，m)，6.37-6.44(1H，m)，6.77-6.87(1H，m)实施例9 (R)-3，4-二氟-2-(2-羟基丙氧基)苯胺在室温，将在实施例6得到的(R)-3，4-二氟-2-(2-苄氧基丙氧基)硝基苯(0.3g)溶解在甲苯(3mL)中。加入10％Pd-C(90mg)，然后在氢气氛中在80℃搅拌4小时。过滤除去Pd-C后，减压浓缩如此得到的滤液，将所得残余物经过硅胶柱色谱得到油状的标题化合物(181.0mg，99.0％ee)。化合物的1H-NMR光谱数据与实施例8中化合物的数据一致。
实施例10 2，3-二氟-6-(2，2-二乙氧基羰基乙烯基)-氨基-[(R)-2-羟基丙氧基]苯在100℃，将在实施例8得到的(R)-3，4-二氟-2-(2-羟基丙氧基)苯胺(1.02g)，和乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(1.14g)在无溶剂的条件下搅拌1小时。在轻微减压下除去产生的乙醇时，再将混合物搅拌30分钟。使反应混合物冷却，然后减压浓缩。将所得残余物经过硅胶柱色谱得到白色结晶状的标题化合物(1.83mg，99.0％ee)。
熔点52-55℃1H-NMR(270MHz，CDCl3)δ1.22-1.46(m，9H)、3.
55(d，1H，J＝4.5Hz)、3.88-4.43(m，7H)、6.75-7.
08(m，2H)，8.48(d，1H，J＝14.5Hz)实施例11 2，3-二氟-6-(2，2-二乙氧基羰基乙烯基)-氨基-[(R)-2-甲烷磺酰基氧丙氧基]苯将由实施例10得到的2，3-二氟-6-(2，2-二乙氧基羰基乙烯基)-氨基-[(R)-2-羟基丙氧基]苯(3.00g)溶解在1，2-二氯乙烷(30mL)中。在冰冷却下搅拌加入三乙胺(0.98g)，并在同样温度下，进一步搅拌加入甲磺酰氯(1.01g)。在室温将由此得到的混合物搅拌2小时，过滤除去不溶的物质。用1，2-二氯乙烷将滤液稀释。用水洗涤得到的溶液，然后用无水硫酸镁干燥。向干燥后的有机层加入硅胶(1.5g)，然后搅拌30分钟，过滤除去不溶的物质。减压蒸馏除去溶剂，使残余物从异丙醚中结晶。然后过滤收集结晶，得到标题化合物(3.27g)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.22-1.47(6H，m)，1.58(3H，d，J＝7Hz)，1.50(3H，d，J＝7Hz)，3.13(3H，s)，3.98-4.60(6H，m)，4.95-5.35(1H，m)，6.79-7.14(2H，m)，8.41(1H，d，J＝13.5Hz)实施例12 (S)(7，8-二氟-3-甲基-3，4-二氢-2H-[1，4]苯并噁嗪-4-基)亚甲基-丙二酸二乙酯将由实施例11得到的2，3-二氟-6-(2，2-二乙氧基羰基乙烯基)-氨基-[(R)-2-甲烷磺酰基氧丙氧基]苯(3.00g)溶解在无水DMF(15mL)中，然后加入碳酸钾(0.92g)。在80℃将由此得到的混合物搅拌2小时。减压蒸馏除去溶剂，用醋酸乙酯萃取残余物，用水洗涤得到的萃取物，然后用无水硫酸镁干燥。减压蒸馏除去溶剂，使残余物经过硅胶柱色谱，得到标题化合物(2.14g)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.22-1.42(9H，m)，3.90-4.44(7H，m)，6.74-6.88(2H，m)，7.78(1H，s)实施例13 (3S)-9，10-二氟-3-甲基-7-氧代-2，3-二氢-7H-吡啶并[1，2，3-de][1，4]苯并噁嗪-6-羧酸-二氟化硼鳌合物将由实施例12得到的(S)(7，8-二氟-3-甲基-3，4-二氢-2H-[1，4]苯并噁嗪-4-基)亚甲基丙二酸二乙酯(2g)，和醋酸酐(2mL)在140℃混和，加入47％三氟化硼-四氢呋喃络合物(0.8mL)。在同样温度下，将残余物搅拌加热1小时。当将产生的低沸点产物蒸馏除去后，使反应混合物冷却到室温。向反应混合物中加入丙酮(10mL)，然后在同样温度下搅拌30分钟。收集沉淀的结晶并用丙酮洗涤得到标题化合物(1.55g)。
实施例14 (3S)-(-)-9-氟-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-2，3-二氢-7H-吡啶并[1，2，3-de][1，4]苯并噁嗪-6-羧酸(左氟沙星)将由实施例13得到的(3S)-9，10-二氟-3-甲基-7-氧代-2，3-二氢-7H-吡啶并[1，2，3-de][1，4]苯并噁嗪-6-羧基-二氟化硼鳌合物(310mg)溶解在二甲基亚砜(6mL)中，然后加入三乙胺(0.32mL)和N-甲基哌嗪(0.13mL)。在室温将得到的混和物搅拌17小时，然后减压蒸发至干。用乙醚洗涤残余物后，将残余物溶解在含有三乙胺(0.5mL)的95％乙醇(20mL)中。将如此得到的溶液回流加热8小时。使反应混合物冷却，然后减压蒸发至干。将残余物溶解在稀盐酸(5％)中。随后加入氯仿，使得到的混合物分层。用氢氧化钠(1mol/L)将水层调节到pH11，然后用盐酸(1mol/L)调节到pH7.4。用氯仿萃取如此制备的混合物(50mL×3)。合并萃取物，用硫酸钠干燥，蒸馏除去氯仿。从乙醇-乙醚中重结晶所得粉末，得到透明的细针状标题化合物(120mg)。
熔点225-227℃对C18H20FN3O4·1/2H2O的元素分析计算值C 58.37；H 5.72；N 11.35
测定值C 58.17；H 5.58；N 11.27实施例15(1)破裂细胞(法式重压法(French press))将通过在Sakaguchi烧瓶中(培养基量1,200mL)振荡培养得到的ATCC 14579细胞，悬浮在20mM磷酸缓冲液(80mL)(pH7.0；含有1Mm EDTA和DTT)，通过法式重压(French press)，施加15,000psi的压力，以使细胞破裂。
通过离心分离器将破裂的细胞离心(10,000G，30分钟)得到细胞提取物(85.0mL)(总活性123单位，特异活性0.032单位/mg)。
(2)阴离子交换色谱在下述阴离子交换色谱的纯化条件下，将细胞提取物分离。测定各级分对2-苄氧基丙酸乙酯的水解活性(206mL)来获得活性级分(总活性88单位，特异活性0.058单位/mg，活性产率72％)。
阴离子交换色谱柱纯化条件载体“Source Q”(商标名，Pharmacia Biotech公司产品)400mL色谱柱直径50mm，长200mm流动相溶液A20mM磷酸缓冲液(pH7.0，含有1mM EDTA和DTT)900mL溶液B溶液A+1.0M NaCl，900mLA→B线性梯度洗脱检测器280nm；温度4℃收集15分钟的各级分，然后对2-苄氧基丙酸乙酯进行水解。
(3)疏水性色谱向由阴离子交换色谱收集的活性级分(206mL)中，以小份方式加入硫酸铵(54.4g，2.0M当量)。搅拌30分钟后，离心除去所得沉淀(10,000G，30分钟)。用下述疏水性色谱纯化条件将由此得到的上清液分级分离。测定各级分对2-苄氧基丙酸乙酯的水解活性，并确定活性级分(251-308分钟)。通过超滤除去这些活性级分中的盐并将其浓缩，得到活性的中心级分(1.0mL)(总活性16.8单位，特异活性3.23单位/mg，活性产率19％)。
疏水性色谱纯化条件载体“Resource ETH”(商标名，Pharmacia Biotech公司产品)100mL色谱柱直径45mm，长60mm流动相溶液A20mM磷酸缓冲液(pH7.0，含有1mM EDTA和DTT)600mL溶液B溶液A+2.0M硫酸胺，600mLB→A线性梯度洗脱检测器280nm；温度4℃收集7分钟的各级分，然后对2-苄氧基丙酸乙酯进行水解。
(4)阴离子交换色谱(“Mono Q”商标名，Pharmacia Biotech公司产品)用“Mono Q”阴离子交换色谱将通过疏水性色谱收集的活性级分(1.0mL)分级分离。测定各级分对2-苄氧基丙酸乙酯的水解活性，并确定活性级分(23-25分钟)。通过超滤除去这些活性级分中的盐并将其浓缩，得到活性的中心级分(1.0mL)(总活性5.9单位，特异活性4.54单位/mg，活性产率35％)。发现活性蛋白质的分子量约为38,000(SDS PAGE)或40,000(凝胶过滤法)。
阴离子交换色谱纯化条件(“Mono Q”)色谱柱阴离子交换柱(“Mono Q”)1mL流动相溶液A20mM磷酸缓冲液(pH7.0)溶液B溶液A+1.0M NaCl，600mLA→B线性梯度洗脱流速1.0mL/min；检测器280nm；
温度室温收集1分钟的各级分，然后对2-苄氧基丙酸乙酯进行水解。
ATCC 14579分离纯化结果

用如上所述来源于微生物的，经过纯化的酶，进行如实施例1、2、3和4的非对称性酯水解反应。有效地得到光学纯度为99％ee或更高的(R)-2-苄氧基丙酸乙酯。
工业实用性根据本发明的方法，可以通过较少的步骤，以较低的成本得到有高光学纯度的光学活性丙氧基苯胺衍生物(V)。因此本发明提供了一种制备左氟沙星化合物的工业上有益的方法，它有光学纯度方面的高质量，并因此能用作抗菌剂。


用有非对称性酯水解能力的酶等物质处理乳酸酯衍生物，可以特异地水解作为外消旋衍生物的成对化合物存在的异构体的酯部分。使用通过此水解得到的化合物，能够以比常规技术更短的过程产生光学活性丙氧基苯胺衍生物。