常山胡柚果皮果渣提取物的泡腾片的制备方法【技术领域】[0001]本发明属于植物活性成分的制备方法【技术领域】，具体涉及常山胡柚果皮果渣提取物的泡腾片的制备方法。[0002]常山胡柚又名金柚，是由柚和橙天然杂交而成的我国柑桔属植物的一个新种，原产于浙江省常山县，至今已有百余年栽培史。因其果实外形美观、大小适宜、色泽诱人、香气独特、口感鲜脆，且营养丰富、极耐贮运，因而深受消费者的青睐，它既是一种理想的鲜食果实，也是一种很好的加工原料，经济价值甚高，并多次在全国评比中获奖，成为我国第一个优质杂柑，号称“中华第一杂柑”。[0003]据统计，浙江省常山胡柚年产量13万吨，但由于果品品质等原因，常山胡柚的经济效益递增缓慢，甚至出现局部地区产量过剩的现象，同时常山胡柚的皮渣废弃物造成了一定的环境污染。因此，研究常山胡柚的深度加工技术，尤其是对果实皮渣废弃物的综合利用，是提高产业效益，减少皮渣废弃物污染的重要途径。
[0004]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种常山胡柚果皮果渣提取物的泡腾片的制备方法的技术方案。[0005]所述的常山胡柚果皮果渣提取物的泡腾片的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤: 1)按照以下重量配比称取各原料
常山胡柚果皮果渣提取物粉末5~15%、柠檬酸和碳酸钠40~50%、糊精30~50%、无水乙醇2~8%、PEG-4000 0.2~1%，所述的柠檬酸:碳酸钠的重量比为1.6:1 ;
2)取上述各原料过80目筛，将常山胡柚果皮果渣提取物粉末均匀分成两份分别与柠檬酸和碳酸钠混合，在酸碱体系中分别加入糊精做填充剂，以无水乙醇作为粘合剂，24目制粒进行酸碱分开制粒；
3)将酸碱制粒放入40~70°C恒温干燥箱中进行干燥，干燥完成后，将酸碱制粒混合，加入所述重量配比的PEG-4000，研磨，使其充分混合后，在压力3~IOMpa下进行压片，得到常山胡柚果皮果渣提取物的泡腾片。
[0006]所述的常山胡柚果皮果渣提取物的泡腾片的制备方法，其特征在于所述的常山胡柚果皮果渣提取物粉末通过以下步骤制得:
a)取新鲜的常山胡柚果皮果渣依次进行剪碎、60°C烘干和粉碎处理，得到粉末；
b)取步骤I)得到的粉末用95%乙醇溶液加热回流进行三次抽提，第一次2小时，第二次1.5小时，第三次1.5小时，得到油状提取物；
c)取步骤2)得到的油状提取物加入石油醚进行脱脂处理，油状提取物与石油醚按体积比1:1混合进行萃取，萃取后取下层提取物挥发石油醚得到脱脂后提取物；d)取脱脂后提取物利用DlOl型大孔树脂进行柱层析，用浓度20~80%的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液旋蒸，粉碎得常山胡柚果皮果渣提取物粉末。
[0007]所述的常山胡柚果皮果渣提取物的泡腾片的制备方法，其特征在于所述的步骤I)中按常山胡柚果皮果渣提取物粉末7~12%、柠檬酸和碳酸钠42~48%、糊精35~45%、无水乙醇3~6%和PEG-4000 0.4~0.8%称取各原料。
[0008]所述的常山胡柚果皮果渣提取物的泡腾片的制备方法，其特征在于所述的步骤I)中按常山胡柚果皮果渣提取物粉末10%、柠檬酸和碳酸钠45%、糊精40%、无水乙醇4.5%、PEG-4000 0.5%称取各原料。
[0009]所述的常山胡柚果皮果渣提取物的泡腾片的制备方法，其特征在于所述的步骤3)中恒温干燥箱烘干温度为40°C。
[0010]所述的常山胡柚果皮果渣提取物的泡腾片的制备方法，其特征在于所述的步骤3)压片压力为6Mpa。
[0011]本发明以常山胡柚果实皮渣废弃物为材料，建立有效成分提取技术，提取柠檬苦素类和黄酮类物质，研发具有降血脂功能的泡腾片，满足当今降血脂保健品市场，具有广阔的市场前景。同时促进果业深加工及加工副产物的利用，提高经济效益，减少环境污染，具有重要的实际指导意义。



[0012]图1黄酮类物质标准曲线图；
图2柠檬苦素类物质标准曲线图。

[0013]以下结合实施例来进一步说明本发明。
[0014]实施例1:山胡柚果皮果渣提取物的制备
1)取新鲜的常山胡柚果皮果渣依次进行剪碎、60°c烘箱烘干和粉碎处理，得到粉末；
2)取步骤1)得到的粉末用95%乙醇溶液加热回流进行分三次抽提，第一次2小时，第二次1.5小时，第三次1.5小时，得到油状提取物；
3)取步骤2)得到的油状提取物与石油醚按按体积比1:1混合进行萃取，重复5次，萃取后取下层提取物挥发石油醚，得到脱脂后提取物；
4)取脱脂后提取物利用DlOl型大孔树脂进行柱层析，用浓度20~80%的乙醇洗脱洗脱，收集洗脱液，洗脱液旋蒸，粉碎得常山胡柚果皮果渣提取物粉末。
[0015]实施例2:山胡柚果皮果渣提取物泡腾片的制备
将实施例1得到的常山胡柚果皮果渣提取物粉末及各辅料，即:柠檬酸、碳酸钠、糊精、PEG-4000各过80目筛；将常山胡柚果皮果渣提取物粉末分成两份分别与柠檬酸和碳酸钠混合，酸碱体系中 分别加入糊精做填充剂，以无水乙醇作为粘合剂，24目制粒进行酸碱分开制粒，其中酸源由常山胡柚果皮果渣提取物粉末5%、碳酸钠17.3%、糊精20%混合，以无水乙醇2.25%作为粘合剂，24目制粒得到；碱源由常山胡柚果皮果渣提取物粉末5%、柠檬酸27.7%、糊精20%混合，以无水乙醇2.25%作为粘合剂，24目制粒得到；将酸碱制粒放入40°C恒温干燥箱中进行干燥，干燥完成后，将酸碱制粒混合，加入PEG-4000 0.5%，研磨，使其充分混合后，在压力6Mpa下进行压片，得到常山胡柚果皮果渣提取物的泡腾片。
[0016]实施例3:山胡柚果皮果渣提取物泡腾片的制备
将实施例1得到的常山胡柚果皮果渣提取物粉末及各辅料，即:柠檬酸、碳酸钠、糊精、PEG-4000各过80目筛；将常山胡柚果皮果渣提取物粉末分成两份分别与柠檬酸和碳酸钠混合，酸碱体系中分别加入糊精做填充剂，以无水乙醇作为粘合剂，24目制粒进行酸碱分开制粒，其中酸源由常山胡柚果皮果渣提取物粉末6%、碳酸钠18.5%、糊精17.5%混合，以无水乙醇2.1%作为粘合剂，24目制粒得到；碱源由常山胡柚果皮果渣提取物粉末6%、柠檬酸29.5%、糊精17.5%混合，以无水乙醇2.1%作为粘合剂，24目制粒得到；将酸碱制粒放入50°C恒温干燥箱中进行干燥，干燥完成后，将酸碱制粒混合，加入PEG-4000 0.8%，研磨，使其充分混合后，在压力3Mpa下进行压片，得到常山胡柚果皮果渣提取物的泡腾片。
[0017]实施例4:山胡柚果皮果渣提取物泡腾片的制备
将实施例1得到的常山胡柚果皮果渣提取物粉末及各辅料，即:柠檬酸、碳酸钠、糊精、PEG-4000各过80目筛；将常山胡柚果皮果渣提取物粉末分成两份分别与柠檬酸和碳酸钠混合，酸碱体系中分别加入糊精做填充剂，以无水乙醇作为粘合剂，24目制粒进行酸碱分开制粒，其中酸源由常山胡柚果皮果渣提取物粉末3.5%、碳酸钠16.2%、糊精22.5%混合，以无水乙醇2.8%作为粘合剂，24目制粒得到；碱源由常山胡柚果皮果渣提取物粉末3.5%、柠檬酸25.8%、糊精22.5%混合，以无水乙醇2.8%作为粘合剂，24目制粒得到；将酸碱制粒放入70°C恒温干燥箱中进行干燥，干燥完成后，将酸碱制粒混合，加入PEG-4000 0.4%，研磨，使其充分混合后，在压力IOMpa下进行压片，得到常山胡柚果皮果渣提取物的泡腾片。
[0018]实施例5:常山胡柚果皮果渣提取物中黄酮类物质和柠檬苦素类物质的测定和最佳工艺的确定
I材料与方法
1.1实验材料、仪器、试剂及试药 1.1.1实验材料
常山胡柚(购于浙江省常山县当地水果市场)
1.1.2主要仪器
GZX-9140 MBE数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，UV-1800紫外可见分光光度计(SHIMADZU CORPORATION (岛津))，PL-203 电子天平(METTLER TOLEDO (梅特勒-托利多)仪器(上海)有限公司)，HWS26恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司上海一恒科技仪器有限公司)，Sorvall ST 16R 冷冻离心机(Thermo Scientific), FiveEasy PluspH计(METTLER TOLEDO (梅特勒-托利多)仪器(上海)有限公司)，台式粉末压片机(天津市思创精实科技发展有限公司)
1.1.3试剂及试药
芦丁(≥98%，购于上海金穗生物科技有限公司)，柠檬苦素(≥98%，购于上海金穗生物科技有限公司)，吴茱萸内酯(≤98%,购于阿拉丁试剂公司)，4-Nitrophenylbutyrate(Lot#lllM5207V，购于美国SIGMA试剂公司)，胰脂肪酶(Lot#SLBC9250V，购于美国SIGMA试剂公司)，橄榄油(化学纯，购于阿拉丁试剂公司)
1.2实验方法
1.2.1原料预处理取新鲜常山胡柚皮试样，剪碎后放入60°C烘箱中烘干，用料理机粉碎成粉末，得粉末1647g，备用。
[0019]1.2.2黄酮类物质和柠檬苦素类物质提取纯化
95%乙醇溶液加热回流进行抽提，分三次提取，第一次2小时，第二次1.5小时，第三次
1.5小时，得油状提取物500mL。利用DlOl型大孔树脂进行柱层析，分别用20%、40%、60%、80%,95%乙醇洗脱，提取液旋蒸得样品粉末，即为黄酮类物质和柠檬苦素类物质。
[0020]1.2.3功能性成分的含量测定方法
1.2.3.1黄酮类物质含量测定
(I)芦丁储备液的配制
用电子天平称取6.20mg芦丁对照品于烧杯中，加入15ml无水乙醇溶液，置于恒温水浴锅中加热至芦丁溶解。转移至25ml棕色容量瓶中，加无水乙醇定容；用电子天平称取0.6676g A1C13固体配置成50mL A1C13溶液。配置方法:36%_38%盐酸溶液按与蒸馏水1: 3的体积比在烧杯中配约为10%的盐酸40mL，缓慢加入A1C13粉末，搅拌，直至完全溶解，转移至50mL容量瓶中，再加入蒸馏水定容至50mL ;用电子天平称取乙酸钠固体0.8208g于烧杯中，用蒸懼水定容至50mL,加醋酸溶液调节至pH=5.2。
[0021](2)芦丁标准溶液的配制
分别取芦丁储备液0.0mLU.0mL,2.0mL,3.0mL,4.0mL,5.0mL，置于25 mL容量瓶中，加Λ 0.1 mol/L的A1CL3溶液2 mL、pH=5.2的醋酸钠缓冲溶液I mL，用无水乙醇定容至刻度，摇匀。40°C水浴10 min后，取出容量瓶放入水中冷却至室温。
[0022](3)测定波长的选择
分别量取供试品溶液、芦丁储备液各1.0mL，分别置于25mL量瓶中，各加入0.lmol/L三氯化铝溶液2.0mL与pH=5.2的醋酸钠缓冲溶液1.0mLjp 30%乙醇稀释至刻度，摇匀，40°C水浴10 min。同法制得空白液。按紫外一可见分光光度法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录VA)实验，在200-500 nm波长范围内扫描，记录紫外吸收光谱，得最适波长为360nmo
[0023](4)标准曲线的绘制
在360nm波长处测定各浓度芦丁标准液的吸光度，绘制标准曲线，得回归方程。如图1所示。
[0024](5)样品含量测定
准确称取20%、40%、60%、80%的乙醇洗脱物粉末各8.0mg,加入烧杯中，加无水乙醇15mL，在恒温水浴锅中微热溶解，恒温水浴锅的温度设置为50°C。完全溶解后取出，冷却至室温，转移至25mL棕色容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。各取3.0mL于25mL棕色容量瓶中，并编号分别为1、2、3、4。加入0.1 mol/L三氯化铝溶液2.0 mL与pH=5.2的醋酸钠缓冲溶液1.0mL，加无水乙醇定容至刻度，摇匀。40°C水浴10 min，取出。同时以无水乙醇作为空白对照。在360nm处测定吸光值，将各浓度乙醇洗脱物样品吸光值代入回归方程，计算得各浓度乙醇洗脱物中黄酮类物质含量。
[0025]1.2.3.2柠檬苦素类物质含量测定 (I)显色剂的配制
准确称取125.0mg对二 -甲氨基苯甲醒溶解于100.0mL硫酸:无水乙醇(V硫酸:V无水乙醇=35:65)混合液中，加入0.5mL 0.9%三氯化铁溶液，现配现用。
[0026](2)标准曲线的绘制
准确称取柠檬苦素标准品10.0mg，置于20mL烧杯中，用少量无水乙醇溶解，转移至IOmL容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，配成lmg/mL的标准溶液，备用。另取5个IOmL容量瓶，分别加入0.lmL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL标准品溶液，再分别加入显色剂5.0mL,摇匀，加入无水乙醇定容至刻度，静置30min后于500nm波长处测定吸光度，以空白溶液为参t匕，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。如图2所示。
[0027](3)样品含量测定
准确移取一定量标准溶液或样品溶液于容量瓶中，加入显色液，摇匀，静置，以空白试剂作参比，在指定波长处测其吸光度。吸光度代入回归方程，得到柠檬苦素的含量。
[0028]1.2.3.3降脂作用活性测定 胰脂肪酶是水解膳食脂肪的最重要的酶，等电点为5.0的酸性蛋白分子。可水解50%-70%的食物脂肪，通过抑制胰脂肪酶活性可以控制高血脂。测定待测物对胰脂肪酶的抑制活性就可进行降脂作用评价。
[0029](I)实验原理
利用胰脂肪酶将橄榄油水解生成脂肪酸和甘油，脂肪酸和显色剂中的铜离子反应生成铜皂蓝色络合物，在710nm波长下有最大吸收值，再对照脂肪酸吸光度工作曲线得出脂肪酸的浓度，计算出酶的活性。
[0030](2)实验操作(铜皂法测定活性)
a反应混合体系(5.8OmL底物)的配制
质量浓度为50g/L阿拉伯胶:取适量阿拉伯胶，加入蒸馏水配制，定容，备用。
[0031]Tris-HCl 缓冲液(20mol/L, ρΗ=7.7):量取 Tris2.4228g 于烧杯中，加适量蒸馏水溶解，加入HCl，利用PH剂进行调节使PH=7.7。再加蒸馏水定容至lOOOmL。取适量的质量浓度为50g/L阿拉伯胶溶于缓冲液中。
[0032]质量浓度为50g/L醋酸铜溶液(显色剂):醋酸铜溶液用吡啶调至PH= 6.0。
[0033]配制6mol/L的HCl溶液:确量取36%_38%HC1溶液51.1mL,加水稀释，定容至IOOmL0
[0034]胰脂肪酶溶液(5mg/mL，约200U/mL ):称取50mg胰脂肪酶，用适量Tris-HCl缓冲液(75 mol/L, ρΗ=7.4)溶解，16000r/min 离心 5min,用 Tris-HCl 缓冲液定容至 10 mL。将IOmL均分成两份后，取其中一份煮沸灭活。每次使用前配制。
[0035]橄榄油底物配制:取0.5mL橄榄油、4.50mL正己烷、0.80mL的20mol/LTris-HCl缓冲液混合制得。
[0036]乙醇提取物溶液:用甲醇溶解，使乙醇提取物最终质量浓度为lOOOyg/mL、800 μ g/mL> 600 μ g/mL> 400 μ g/mL> 200 μ g/mL>100 μ g/mL> 50 μ g/mL> 25 μ g/mL 和12.5yg/mL。每组设3个平行。
[0037]b测定样品组以及对照组的确定
实验设置样品组、空白对照组、阳性对照组、阴性对照组，各组取一定量的Tris-HCl缓冲液、酶溶液和样品，见表1。37°C保温15min后，加入ImL的6mol/L的HCl溶液终止反应。
[0038]表1乙醇提取物对脂肪酶抑制效果实验(mL)