一种抗皮肤老化的地龙肽及其制备方法和应用的制作方法【技术领域】，特别是涉及一种抗皮肤老化的地龙肽及其制备方法和应用。[0002]肽是一类涉及生物体内多种细胞功能的生物活性物质，参与调控人体各种复杂的生理过程。肽具有活性高、亲和性强、安全性高等特点，且肽分子又是纳米级别的，很容易被人体的肠道吸收，或通过皮肤表层直接进入深层皮肤，快速被人体吸收发挥作用。现代药理学研究表明，一些活性肽不仅具有抗氧化活性，还可以有效促进人皮肤成纤维细胞的生长和增殖，特别是可以通过增加皮肤成纤维细胞的活性，有效促进细胞基质尤其是胶原蛋白等基质的合成，发挥出显著的抗皮肤老化作用。因此，生物活性肽为抗皮肤老化化妆品和保健品行业的发展提供了 全新的方向和思路，在抗皮肤老化产品中的应用也越来越普遍。[0003]虫丘蝴(Earthworm)是环节动物门寡毛纲类动物，是我国传统的一味中药,也称为地龙。蚯蚓具有广泛的药理作用，效果显著，如溶栓和抗栓、抗肿瘤、平喘、促进皮肤修复、抗菌等作用。蚯蚓体中富含蛋白质，蛋白质总量约占干重的45.90%~68.11%，包括蚓激酶、脂类蛋白、钙调素结合蛋白、蚯蚓新钙结合蛋白和蚓激酶等。目前，蚯蚓的应用主要包括传统中药煎服或制成蚯蚓粉直接服用的形式入药，以及生产制备天然的具有溶栓、抗栓和抗肿瘤等作用的大分子蛋白提取物。此外，蚯蚓还是一种良好的生产肽类物质的原料，如具有防治高血压和抗菌等方面应用的蚯蚓肽制品。但还未见报道采用蚯蚓制备活性肽应用于抗皮肤老化产品的开发，而且采用蚯蚓作为原料开发制备多肽的过程中，仍存在制备分离过程繁杂，制备目标肽分子量过大以及分布范围过广，针对性不强等问题。
[0004]本发明主要解决的技术问题是提供一种抗皮肤老化的地龙肽及其制备方法和应用，所述地龙肽具有明显的抗皮肤老化作用，能应用于抗皮肤老化化妆品和保健品中。[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是:提供一种抗皮肤老化的地龙肽，所述地龙肽为分子量为300-3000道尔顿的地龙肽。[0006]提供一种抗皮肤老化的地龙肽的制备方法，包括步骤为:
[0007](I)将干净鲜蚯蚓搅碎得到蚯蚓样品液，或将蚯蚓干品捣碎并浸泡于水中得到蚯虫引样品液；
[0008](2)所述蚯蚓样品液利用所述蚯蚓样品液中含有的酶或加入的蛋白酶水解，得到富含地龙肽的水解液；
[0009](3)将所述水解液经截留分子量小于等于3000道尔顿的超滤膜过滤，滤液再采用分子量为300道尔顿的纳滤膜进行截留，得到的截留液冷冻干燥，得到地龙肽。
[0010]在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述蚯蚓为钜蚓科动物参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蝈、湖北环毛蚓、直隶环毛蚓、异毛环毛蚓、白颈环毛蚓、背暗异唇蚓或赤子爱胜蚓中的一种或多种。
[0011]在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述干净蚯蚓是将新鲜的蚯蚓洗净，置于水中1-48小时得到，所述捣碎的蚯蚓干品与水的比例为Ig: 0-20ml，所述浸泡时间为0-48h。
[0012]在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)中所述蚯蚓样品液与所述水的体积比为I: 1-10，所述水解的条件为pH值为2-10、温度为20-70°C、水解时间为0.5-10h。
[0013]提供一种抗皮肤老化的地龙肽在抗皮肤老化化妆品或保健品中的用途。
[0014]本发明的有益效果是:本发明的抗皮肤老化的地龙肽及其制备方法和应用，该方法绿色、简单，制备得到的地龙肽亲和性强、安全性高，具有明显的抗氧化活性，能有效促进人皮肤成纤维细胞的生长和增殖，对细胞基质胶原蛋白的分泌合成有着显著的促进作用，具有明显的抗皮肤老化作用，可应用于抗皮肤老化化妆品和保健品的开发。

[0015]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0016]实施例一:
[0017]提供一种地龙肽的制备方法，包括步骤为:`[0018](I)将新鲜的蚯蚓洗净，置于去离子水或纯净水中24h，使蚯蚓排尽体内的食物残渣，再用高速捣碎机将洗净的蚯蚓搅碎，蚯蚓搅碎液即为鲜蚯蚓样品液；其中所述新鲜蚯蚓为矩蝴科动物参环毛蝴(P.aspergillum(E.Perrier))、通俗环毛蝴(P.vulgaris Chen)、威廉环毛虫引(P.guillelmi (Michaelsen))、木节盲环毛蝈(P.pectinifera(Michaelsen))、湖北环毛虫引(P.hupeiensis)、直隶环毛虫引(P.tschiliensis)、异毛环毛虫引(P.diffringens)、白颈环毛虫引(P.californica)、背暗异唇虫引(Allolobophora caliginosa trapezoides)或赤子爱胜蝴(Eisenia foetida)等中的一种或多种。
[0019](2)向蚯蚓样品液中加入2倍体积的去离子水，利用自身酶进行水解，酶解条件为:pH值为6.5、温度为40°C、水解3h，即得富含地龙肽的水解液。
[0020](3)将水解液经截留分子量为3000道尔顿超滤膜过滤，滤液再采用分子量为300左右的纳滤膜进行截留，截留液冷冻干燥，即为地龙肽。
[0021]实施例二
[0022]提供一种地龙肽的制备方法，包括步骤为:
[0023](I)将新鲜的蚯蚓洗净，置于去离子水或纯净水中36h，使蚯蚓排尽体内的食物残渣，再用高速捣碎机将洗净的蚯蚓搅碎，蚯蚓搅碎液即为鲜蚯蚓样品液；
[0024]将蚯蚓干品进行捣碎，然后用5倍质量体积去离子水或纯净水浸泡，浸泡液即为蚯蚓样品液；
[0025](2)鲜蚯蚓样品液和干蚯蚓(地龙)样品液按照体积比2: I进行混合，利用自身酶进行水解，酶解条件为:PH值为6.5、温度为45°C、水解6h，即得富含地龙肽的水解液。
[0026](3)水解液经截留分子量为3000道尔顿超滤膜过滤，滤液再采用分子量为300左右的纳滤膜进行截留，截留液冷冻干燥，即为地龙肽。
[0027]实施例三:
[0028]提供一种地龙肽的制备方法，包括步骤为:
[0029](I)将蚯蚓干品进行捣碎，然后用5倍质量体积去离子水或纯净水浸泡，浸泡液即为蚯蚓样品液；
[0030](2)干蚯蚓样品液50ml，添加0.5mg酶活力单位为12000U / mg的中性蛋白酶，进行酶解，酶解条件为:PH值为7.0、温度为40°C、水解2h，即得富含地龙肽的水解液。
[0031](3)水解液经截留分子量为3000道尔顿超滤膜过滤，滤液再采用分子量为300左右的纳滤膜进行截留，截留液冷冻干燥，即为地龙肽。
[0032]实施例四:
[0033]地龙肽的体外抗氧化活性实验:
[0034](I)样品溶液配制:采用去离子水，将地龙肽配制成不同浓度的样品液。
[0035](2)DPPH溶液的配制:将1，1-二苯基_2_三硝基苯肼即DPPH溶于无水乙醇中，配制成浓度为lmmol / L的母液，于4°C中避光存放，使用前稀释为IOOymol / L的DPPH无水乙醇溶液。
[0036](3)分别取2mL样品液及浓度为100 μ mol / L的DPPH溶液lmL，先后加入同一试管中，摇匀，室温下静置30分钟，于517nm波长下测定样品吸光度。
[0037]清除率:k%=[l-(A1-Aj) / Ac] X 100%，其中 Ai 为 Iml DPPH 溶液和 2ml 样品液的吸光度，Aj为Iml溶剂和2ml样品液的吸光度，Ac为Iml DPPH溶液和2ml溶剂的吸光度。
[0038](4)实验结果:当地龙肽浓度为Img / ml时，对DPPH自由基的清除率为22.69%,当浓度提高至5mg / ml时，清除率提高至48.16%，浓度为IOmg / ml时，清除率达到了92.2%。
[0039]实施例五:
[0040]地龙肽的体外抗氧化活性实验:
[0041](I)样品溶液配制:采用去离子水，将地龙肽配制成不同浓度的样品液。
[0042](2)在试管中加入0.05mmol / L且pH值为8.2的Tris_HC14mL，25°C下水浴预热20min，依次加入lmmol / L邻苯三酚0.5mL、待测样品0.5mL，25°C下反应4min，测定325nm的吸光度。各管加入的试剂如下表所示:
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