一种神经轴突牵拉生长装置制造方法 [0002]据美国国家脊髓损伤统计中心2011年公布的数据，当前美国约存活265，000例脊髓损伤病人，平均每年新增约12，000例脊髓损伤病人。在中国，每年新增约6万脊髓损伤患者。目前临床治疗脊髓损伤方法主要包括手术、药物治疗和长期运动康复等。然而，神经组织的大量损失及再生功能的衰竭，使得当前治疗手段非常有限。现阶段，临床上主要是通过自体神经移植来进行神经修复，不仅能够填充损伤缺陷，而且能够给截断神经的近端末梢延伸提供一个内在导向，但是，自体神经由于来源受限、直径细小等原因根本无法满足修复大量损坏神经的需求,而且被截取后的神经会永久的失去功能,并有形成神经瘤的风险。 [0003]近年来，通过神经细胞体外培养或干细胞诱导神经细胞再生成为神经再生与神经修复领域的研究热点。然而，体外培育的神经组织往往因为生长方向杂乱无章，进行移植后，机体功能恢复仍然比较少。如何让神经向有助于功能恢复的方向生长一直制约着神经修复技术的发展。现代生物研究表明，力学因素对细胞的生长、分化及增殖起着至关重要的作用。此外，已有大量文献表明，电刺激可有效地进行神经调控，加速神经再生与功能修复。因此，本研究涉及的神经轴突牵拉生长装置可对培养的神经轴突实施机械牵拉和电刺激，促进神经轴突的定向、快速生长，为神经再生和功能修复提供先进的组织工程手段。 [0004]中国实用新型专利200910009465.2公开一种对贴壁细胞进行循环牵拉的牵引器。该装置通过电机驱动细胞培养皿支架往复运动，对固定在支架上的细胞培养皿产生动力性牵拉，间接牵拉贴壁细胞。该装置主要用于研究肌腱细胞在循环载荷下生物学改变，其控制系统的精确度和稳定性较差，不满足神经轴突持续牵拉生长的要求。 [0005]中国实用新型专利201010583804.0公开了一种用于细胞牵拉刺激的高通量培养装置。该装置使用嵌有硅胶膜的双层有机玻璃孔板结构，通过使用单一压力源对硅胶膜上所有细胞培养单元同时施加周期性压力，从而对细胞牵拉实现控制。该装置不仅可以精细调节薄膜拉伸量、实现周期性牵拉，而且还可以直接在倒置显微镜下观察。但该方法主要依靠硅胶材料的形变来对细胞进行重复牵拉，使得牵拉长度有限。而人体的神经修复，往往需要数厘米的神经组织，因此采用硅胶材料形变进行牵拉，无法培育足够长度的神经轴突，同时该专利未涉及刺激电极的放置，无法实施神经电刺激。 [0006]中国实用新型专利201110392367.9公开了一种牵张-电联合刺激三维细胞培养装置。该装置采用牵张力刺激与电刺激联合加载，将三维细胞培养物置于牵张刺激与电刺激的联合作用下，模拟体内细胞生存环境，促进细胞的生长及分化，构建出具有特定功能的组织。但该装置无法控制神经轴突生长的长度、方向、速度，不能满足神经再生与神经修复的要求。实用新型内容 [0007]本实用新型的目的是提供一种神经轴突牵拉生长装置，可以在较短时间培养大量长度合适、排列规律的神经束，用于神经修复，以解决以往自体神经修复来源有限和直径大小难以匹配的问题。本实用新型还提供了该装置的控制系统，可控制轴突牵拉的速度、步长、时间，可控制多只独立的细胞牵拉生长装置同时工作。
[0008]为达到上述目的，该实用新型通过以下技术方案实现，神经轴突牵拉生长装置由培养与牵拉控制系统和机械装置两部分组成。其中，培养与牵拉控制系统包括有细胞培养箱、上位机、控制器和步进电机，机械装置包括有连接步进电机的联轴器、滚珠丝杆直线滑台、牵拉连接块、细胞牵拉生长装置、装置支撑架、底座。
[0009]细胞牵拉生长装置设于装置支撑架上，连同步进电机、联轴器、滚珠丝杆线性滑台固定在底座上，底座放置于细胞培养箱内，保证37°C温度、95%相对湿度和5%二氧化碳的培养条件。细胞培养箱设有一个与外界相通的孔道，用于通过步进电机的数据线连接控制器，优选地，所述孔道位于细胞培养箱后侧，孔道与数据线连接处采用硅胶密封。
[0010]细胞牵拉生长装置包括:培养座、盖子、牵拉杆、支撑杆、支撑块、牵拉块、玻璃片、牵拉膜和底膜。培养座为一体化长方形结构，其中，支撑块和牵拉块位于培养座中部，牵拉杆位于培养座的端部中央，支撑杆穿过支撑块设于培养座的两侧，底膜涂上硅胶粘附于培养座底部槽内，玻璃片粘附于培养座两侧凹槽内，高度略低于培养座两侧高度且可调。
[0011]上位机通过编程可控制牵拉的参数，包括细胞牵拉的位移、速度、持续时间。控制器接收上位机的控制指令，从而驱动步进电机旋转。步进电机带动联轴器一端的滚珠丝杆直线滑台产生线性位移，通过固定在直线滑台上的牵拉连接块牵拉细胞牵拉装置的牵拉杆，牵拉杆带动牵拉膜的移动，从而间接牵拉神经轴突。
[0012]本实用新型的优点在于:
[0013](I)本实用新型构建了一个神经轴突牵拉培养的装置，可灵活控制轴突生长的长度、方向、速度。可根据病人需要，在较短时间内培养出长度合适、生长规律的神经组织，用于神经损伤修复，具有广泛的应用前景。
[0014](2)通过本实用新型构建的牵拉控制系统，能同时对多个独立的细胞牵拉装置进行牵拉，方便实验对照。还能牵拉不同的神经细胞或组织轴突，同时培育运动、感觉等不同功能的神经组织进行移植。
[0015](3)本实用新型使用的牵拉膜和底膜分别采用聚三氟氯乙烯薄膜，该膜生物兼容性好、透明，且抗高温高压，不易发生形变，方便灭菌、观察和牵拉。
[0016](4)本实用新型可在底膜和牵拉膜上镀上电极触点，与多通道神经信号记录刺激系统相连，用于记录神经信号，并对神经进行电刺激。




[0017]图1为本实用新型实施例中一种神经轴突牵拉生长装置结构示意图；
[0018]图2为本实用新型实施例中细胞牵拉生长装置机械结构图；
[0019]图3为本实用新型实施例中细胞牵拉生长装置无盖子主视图；
[0020]图4为本实用新型实施例中细胞牵拉生长装置牵拉原理图；
[0021]图5为本实用新型实施例中轴突牵拉生长控制结构图；
[0022]图6为本实用新型实施例中用于分组实验的示意图；
[0023]图7为本实用新型实施例中结合电刺激的细胞牵拉生长示意图；
[0024]图8为本实用新型实施例中底膜或牵拉膜上电极阵列示意图。


[0025]为了使本实用新型的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本实用新型进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本实用新型，并不用于限定本实用新型。此外，下面所描述的本实用新型各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0026]如图1所示，本实用新型所涉及的一种神经轴突牵拉培养的装置，由培养与牵拉控制系统和机械装置两部分组成。培养与牵拉控制系统包括有细胞培养箱1、上位机2、控制器3和步进电机4，机械装置包括有连接步进电机的联轴器5、滚珠丝杆直线滑台6、牵拉连接块7、细胞牵拉生长装置8、装置支撑架9、底座10。
[0027]细胞培养箱I后侧设有一个与外界相通的孔道，步进电机4的数据线通过孔道连接控制器3，孔道与数据线连接处采用硅胶密封。细胞培养箱I为密封结构，可提供细胞生长所需的二氧化碳、温度和湿度环境。
[0028]上位机2通过编程可控制牵拉的参数，包括细胞牵拉的位移、速度、持续时间。控制器3接收上位机2的控制指令，从而驱动步进电机4旋转。步进电机4带动联轴器5 —端的滚珠丝杆直线滑台6产生位移，细胞牵拉生长装置8固定在装置支撑架9上，通过固定在直线滑台上的牵拉连接块7而间接牵拉神经轴突。
[0029]其中，所述牵拉连接块7、装置支撑架9、底座10采用聚四氟乙烯材料。
[0030]如图2?4所示，本实用新型所涉及的细胞牵拉生长装置呈长方体结构，由培养座11、牵拉杆12、盖子13、玻璃片14、支撑杆15、支撑块16、牵拉块17、牵拉膜18和底膜19组成。
[0031]其中，所述的培养座11为一体化设计结构。支撑块16和牵拉块17位于培养座中部，可在培养座11内移动；牵拉杆12位于培养座11的端部中央；支撑杆15设于培养座11的两侧，两端用螺丝紧固；底膜19通过涂上硅胶粘附于培养座11底部小槽内，用于细胞的培养；玻璃片14通过娃胶粘附于培养座11两侧凹槽内，便于观察，同时玻璃片14略低于培养座11的高度。
[0032]其中，所述的盖子13为C型结构，与玻璃片14形成缝隙，实现内部环境的气体流通。
[0033]其中，所述的支撑块16为T型结构，支撑块16两侧穿插支撑杆15，使支撑块16固定于培养座11中并保持平衡；支撑块16中部有凹槽，该凹槽结构用于嵌套牵拉块17，牵拉杆12将先后穿过于支撑块16和牵拉块17，用螺丝将牵拉杆12的一端固定于牵拉块17顶部的中央。
[0034]其中，所述的牵拉块17为楔形结构，牵拉块17上部为立体状，下部为弧状，配合支撑块16对生长的神经轴突进行牵拉。牵拉块17上部中央设有通孔，配合牵拉杆12穿过；牵拉块17顶部中间设有螺丝通孔，配合固定牵拉杆12 ;牵拉块17下部的弧形用于牵拉膜18的牵引，使牵拉膜延伸部位贴于底膜19。
[0035]其中，所述的牵拉杆12的一端先后穿过支撑块16和牵拉块17，另一端则延伸至培养座11外，并在培养座11端部的中间用螺丝将牵拉杆12固定，防止牵拉杆12在细胞培养期间松动。
[0036]其中，所述的牵拉膜18为长方形的透明性薄膜，用硅胶垂直粘附在支撑块16和牵拉块17的中间。如图5所示，牵拉膜18延伸部分与底膜19紧贴，通过机械牵拉可对贴附于牵拉膜18和底膜19上生长的轴突产生机械刺激。
[0037]其中，所述细胞牵拉生长装置8的培养座11、支撑块16、牵拉块17均采用聚四氟乙烯材料，所述的盖子13为有机玻璃材料，所述的牵拉杆12、支撑杆15采用不锈钢材料。
[0038]在本实施例中，为对神经轴突进行牵拉生长，设计了一套神经轴突牵拉生长装置。使用前，先将牵拉膜18和底膜19裁剪为所需的形状，牵拉膜18 —侧打磨成平滑的坡度，然后将所有部件用去离子水清洗2-3遍，再用酒精和紫外灯灭菌消毒。装配时，用螺丝把牵拉杆12紧固，将支撑块16和牵拉块17分开，在支撑块16和牵拉块17相对应的一侧分别涂上硅胶，用镊子夹取牵拉膜18插入支撑块16与牵拉块17之间，并移动支撑块16将牵拉膜18夹紧。然后，在培养座11底部槽内边上涂上硅胶，用镊子夹取底膜19从培养座11底槽的一端慢慢贴附上去，并使用灭菌棉棒的一头轻轻按压，将多余的硅胶挤压出来。装置装配完毕后，在紫外灯下放置数小时至硅胶凝固，然后加入无菌水浸泡数天，至硅胶乙酸释放完毕，方可进行细胞培养。将神经细胞或者组织放置于牵拉膜18和底膜19两侧，相距100微米以内，待两侧的神经细胞形成突触连接，即可对轴突进行机械牵拉。为防止机械牵拉位移过大从而使轴突断裂，每次牵拉的步距需设计为1-2 μ m。
[0039]在本实施例中，如图5所示，由数据线将上位机2控制指令下载到控制器3，从而驱动步进电机4旋转，进而通过联轴器5带动固定在滚珠丝杆线性滑台6上的牵拉连接块7产生位移，牵拉连接块7通过牵拉杆12和牵拉块17带动牵拉膜18在底膜19上移动，从而对生长在牵拉膜18和底膜19上的神经轴突产生牵拉。
[0040]在本实施例中，牵拉膜18和底膜19采用聚三氟氯乙烯薄膜,该膜生物兼容性好、透明，且抗高温高压，不易发生形变，方便灭菌、观察和牵拉。优选地，所述牵拉膜18和底膜19分别采用50 μ m和198 μ m的聚三氟氯乙烯薄膜。
[0041]进一步地，装置支撑架9可放置多个细胞牵拉生长装置8，根据要求可选择对一个或多个细胞牵拉生长装置8进行牵拉。在本实施例中，如图6所示，可同时对多个独立的细胞牵拉装置8进行牵拉，牵拉不同的神经细胞或组织轴突，同时培育运动、感觉等不同功能的神经组织，进行对照实验。
[0042]在本实施例中，如图7?8所示，牵拉膜18和底膜19上可镀上电极触点，与多通道神经信号记录刺激系统相连，用于记录神经的信号，并对神经不同位点进行选择性刺激，设计了一套神经轴突的电刺激方案，底膜18和牵拉膜19为一种透明状微电极阵列的柔性电路板。神经轴突牵拉生长后，可对牵拉生长的轴突进行电刺激，并记录相应的神经电生理信号。
[0043]本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本实用新型的较佳实施例而已，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。