专利名称：一种甘草次酸温敏凝胶及其制备方法肝脏是人体最大的实体器官，对维持生命和内环境的稳定起着举足轻重的作用。 然而，肝癌、急性肝衰竭等疾病严重威胁着人类的健康。我国更是世界上肝病的高发区，每年因肝病死亡的人数超过10万，发病率占全球的50%以上。因此，肝脏疾病的治疗成为目前医药卫生领域的重中之重。在肝病治疗过程中，肝移植是目前最有效、最彻底的治疗手段，但供肝来源短缺、 异体免疫排斥等制约了其发展；人工肝的研究和发展为肝病治疗提供了另外一种方法，但它只能暂时缓解症状或者短期延续病人的生命；组织工程学概念的提出，为解决这些难题提供了宝贵的理论依据。在组织工程学四要素中，生物材料占据最重要的地位。工程化组织常将种子细胞种植在能够提供力学和化学信号的生物活性降解支架上，引导细胞分化与组装成三维组织。高聚物水凝胶内部网络结构中充斥大量水分，具备流体的性质，与充盈有大量水性液体的机体组织非常相似，柔软、润湿的表面以及与组织的亲合性减少了材料对周围组织的刺激，因此，组织工程常采用水凝胶作为细胞释放载体。在这些水凝胶中，一类具有环境刺激响应性的水凝胶，由于具有独特的性质，如温度响应性、PH值响应性、光响应性、生物分子响应性、电场响应性等，在组织工程、药物释放、蛋白质分离、酶的固定、信号传感等领域得到广泛应用。聚异丙基丙烯酰胺(POTPAAm)温度敏感性凝胶在组织工程学方面的研究尤其引人关注。其在水溶液中的临界溶解温度(LCST)为32°C，当环境温度低于32°C时，PNIPAAm 表现亲水性，从环境吸水发生溶胀，分子链表现为伸展状态；当环境温度高于32°C时， PNIPAAm表现疏水性，分子链脱水，发生急剧收缩，呈收缩构型。正是由于PNIPAAm凝胶的 LCST在人体正常体温(37°C)附近，植入人体时，其体积会发生急剧变化，从而可以应用在组织工程、器官重建、再生医学等领域。细胞在细胞外基质(ECM)表面进行培养时，互相之间结合，会形成细胞片层。回收细胞片层所用的传统方法是以蛋白酶使细胞外基质(ECM)降解，从而使培养细胞脱附，此时常损及细胞一细胞连接蛋白和细胞膜上表达的受体蛋白，并且得不到完整的细胞片层。 将PNIPAAm凝胶应用于细胞培养，利用其温度敏感性可以成功解决这一问题。在人的正常体温(37°C )条件下，将细胞于PNIPAAm凝胶表面培养，待细胞片层形成后，降低环境温度到32°C以下，PNIPAAm分子发生由疏水到亲水的转变，分子链由收缩状态变为伸展状态，这样使细胞片层从基质表面自然脱落。因为无需使用蛋白酶，这使得对酶敏感的细胞如肝细胞和胶质细胞能保持其分化的细胞功能，并得到完整的细胞片层。但由于PNIPAAm生物相容性差，细胞在其上成活率较低，大大限制了 POTPAAm的应用。肝细胞是一种吸附型细胞，与细菌或某些悬浮型细胞不同，肝细胞不适应悬浮生长，而需要粘附在一个载体的表面以保持其细胞活性和功能。细胞在载体表面的吸附是通过载体表面的配体与细胞表面的受体间的相互作用完成的，在不同的载体和配体表面，细胞会表现出不同的活性、形态和功能。甘草次酸存在于甘草的根、茎部，在传统中药处方中应用极其广泛。很多研究证实，肝实质细胞膜表面存在GA受体，这些结合位点具有高度特异性和饱和性，脂质体经甘草次酸修饰后具有良好的趋肝性和肝细胞靶向性，可在肝脏高度蓄积，广泛应用于肝脏疾病的治疗和肝脏保护中。针对现有技术的不足，本发明将与肝细胞具有特异结合性的甘草次酸 (glycyrrhetinic acid, GA)引入PNIPAAm凝胶，增强支架材料的生物相容性和细胞结合位点，为肝细胞的培养构建一种新型微环境，同时利用PNIPAAm的温度响应性，实现细胞的无损伤脱附。
本发明的目的是设计一种新型高分子智能凝胶，该凝胶具有良好的温度响应性和肝细胞特异结合性。而且，通过改变温度，凝胶可以发生亲疏水性转变，用于实现细胞的无损伤脱附。本发明的技术方案包括甘草次酸温敏凝胶的设计方案和其制备方法的技术方案。甘草次酸温敏凝胶的制备方法包括(1)甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)的制备将甘草次酸(GA)溶于四氢呋喃(THF)中，冷却至-10°C，加入1 3g DCC，搅拌 30min，加入SuOH，GA与SuOH的质量比为3 5 1，溶液浓度为0. 1 0. 5g/mL，在-10°C 下继续搅拌2 4h，然后在不高于20°C的室温下搅拌15 20h，滤除二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。(2)甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)将GSE溶于N、N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，溶液浓度为0. 05 0. lg/mL，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到乙二胺(EDA)中，GSE与EDA摩尔比为1 20 40mol，混合液在50°C 80°C下反应20 30h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。(3)乙烯基甘草次酸单体(AAc-GA)的合成将GA-NH2溶于DMF中，溶液浓度为0. 1 0. 5g/mL,加入AAc，GA-NH2与AAc质量比为4 6 lg，氮气保护氛围，再加入0.01 0.03g sulfo-NHS活化剂和0. 05 0. Ig EDC缩合剂，室温下反应20 30h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(AAc-GA)。(4)P(NIPAAm-co-AAc-GA)共聚凝胶的合成将单体NIPAAm 和 AAc-GA 溶于 DMF 中，AAc-GA 与(AAc-GA+NIPAAm)的质量比为 0 0.5 lg，这个意思不明白，是否指AAc-GA与NIPAAm的质量比例？请确认，溶液浓度为0. 1 0. 4g/mL,室温下搅拌，通氮气IOmin后加入0. 05 0. Ig MBAA交联剂，待完全溶解后，再加入0. 02 0. (MgAIBN弓|发剂，继续氮气保护IOmin,滴入50 100 μ 1 2 %的TEMED， 搅拌IOmin后撤掉氮气保护，并马上将溶液倒入模具中，密封，50°C 80°C下反应M 48h 生成P (NIPAAm-co-AAc-GA)凝胶。将凝胶切成圆片，在DMF中浸泡2d，然后在蒸馏水中浸泡 4d，每天换液，除去未反应的单体。本发明设计的甘草次酸温敏凝胶具有良好的综合性能一方面由于甘草次酸具有与肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)进行特异性结合的功能，它的引入增强了肝细胞在材料表面的吸附力，从而促进肝细胞在材料表面的增殖分化；另一方面，温敏性材料 NIPAAm的引入，实现了细胞脱附智能化，通过控制环境温度，达到了细胞的自然脱附，可以得到完整的细胞片层，避免了传统酶解法对细胞功能造成的损伤，同时由于可将得到的细胞片层直接植入主体，不必连同支架材料植入主体，从而避免了支架材料必须可生物降解以及主体对材料的免疫学等方面的限制。由于所述的良好综合特性，本发明温敏性甘草次酸基凝胶在肝组织工程支架材料、肝细胞培养基质材料等方面可以得到广泛应用。此外，所述制备方法工艺流程简单，实验条件温和，不需要特殊设备，投资成本低， 具有良好的可操作性，且所用试剂均为常规试剂，反应残余物容易去除，便于工业化实施。7将2. 03g GSE溶于20mL DMF,用恒压滴液漏斗缓慢滴加到7mL乙二胺(EDA)中，混合液在80°C下反应20h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。(3)甘草次酸大单体(AAc-GA)的合成将5gGA-NH2溶于20mLDMF中，加入 ImL AAc，用氮气保护，再加入0. Olg suIfo-NHS 活化剂和0. 07g EDC缩合剂，室温下反应20h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去， 在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(AAc-GA)。(4)P(NIPAAm-co-AAc-GA)共聚凝胶的合成将2. 0848g NIPAAm 和 0. 8935g AAc-GA 溶于 IOmL DMF,室温下搅拌，通氮气 IOmin 后加入0.05g MBAA交联剂，待完全溶解后，再加入0.02g AIBN引发剂，继续氮气保护 lOmin，滴入50μ 1 2%的TEMED，搅拌IOmin后撤掉氮气保护，并马上将溶液倒入模具中，密封，50°C下反应48h，生成P (NIPAAm-co-AAc-GA)凝胶。将凝胶切成圆片，在DMF中浸泡2d， 然后在蒸馏水中浸泡4d，每天换液，除去未反应的单体。

本发明公开了一种甘草次酸温敏凝胶及其制备方法，属于功能高分子材料技术领域。本发明通过将与肝细胞具有特异结合性的甘草次酸(GA)引入PNIPAAm凝胶，改善支架材料的生物相容性。设计制备的新型凝胶不仅具有良好的温度响应性和肝细胞特异结合性，而且，通过改变温度，凝胶可以发生亲疏水性转变，实现了细胞脱附智能化，避免了传统酶解法对细胞功能造成的损伤。所述制备方法工艺流程简单，实验条件温和，具有良好的可操作性，且便于推广实施。