专利名称：中药组合物在制备抗71型肠道病毒的药物中的用途的制作方法1969年，美国在中枢神经系统疾病婴儿的粪便标本中分离出71型肠道病毒(EV71)。根据国际病毒分类委员会(ICTV)的最新分类，人肠道病毒被分为A、B、C、D和新肠道病毒(未分型)五类。之后肠道病毒原有的血清型又被重新归类，其中71型肠道病毒 (EV71)被归为人肠道病毒A型。EV71可经消化道和呼吸道传播，其传染性和毒力强，神经毒性仅次于脊髓灰质炎病毒。部分患者可排毒数周，病毒可在污水中存活较长时间。各年龄人群均可感染该病毒，成人和大年龄儿童主要为隐性感染，发病者主要为学龄前儿童，重症感染多见于婴幼儿。常在局部地方引起爆发感染，暴发原因不确定。EV71引起的临床表现多样以手足口病、疱疹性咽峡炎等多见，少数可表现为无菌性脑膜炎及脑炎，重症患儿病死率为10% -25%。目前，对EV71感染尚缺乏有效的抗病毒药物，对由其引发疾病的预防和治疗的重点是研制开发有效的预防性疫苗，已有灭活疫苗、减毒疫苗、多肽或蛋白疫苗、DNA疫苗等多种尝试，但至今尚无EV71疫苗上市。因此，急需开发可以安全、有效的抗71型肠道病毒的药物。
因此，本发明的目的是提供一种能够有效抑制71型肠道病毒的药物，进而成功预防和/或治疗由该病毒引起的多种疾病。一方面，本发明提供一种中药组合物在制备抗71型肠道病毒的药物中或者在制备治疗或预防由71型肠道病毒引起的疾病的药物中的用途，该中药组合物是由以下原料药制成的鱼腥草、忍冬藤、板蓝根和山豆根。优选地，所述药组合物中四种原料药的重量百分比为鱼腥草4.7重量％ —70. 0重量％、忍冬藤4. 7重量％ —46. 7重量％、板蓝根2. 3重量—42. 0重量*%、山根I. 2重量—35. 0重量。优选地，所述中药组合物还包括其它清热解毒类中药；优选地，所述其它清热解毒类中药选自贯众、白芷、穿心莲、蒲公英、青黛、红藤、重楼、青蒿、川射干、鸦胆子、薄荷、桔梗和甘草。优选地，所述中药组合物是由以下原料药制成的鱼腥草、忍冬藤、板蓝根、山豆根、贯众和白芷。优选地，所述药组合物中六种原料药的重量百分比为鱼腥草4.7重量％ —58. 4重量％、忍冬藤4. 7重量％ —46. 7重量％、板蓝根2. 3重量％ —42. 0重量％、山豆根I. 2重量％ —35. 0重量％、贯众I. 9重量％ —37. 3重量％、白芷I. 2重量％ —35. 0Mm % o优选地，所述中药组合物是由以下原料药制成的鱼腥草、忍冬藤、板蓝根、山豆根、贯众、白芷、重楼、青蒿和川射干。优选地，所述药组合物中九种原料药的重量百分比为鱼腥草9.3重量％ —46. 7重量％、忍冬藤9.3重量％ —37. 3重量％、板蓝根4. 7重量％ —35. 0重量％、贯众2. 3重量％ —28. 0重量％、山豆根2. 3重量％ —23. 3重量％、白芷2. 3重量％ —23. 3重量％、重楼2. 3重量％ —23. 3重量％、青蒿2. 3重量％ —23. 3重量％、川射干2. 3重量％ -23. 3重量％。更优选地，所述药组合物中九种原料药的重量百分比为鱼腥草14. 0重量％ —35. 0重量％、忍冬藤11.7重量％ —23. 3重量％、板蓝根9. 3重量％ —21. 0重量％、贯众7. 0重量％ —18. 7重量％、山豆根4. 7重量％ —11. 7重量％、白芷4. 7重量％ —11. 7重量％、重楼4. 7重量％—11. 7重量％、青蒿4. 7重量％—11. 7重量％、川射干4. 7重量％-11. 7重量％。最优选地，所述药组合物中九种原料药的重量百分比为鱼渥草21. 4重量、忍冬藤17. 9重量、板蓝根14. 3重量、贯众10. 7重量、山Ii根7. I重量、白IE 7. I重量、重楼7. I重量、青蒿7. 2重量、川射干7. 2重量。在上述用途中，所述中药组合物优选为颗粒剂。 另一方面，本发明提供一种中药组合物在抗71型肠道病毒或者治疗或预防由71型肠道病毒引起的疾病中的用途，该中药组合物是由以下原料药制成的鱼腥草、忍冬藤、板蓝根和山豆根。优选地，所述药组合物中四种原料药的重量百分比为鱼腥草4.7重量％ —70. 0重量％、忍冬藤4. 7重量％ —46. 7重量％、板蓝根2. 3重量％ —42. 0重量％、山ii根I. 2重量—35. 0重量。优选地，所述中药组合物还包括其它清热解毒类中药；优选地，所述其它清热解毒类中药选自贯众、白芷、穿心莲、蒲公英、青黛、红藤、重楼、青蒿、川射干、鸦胆子、薄荷、桔梗和甘草。优选地，所述中药组合物是由以下原料药制成的鱼腥草、忍冬藤、板蓝根、山豆根、贯众和白芷。优选地，所述药组合物中六种原料药的重量百分比为鱼腥草4.7重量％ —58. 4重量％、忍冬藤4. 7重量％ —46. 7重量％、板蓝根2. 3重量％ —42. 0重量％、山豆根I. 2重量％ —35. 0重量％、贯众I. 9重量％ —37. 3重量％、白芷I. 2重量％ —35. 0Mm % o优选地，所述中药组合物是由以下原料药制成的鱼腥草、忍冬藤、板蓝根、山豆根、贯众、白芷、重楼、青蒿和川射干。优选地，所述药组合物中九种原料药的重量百分比为鱼腥草9.3重量％ —46. 7重量％、忍冬藤9.3重量％ —37. 3重量％、板蓝根4. 7重量％ —35. 0重量％、贯众2.3重量％ —28. 0重量％、山豆根2. 3重量％ —23. 3重量％、白芷2. 3重量％ —23. 3重量％、重楼2. 3重量％ —23. 3重量％、青蒿2. 3重量％ —23. 3重量％、川射干2. 3重量％ -23. 3重量％。更优选地，所述药组合物中九种原料药的重量百分比为鱼腥草14. 0重量％ —35. 0重量％、忍冬藤11.7重量％ —23. 3重量％、板蓝根9. 3重量％ —21.0重量％、贯众7.0重量％ —18. 7重量％、山豆根4. 7重量％ —11. 7重量％、白芷4. 7重量％ —11. 7重量％、重楼4. 7重量％ —11. 7重量％、青蒿4. 7重量％ —11. 7重量％、川射干4. 7重量％-11. 7重量％。最优选地，所述药组合物中九种原料药的重量百分比为鱼渥草21. 4重量、忍冬藤17. 9重量、板蓝根14. 3重量、贯众10. 7重量、山 根7. I重量、白IE 7. I重量、重楼7. I重量、青蒿7. 2重量、川射干7. 2重量。其中，上述由71型肠道病毒引起的疾病选自手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎和脑炎中的一种或多种。本发明经过大量实验发现，由鱼腥草、忍冬藤、板蓝根和山豆根为原料制成的中药组合物，具有明显的抗71型肠道病毒作用，进而可以成功预防和/或治疗由该病毒引起的多种疾病，包括手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎和脑炎等。此外，本发明还发现，由以下原料药制成的中药组合物也具有一定的抗71型肠道病毒作用板蓝根14. 0重量％ —37. 3重量％、连翘4. 7重量％ —25. 7重量％、广藿香3. 7重量％ —11. 7重量％、石膏3. 3重量％ —25. 7重量％、芦根3. 7重量％ —25. 7重量％、地黄3.7重量％ —14. 0重量％、石菖蒲3.7重量％ —14. 0重量％、郁金3.7重量％ —14.0重量％、知母3.7重量％ —14. 0重量％。可见，本发明提供的中药组合物，以天然植物作为原料药，对71型肠道病毒具有明显的抑制作用，由其制备而成的药物或添加剂，具有毒性小、作用强、安全有效等优点，为由71型肠道病毒引起的疾病的预防和治疗开辟了新的途径，具有重要的社会价值、经济价值和广阔的应用前景。


以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中SC :四川方；GB :国标方！negative 阴性对照！positive 阳性对照；d2、d3或d4(D2、D3SD4):第 2 日、第 3 日或第 4 日；sc5 :5mg/ml SC ；scl0 10mg/ml SC ；sc20 20mg/ml SC ；gbl0 10mg/ml GB ；gb20 20mg/mlGB ；gb40 40mg/ml GB ；图I显示SC对Vero细胞活力的影响；图2显示GB对Vero细胞活力的影响；图3显示加入四川方抗EV71病毒时的镜下细胞变化；图4显示加入国标方抗EV71病毒时的镜下细胞变化；图5为加入四川方后病毒繁殖的琼脂凝胶电泳图；图6为加入国标方后病毒繁殖的琼脂凝胶电泳图；图7显示加入四川方后对病毒繁殖的Real-time PCR检测结果(以20倍于TCID50EV71病毒进行检测);图8显示加入国标方后对病毒繁殖的Real-time PCR检测结果(以20倍于TCID50EV71病毒进行检测)。

对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。实施例I本实施例提供了中药组合物(四川方)的原料药处方及其制备方法，具体如下。原料药鱼腥草21. 4重量％、忍冬藤17. 9重量％、板蓝根14. 3重量％、贯众10. 7重量、山根7. I重量、白IE 7. I重量、重楼7. I重量、青蒿7. 2重量、川射干7. 2
重量％。取以上九味处方量。首先将鱼腥草加水煎煮10 40分钟，滤过，滤液浓缩至相对密度为I. 05-1. 20的清膏，放冷，加乙醇使含醇量为50 80%，静置24 48小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩得到相对密度为I. 05-1. 25的清膏，备用；忍冬藤等3味，加水煎煮2次，每次2小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为I. 40时，过滤，滤液再浓缩至相对密度为I. 45的清膏，加入上述鱼腥草清膏，混匀，继续浓缩至相对密度为I. 10以上的稠膏，取稠膏、蔗糖细粉按照I : 3 8的比例进行制粒，分装，即得。
实施例2本实施例提供了中药组合物(国标方)的原料药处方及其制备方法，具体如下。原料药板蓝根30. I重量％、连翘10. 8重量％、石膏13. 4重量％、知母5. 8重量、芦根14. 2重量、地黄7. 5重量、广藿香6. 6重量、石菖蒲5. 8重量、郁金5. 8
重量％。取以上九味处方量。首先将知母粉碎成最粗粉，加80 90%乙醇加热回流提取3次，每次3小时，过滤，滤液减压回收乙醇并浓缩，得到相对密度为I. 10 (500C )的清膏，备用。板蓝根等8味，加水煎煮三次(同时收集挥发油)，第一次I小时，第二和三次各0. 5小时，过滤，滤液浓缩，得到相对密度为I. 16(50°C )的清膏，加入上述知母清膏，混合均匀，浓缩，得到相对密度为I. 28 I. 30(55 60°C )的清膏。取清膏，加蔗糖粉适量，制成颗粒，干燥，加入上述收集的挥发油和食用香料适量，混匀，制成颗粒，分装，即得。实施例3抗EV71病毒的体外实验本实施例测试了实施例I和2制备的中药组合物在体外抗EV71病毒效果，具体如下。一、材料和方法I.材料I. I实验药物国标方KBD-GB (国药准字Z20010127) :4. 3g生药/ml浸膏四川方KBD_SC(国药准字Z51020073) :4. 7g生药/ml浸膏I. 2细胞Veix)细胞(非洲绿猴肾细胞)香港大学新发传染病国家重点实验室提供。I. 3病毒EV71/120Fl/ShenZhen/2009，香港大学新发传染病国家重点实验室提供。I. 4实验室的基本条件实验全程在生物安全二级实验室完成。二、实验方法2. I观察细胞病变效应(CPE)，测定病毒对Vero细胞的半数感染剂量(TCID5tl)将Vero细胞接种于96孔板，每孔100 yl，37°C、5% CO2培养24小时细胞长成单层。加入一系列10倍稀释的9个浓度的病毒培养液，每个浓度8孔，设细胞对照，37°C、5%CO2孵箱培养。72小时后观察CPE。用Read-Muench法计算病毒的半数感染剂量(TCID5tl)。2. 2MTT法测定待检药物对细胞的毒性反应将Vero细胞接种于96孔板，每孔100 yl，37°C、5% CO2培养24小时，细胞长成单层。吸去上清，加入不同稀释浓度的待检药物，每个浓度8孔，设细胞对照。371、5(%0)2孵箱培养，72小时后加入MTT染色3小时，吸去液体加入DMSO溶解半小时，酶联检测仪测定0D570nm吸收值。根据细胞活力确定药物的最大无毒浓度。
2. 3拍摄显微镜下细胞的改变将Vero细胞接种于24孔板，每孔1ml，37°C、5% C02培养24小时，细胞长成单层，药物从最大无毒浓度进行10倍稀释，共3个浓度，每个浓度2孔，每孔1ml，37°C、5% CO2培养24小时，吸去药物，加入20倍于TCID50的病毒120 yl，I小时后吸去病毒，再加入Iml药物，37°C、5%C02孵箱培养。分别于培养第2日、3日和4日采用显微镜观察并拍摄细胞形态，其中阴性对照生理盐水，阳性对照为达菲处理。2. 4PCR和Real-time PCR检测病毒的繁殖量将Vero细胞接种于24孔板，每孔lml，37°C、5% CO2培养24小时，细胞长成单层，药物从最大无毒浓度进行10倍稀释，共3个浓度，每个浓度2孔，每孔1ml，37°C、5% CO2培养24小时，吸去药物，加入20倍于TCID5tl的病毒120 yl，I小时后吸去病毒，再加入Iml药物，37°C、5% CO2孵箱培养。24,48和72小时取上清提取RNA，用PCR和Real-time PCR检测病毒的繁殖量。
三、实验结果3. I 病毒 TCID50 的测定病毒 EV71/120Fl/Shenzhen/2009 的 TCID50 为 IO5.125/ml。3. 2药物毒性的测定四川方KBD-SC(Z51020073)的最大无毒浓度为20mg/ml，参见图I ;国标方KBD-GB (Z20010127)的最大无毒浓度为40mg/ml，参见图2。3. 3显微镜下细胞的改变四川方抗EV71病毒的镜下细胞改变见图3。显微镜下可以看到药物浓度在5mg/ml, 10mg/ml和20mg/ml时，病毒感染的第三日都有为数不少的活细胞。药物浓度为20mg/ml时，部分活细胞的形态异常，不排除为药物对细胞的毒性作用。国标方抗EV71病毒的镜下细胞改变见图4。显微镜下可以看到药物浓度在IOmg/ml和20mg/ml时，病毒感染的第三日都有活细胞。药物浓度为40mg/ml时，没有活细胞，为药物对细胞的毒性作用。3. 4PCR检测24、48及72小时病毒的繁殖量采用琼脂糖凝胶电泳检测加入四川方时的病毒繁殖，结果见图5，显示四川方对EV71病毒的繁殖有一定的抑制作用。其中，PCR产物的电泳条带越浓显示病毒繁殖量越大，此实验结果显示药物浓度为5mg/ml、10mg/ml和20mg/ml时,在病毒感染的第三日、第四日都可以抑制病毒的繁殖。采用琼脂凝胶电泳检测加入国标方时的病毒繁殖，结果见图6。照片显示国标方对EV71病毒的繁殖有一定的抑制作用。其中，PCR产物的电泳条带越浓显示病毒繁殖量越大。此实验结果显示药物浓度为10mg/ml和20mg/ml时，在病毒感染的第三日，第四日都可以抑制病毒的繁殖。药物浓度为40mg/ml时，是药物对细胞的毒性作用而抑制病毒的繁殖。3. 5Real-time PCR定量检测病毒的繁殖量Real-time PCR检测加入四川方时的病毒繁殖。Real-time PCR的结果(参见图7和表I)显示不同浓度的四川方都能抑制EV71病毒的繁殖。5mg/ml、10mg/ml和20mg/ml浓度的药物在病毒感染后的第四日同样有明显的抑制病毒繁殖的能力。表I Real-time PCR检测加入四川方时的病毒拷贝数


本发明提供一种中药组合物在制备抗71型肠道病毒的药物中的用途。该中药组合物能够有效抑制71型肠道病毒，进而有效预防和/或治疗由该病毒引起的多种疾病。