专利名称：针对tweak及tweak受体的拮抗剂和它们在治疗免疫性疾病中的应用的制作方法免疫性疾病表现为多种疾病和病理状态，包括自身免疫病、急性和慢性炎症、器官移植排斥、移植物抗宿主疾病(GVHD)、淋巴细胞恶变、败血症和其它形式的休克、见于HIV和SCIDS中的免疫应答能力的丧失、和对肿瘤生长的免疫应答失败。许多免疫性疾病由对抗原的异常或无控制的应答引起。自身免疫性疾病是由免疫系统对自身抗原不适当的反应造成的，结果导致细胞和组织的损害。当来自骨髓移植物(BMT)的供体细胞同宿主(即病人)的抗原发生反应时，GVHD发生。当病人的免疫系统同来自移植器官的抗原反应时器官移植排斥发生。急性炎症反应例如超敏状态和休克是对激发抗原无控制的免疫应答的结果。T细胞依赖性免疫应答需要T细胞对抗原的识别。例如，GVHD是由供体T细胞同宿主免疫细胞间复杂的相互作用所引起的。首先发生的是供体T细胞对非自身即宿主抗原的识别。这些抗原被称为同种异体抗原。供体细胞对同种异体抗原的识别导致免疫调节性和炎性细胞因子及趋化因子的产生，它们提高和加速供体抗宿主的免疫应答。这种疾病的发生可以是急性的或慢性的，这取决于控制免疫应答类型的细胞因子复杂网络的调节作用。免疫应答可被鉴定为Th0、Th1或Th2，其依据1〕免疫应答过程中活化T细胞产生的细胞因子和趋化因子的性质2〕免疫应答过程中辅助细胞和其它细胞产生的细胞因子和趋化因子的性质。免疫应答过程中重要的非T细胞是B细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞、滤泡树突细胞和内皮细胞。所产生的细胞因子共同影响多种细胞类型的分化；所产生的趋化因子影响细胞的游走和定位。Th0应答的特点是此前未受过刺激的(初始的)T细胞受到短暂的刺激。Th0细胞产生中等量的多种细胞因子，其中，典型的是IL-2和TNF。在多种因素作用下，Th0细胞受到反复或慢性刺激后可分化成Th1或Th2细胞。这些因素包括但不限于辅助细胞细胞因子的产生、T细胞受体的参与程度和接受的第二信号如通过CD28共刺激受体传递的信号的性质。具体地，活化T细胞同最初由活化巨噬细胞产生的IL-12的接触支持其向Th1细胞的分化，而同IL-4和IL-10的接触支持其向Th2细胞分化。Th1细胞产生与炎症反应、T细胞细胞毒作用和巨噬细胞活化有关的细胞因子如IL-2和IFN-γ。Th1 T细胞同吸引细胞进入组织炎症部位的趋化因子如Mip-1α、MIP-1β、RANTES、IP-10和MIG反应。因为细胞毒性T细胞和活化巨噬细胞有清除损伤和感染的细胞的作用，所以Th1应答负责控制对细胞内病原体的免疫应答。重要的是，巨噬细胞和内皮细胞中象IP10和MIG这样的Th1趋化因子的产生受IFN-γ的密切调节，而IFN-γ即是Th1T细胞产生的典型的趋化因子。这样，反馈环路便可在活化T细胞和它们的环境之间形成，反馈环路的形成促进了在特定时间和部位特定类型免疫应答的发生。Th2 T细胞产生细胞因子如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，这些细胞因子有助于体液免疫应答的产生，包括需要IgE、IgA和IgG产生的体液免疫应答。这些Ig应答由T细胞介导的B细胞的活化引起，B细胞的活化即是将B细胞的Ig表型由表面结合型IgM和IgD“转换”成分泌型Ig。正常情况下，分泌型Ig控制来自循环中的病原体的感染(IgG)、粘膜表面如肠道和口腔的感染(IgA)和呼吸道的感染(IgE)。Ig的过量产生可导致疾病，如SLE(IgG和IgA)、超敏反应(I型)(IgE)和GVHD(IgG、IgA和IgE)。Th2 T细胞也有助于那些介导对病原体产生急性应答(如在呼吸道中)的嗜酸性粒细胞和肥大细胞的活化。Th2 T细胞对趋化因子如eotaxin和MDC产生反应，这些趋化因子的产生受IL-4紧密调节，而IL-4是NK1.1和活化T细胞产生的典型的细胞因子。T细胞和B细胞的相互作用是一个复杂的和受到精密调节的过程。为了开始活化过程，B细胞必须接受通过B细胞抗原受体(膜Ig)传递的抗原信号。继而，B细胞须接受来自活化T细胞的特异性接触依赖性和接触非依赖性信号。其中一种所需的接触依赖性信号通过T细胞表面CD40L和B细胞表面CD40的结合而传递；另一种所需的接触依赖性信号通过活化T细胞和NK1.1细胞分泌的IL-4同B细胞表面IL-4受体的结合而传递。这些信号似乎出现在二级淋巴器官如脾脏的T细胞区域。脾脏、淋巴结、扁桃体、Peyer′s淋巴集结和其它二级和三级淋巴器官中有明显的T细胞和B细胞定居的微解剖区。首先，通过跨越内皮细胞层如淋巴结和Peyer′s淋巴集结的高内皮小静脉和脾脏的边缘窦内皮细胞层，所有的淋巴细胞从血液或淋巴液中游出，进入这些器官的T细胞区域。然后，B细胞运动到称为B细胞滤泡的B细胞区。穿越T细胞区后未活化B细胞几天后离开滤泡。活化B细胞经历一个分化的过程。一些称为浆细胞的活化B细胞分泌大量抗原特异性、低亲和力IgM或IgG抗体。这些B细胞通常在诱导免疫应答后的早期出现，然后转移到脾脏的红髓和其它解剖学部位，随后的几天它们在那里停留、分泌抗体。其它活化B细胞在被称为次级滤泡或生发中心的滤泡部位分化。生发中心在称为滤泡树突细胞(FDC)的特异性抗原滞留细胞的网络周围形成，这些FDC提呈抗原以驱动或精神调节生发中心的反应。在生发中心中，B细胞转换了它们的Ig表型并且经历了“亲和力成熟”的过程，因此，可对它们的抗原靶呈现很高的亲和力。尽管在某些疾病如慢性GVHD和自身免疫性疾病中Ig识别自身抗原，但在正常情况下，抗原靶是外来抗原。最后，B细胞离开滤泡，再次通过T细胞区，通过输出循环离开此器官进入血流。已完全分化因而表达高亲和力Ig的B细胞称为母细胞，它们离开B细胞滤泡定居在其它各种环境中，包括脾脏的红髓、骨髓、肝脏、或呼吸道和肠道的内壁粘膜层。这些完全分化的B细胞中有一部分称为记忆细胞，它们能存活很长时间，如果再次遇到相同抗原，它们会迅速作出反应。B细胞在淋巴器官中从一个部位向另一部位迁移需要特异性信号指导它们和保证它们存活。例如，脾脏中B细胞滤泡的组织需要多种信号。这些包括BCA配体与趋化因子BLR-1受体之间的相互作用、TNF与TNF-R55之间的相互作用和LTβ与LTβ-R之间的相互作用(参见Chaplin和Fu，最新免疫学观点(Current Opin.Immunol.)10298-297(1998))。缺乏这些分子途径中的任何一种的小鼠都将会丧失脾脏中B细胞滤泡的完整性。此外，所有这些基因缺陷型小鼠也丧失了在脾脏中经历生发中心反应的能力。对其它分子途径的阻断仅仅影响生发中心反应。如，CD40L缺陷的小鼠保存了B细胞滤泡，但生发中心未形成。生发中心环境中的B细胞需要通过CD40的信号维持存活、下调IgM和转换Ig的表达。
B细胞不但在滤泡和生发中心中移动，而且活化后离开滤泡，移向身体的其它部位。在骨髓中能发现记忆B细胞，并且，表达IgA的B细胞特异地移向肠道和其它粘膜部位的细胞层。其它信号可能指导活化T细胞到达淋巴区室内和淋巴区室之间的特定部位。例如，细胞毒性T细胞能迁移到感染或其它发现有抗原攻击的部位，并且溶解它们的靶目标。指导不同微解剖部位之间T和B细胞的所有信号的一致性尚不为人知。但在二级淋巴器官和感染或炎症部位似乎有多种途径协调T和B细胞对抗原的应答。
GVHD是抗原驱动免疫应答的很好的研究例证。GVHD是人类患者骨髓移植(BMT)常见的致命后果。此疾病可为急性或慢性。GVHD急性和慢性形式分别是抗原特异性Th1和Th2应答的典型实例。此疾病的急性形式发生在BMT后的最初二个月内，以供体细胞毒T细胞介导的皮肤、肠道、肝脏和其它器官的损伤为其特点。此疾病的慢性形式出现较晚(BMT后100天以上)，以免疫球蛋白(Ig)包括自身抗体的过量产生，以及Ig沉积引起的皮肤、肾脏和其它器官的损伤为其特点。急性GVHD的产生可以预见其随后的慢性GVHD的发生。因而，同一病人可先后产生这两种疾病。大约50％BMT病人发生急性或慢性GVHD。近90％的急性GVHD病人发展为慢性GVHD。目前对大多数病人中慢性GVHD的治疗方法都未获成功。
GVHD可用亲代至F1代细胞移植方案构建小鼠模型。在此处描述的模型中，将来自DBA2小鼠的脾细胞静脉注入称为B6D2F1的(DBA2xC57B1/6)F1代小鼠体内。注入的脾细胞构成移植物，DBA2是该移植物的供体。接受移植物的F1小鼠是宿主。移植物中的供体T细胞将宿主细胞上MHC标志物的一半(单体型)识别为异物，因为它们来源于亲代C57B1/6。这引发了供体T细胞对宿主的应答，导致GVHD的发生。当DBA/2亲代脾细胞注入B6D2F1宿主体内时，慢性GVHD发生。相反，当C57B1/6脾细胞注入B6D2F1宿主体内时，急性GVHD发生。尽管使用这两种注射方案引起不同疾病的内在机制尚不清楚，但人们相信包含在DBA/2脾细胞移植物中的细胞表达的细胞因子易于使慢性GVHD的发生；包含在C57B1/6脾细胞移植物中的细胞表达的细胞因子易于使急性GVHD的发生。干扰T细胞与抗原提呈细胞(树突细胞、巨噬细胞、B细胞APC)相互作用的制剂能有效地阻断急和慢性GVHD。
多组证据提示急性GVHD是Th1介导的疾病(Krenger和Ferrara，免疫学研究(Immunol.Res.)1550-73(1996)；Willianson等，免疫学杂志(J.Immunol.)157L689-699(1996))。CD4+和CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、和活化粒细胞如巨噬细胞的细胞毒活性是Th1介导的T细胞应答的很明确的结果，并且呈现对IL-2和IFN-γ表达的特征性依赖，IL-2和IFN-γ是典型的Th1细胞因子。这种细胞毒作用是急性GVHD的一个明确特征。此外，阻滞涉及Th1 T细胞分化的关键性细胞因子的制剂，如针对IL-2和IL-12的mAb，可以阻断急性GVHD的发生。细胞毒作用可以直指细胞(如通过宿主细胞的吞噬作用)或者通过分泌的细胞因子如能导致凋亡或细胞死亡的TNF的作用来实现。供体抗宿主细胞毒作用的后果表现为多种形式。首先，宿主淋巴细胞被迅速破坏，导致患急性GVHD的小鼠的深度免疫抑制。第二，供体淋巴细胞移入宿主脾脏中并扩增，而且它们的细胞毒作用可以在体外利用表达被供体细胞识别为异己的宿主抗原的细胞系直接检测。例如，表达合适抗原的细胞系可以用放射性镉51同位素标记。培养基中该放射性同位素的释放是被标记细胞死亡的证据。第三，当其它组织和细胞群也遭到破坏时，此疾病即向危重演变，所以，是否存活是此疾病的可预测的后果。
慢性GVHD倾向于是Th2 T细胞介导的疾病(De Wit等，免疫学杂志(J.Immunol.)150361-366(1993))。在小鼠模型中，此疾病的发生依赖于Th2细胞因子IL-4，并且用抗IL-4的mAb处理能阻断其发生。这样处理也能阻断宿主B细胞的扩展和伴随的高Ig产生。GVHD可以以多种方式随后出现。供体T细胞和宿主B细胞群的扩展可以通过脾指数测定，脾指数是脾重与体重的比值，用对照(无疾病的)小鼠校准。疾病小鼠的B细胞活化可以利用对B细胞活化标志物的分析检测。最后，B细胞活化效应可以通过循环中(即血清中)的Ig水平或诱导疾病的几周后收获的宿主脾细胞培养液中产生的Ig水平观察到。发病动物的循环Ig将包含抗自身的抗体。最终，发病动物由于累积的Ig沉积而导致肾脏和其它器官的衰竭，并因此使存活性成为疾病活动的相关指标。
在本发明中，我们用慢性GVHD小鼠模型展示了TWEAK特异性单克隆抗体能有效和特异地阻断GVHD的发生。在经过抗-TWEAK治疗的动物体内，脾指数的降低、宿主B细胞活化标志物的丢失和Ig产量的下降提示慢性GVHD的发生受到阻断。
发明概述本发明提供阻断动物体内免疫性疾病产生或处理或降低其严重程度或影响的方法，其包括投放包含治疗有效量的TWEAK阻滞剂和可药用载体的药物组合物。此组合物可以是直接针对TWEAK配体的抗体；直接针对TWEAK受体的抗体；修饰TWEAK受体与配体结合的制剂；修饰细胞表面受体集聚的制剂；能阻断TWEAK受体细胞内信号传导的制剂。在优选实施方案中，抗体是单克隆抗体。在更优选实施方案中，单克隆抗体直接针对TWEAK表面配体。使用的动物可以是哺乳动物和人。TWEAK阻滞剂可以是可溶性的TWEAK受体，其有一个能选择性地与表面TWEAK配体相结合的配体结合区域。在一个实施方案中，可溶性TWEAK受体可以包括一种人免疫球蛋白IgG区。在一个优选实施方案中，人的免疫球蛋白IgG区包括特异性抗原结合区。
本发明进一步包括抑制动物体内免疫应答的方法，该方法包括投放包含治疗有效量的TWEAK阻滞剂和可药用载体的药物组合物。免疫应答可以是Th1或Th2介导的免疫应答或同时发生这两种免疫应答。
本发明也包括含有治疗有效量的TWEAK阻滞剂和可药用载体的组合物。
附图简述

图1显示可溶性重组小鼠和人TWEAK蛋白的序列对照。
图2显示对仓鼠抗TWEAK mAb AB.D3与表达小鼠TWEAK蛋白或人TWEAK蛋白的EBNA293细胞结合的荧光活化细胞筛选(FACS)分析结果，其与识别非相关蛋白(匙孔_血蓝蛋白，Keyhole Limpey Hemocyanin)的仓鼠mAb的结合作用比较。
图3显示对mAb AB.D3阻断FLAG标记的重组可溶性人TWEAK与TWEAK受体阳性细胞结合的作用的FACS分析结果。
图4显示用抗TWEAK mAb AB.D3、抗CD40L mAb MR1、对照mAb处理的或未经任何处理的慢性GVHD小鼠体内B细胞活化状态的FACS分析结果。
发明详述定义为了能完全理解此处描述的发明，进行以下详细说明。
本发明中术语“体液应答”和“细胞应答”是指动物对抗原的免疫应答，表现为动物产生针对抗原的抗体或对抗原产生细胞毒应答或两者兼有。Th1类T辅助细胞对细胞应答的诱导是重要的，而Th2类T辅助细胞对高亲和力抗体的有效产生是重要的。
本发明中使用的术语“T辅助(Th)细胞”是T细胞的一个功能亚群，其辅助产生细胞毒性T细胞，并且与B细胞合作刺激抗体产生。T辅助细胞识别与MHC II类分子相结合的抗原，并且对效应细胞提供接触依赖和接触非依赖性(细胞因子和趋化因子)信号。
术语“Th1”是T辅助细胞的一个亚类，其产生TNF、γ干扰素和IL-2(和其它细胞因子)，引发与细胞性(即非免疫球蛋白)应答有关的炎症反应。
术语“Th2”是T辅助细胞的一个亚类，其产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和其它细胞因子，它们与针对免疫攻击的免疫球蛋白(体液)应答有关。
本发明中使用的术语“生发中心”是指抗原免疫后形成的二级B细胞滤泡。该组织学位点的出现与最佳记忆的产生、同种型转换、体细胞高变和因此的抗体应答的亲和力成熟有关。
术语“抗体产生细胞”是指获得来自Th细胞的接触依赖和接触非依赖信号并分泌免疫球蛋白IgM、IgG、IgA或IgE的B细胞。
术语抗体的“Fc区”是指抗体分子中包含铰链区、CH2和CH3区，但不包括抗原结合部位的部分。此术语也包括IgM或其它抗体同种型的等价区域。
术语“抗TWEAK抗体”是指能与TWEAK蛋白至少一个表位特异结合的任何抗体。
术语“抗TWEAK受体抗体”是指能与TWEAK受体至少一个表位特异结合的任何抗体。
术语“TWEAK受体信号传导”是指与TWEAK受体途径和其导致的下游反应有关的分子反应。
术语“TWEAK或TWEAK受体修饰剂”是指能修饰配体与TWEAK受体的结合、能修饰细胞表面TWEAK受体集聚或TWEAK受体信号传导、或能影响TWEAK受体细胞内信号传导中止方式的任何制剂。
术语“TWEAK配体”或“TWEAK蛋白”是指能与TWEAK受体特异性结合的TWEAK的任何单聚体、多聚体或异源多聚体复合物或它们的衍生物。
术语“实验对象”是指一种动物或来源于一种动物的一种或多种细胞。优选所述动物为哺乳动物。细胞可以是任何形式的，包括但不限于存留在组织中的细胞、细胞集聚物、永生化的细胞、转染或转化的细胞和来源于在物理(physically)和表型方面已改变了的动物的细胞。
TWEAK配体TWEAK是近来发现的TNF蛋白家族成员(Chicheportiche等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)5132401-32410(1997))。TNF蛋白家族成员与TNF受体(TNF-R)家族中蛋白的受体结合。TNF家族蛋白与它们的受体之间的作用影响免疫系统的许多功能。人们熟知的实例包括CD40L蛋白，其结合CD40受体从而促进B细胞分化成为抗体产生细胞(Grewal和Flavell，免疫学研究1657-70(1997))；淋巴毒素-β配体(LT-β)，其与淋巴毒素β受体结合，通过调节滤泡树突细胞的分化状态影响体液免疫应答(Mackay和Browning，自然39526-27(1998))，和OX40L，其结合OX40受体以调节B细胞对T细胞信号的应答(Flynn等，实验医学杂志188297-304(1998))。TNF/TNF-R家族中人们熟知的在免疫系统中起重要作用的其它配体/受体对包括TNF/TNF-R55、FasL/Fas和CD27/CD70。
至今人们只了解TWEAK生物学的部分内容。纯化的可溶性TWEAK蛋白可用于诱导一些肿瘤细胞系的分化和/或死亡。这些肿瘤细胞系包括HT29腺癌细胞(细胞通过凋亡过程死亡)、HeLa子宫颈癌细胞(形态学的改变)和A375黑色素瘤细胞(抗增殖)。TWEAK还可诱导HT29和A375细胞系分泌趋化因子IL-8，并且对成纤维细胞系WI-38也有相同作用(Chicheportiche等，生物化学杂志5132401-32410(1997))。另外，TWEAK也可诱导多种正常内皮细胞系的增殖(Lynch等，干扰素细胞因子研究杂志(J.InterferonCytokine Res.)18A-46(1998))。
已有人描述了一种假定的TWEAK受体(Marsters等，当代生物学(Curr.Biol.)8525-528(1998))。此受体可称为TRAMP、Apo3、WSL-1、DR-3、或LARD，是TNF-R家族的一个成员。TRAMP的活化能通过参与级联反应依赖性细胞死亡信号传导途径或经由NF-kB信号途径的细胞活化诱导凋亡(Ashkwnazi和Dixit，科学2811305-1308(1998))。
TWEAK在小鼠和人组织中广泛表达，在其它组织例如心脏、大脑、肺、肝脏中、在二级淋巴器官如脾脏、淋巴结中和外周血淋巴细胞(PBMC)中已发现其信使RNA(mRNA)。在免疫系统细胞发育地初级淋巴器官如胸腺、骨髓和胎肝脏中未见TWEAK表达。因此，TWEAK在免疫系统中的作用可能表现在免疫应答方面而不是表现在免疫系统的发育方面。
蛋白配体和它们的受体之间的相互作用可通过许多特定的方式修饰。例如，特异识别配体的单克隆抗体可以通过识别结合部位或通过生理性干扰配体和受体之间的相互作用阻断或修饰配体和受体的结合。另一方面，当多种配体对应一个受体时，抗-配体mAb可通过影响它与其它配体的结合而影响受体的信号传导。已发现B7家族CD28配体的mAb存在这样复杂的作用(Lenschow等，实验医学杂志1811145-1155(1995))。在一种特定配体存在多种受体的系统中，抗-配体mAb可通过例如，修饰与一种配体结合的受体，而使与另一种受体结合的配体保持不变而发挥更复杂的效应。识别所述受体的mAb也可以用来修饰配体的结合，或它们自身也可诱导或修饰受体的信号传导。因此，抗-受体mAb可以用作拮抗剂或激动剂。用来在人或小鼠多系统中修饰TNF/TNF-R家族成员中配体/受体相互作用的mAb包括特异性针对TNF、CD40L、LT-β、Fas-L和TR2/HVEM的mAb。MAb可用来阻断免疫性疾病和其它疾病的发生或发展。例如，抗-CD40L可在系统性红斑狼疮(SLE)的治疗中应用，以及用于控制器官移植失败。
把编码受体细胞外部分的序列克隆到编码人免疫球蛋白(Ig)重链的序列上，然后在适当的细胞系中用适当的基因启动子表达此杂交基因，也可以产生配体/受体相互作用的有效抑制物。纯化的受体-Ig融合蛋白在体内和体外可用于结合现有蛋白配体，进而修饰该配体与天然的细胞结合的受体之间的相互作用。修饰作用可通过多种机制产生，这与上述抗-配体mAb的情况相似。在小鼠或人的系统中修饰TNF/TNF-R家族成员的配体/受体相互作用的受体-Ig融合蛋白有TNF-R55-Ig、TNF-R75-Ig、LTβ-R-Ig和OX40-Ig等。受体-Ig融合蛋白能用来阻断免疫性疾病或其它疾病的发生或发展。例如，TNF-R75-Ig已用来治疗炎性Bowel病(IBD)。
在本发明中我们证实特异地结合小鼠和人TWEA的mAb可阻断一种典型的抗原引发的免疫性疾病-移植物抗宿主疾病(GVHD)的发生。我们的发明预示TWEAK和TWEAK受体修饰剂在治疗外源抗原进入病人体内所导致的多种免疫性疾病，如骨髓或干细胞移植引起的GVHD，和移植物排斥引起的器官移植失败中的应用。此发明进一步预示TWEAK和TWEAK受体修饰剂在治疗各种自身免疫性疾病中的应用，所述疾病如SLE、特发性血小板减少性紫癜、Wegener′s肉芽肿病、结节性多动脉炎、视网膜葡萄膜炎、急性进行性新月形肾小球肾炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症和溃疡性结肠炎等。其它预示的应用包括治疗急慢性炎症如过敏性炎症、哮喘、嗜酸性粒细胞增多症、Graves′病和Chagas′病等。
材料和方法小鼠6到8周龄的雌性DBA/2、C57B1/6小鼠和(DBA/2×C57B1/6)的F1代杂交小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor，ME USA)，常规保护条件下圈养，根据惯例处理。
单克隆抗体 识别人和小鼠TWEAK蛋白的单克隆抗体在美国仓鼠体内用可溶性人TWEAK蛋白制成，可溶性人TWEAK蛋白是用杆状病毒制成并依照Chicheportiche等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(1997)5132401-32410所述纯化的。第一次免疫，每只仓鼠腹膜内注射在弗氏完全佐剂(CFA)中的50μg TWEAK。随后的各次免疫(首次免疫后的14、28、42天)每只仓鼠腹膜内注射在弗氏不完全佐剂(IFA)中的50μg TWEAK(14和28天)或33μg TWEAK。用不含佐剂的100μg TWEAK腹膜内注射进行脾细胞融合形成杂交瘤前的最后一次免疫。应用标准方法生成杂交瘤(Lerner，Yale，耶鲁生物医学杂志54387-402(1981))。
产生抗鼠CD40L mAb MR1的杂交瘤(Noelle等，美国国家科学院院报896550-6554(1992))购自ATCC(Rockville，MD USA)。产生抗-KLH mAbHa4/8的杂交瘤从Dr.Mendrick(人类基因组科学有限公司Rockville，MDUSA)获得。
Mab活性的ELISA分析 抗人TWEAK mAb结合人和小鼠TWEAK的能力可以通过多种实验检测。抗人TWEAK的几种mAb在用ELISA检测法进行最初的筛选时发现其也识别小鼠TWEAK蛋白。小鼠TWEAK蛋白用与Chicheportiche等，生物化学杂志5132401-32410(1997)中所述的人TWEAK蛋白生成的相同方法在杆状病毒中产生。用纯化的人和小鼠TWEAK蛋白包被96孔板，检测各种仓鼠mAb与这些已固定的蛋白的结合能力。用过氧化物酶偶联的驴抗仓鼠IgG(Jackson免疫研究，West Grove，PAUSA)和相应依赖过氧化物酶的酶反应观察固定的TWEAK蛋白对仓鼠mAb的捕获。
MAb活性的FACS分析 可溶性TWEAK蛋白可诱导HT29细胞的凋亡，这提示这些细胞表达TWEAK受体(Chicheportiche等，生物化学杂志5132401-32410(1997))。检测纯化的mAb(10μg/ml)对FLAG标记的鼠或人TWEAK与HT29细胞结合的阻断能力，这通过生物素化的抗FLAG抗体、链亲和素-过氧化酶和适当的酶底物来检测。
慢性GVHD的诱导 将6到8周龄的DBA/2和B6D2F1雌性小鼠处死，用无菌技术取脾。将该器官在粗燥的玻片之间轻轻研磨，使大块组织碎片沉降，制备成单个细胞悬液，然后沉淀已澄清的上清液。将此细胞沉淀重新悬浮在Gey′s缓冲的高渗溶液中，再冰浴3分钟溶解红细胞。每个被粉碎的脾脏加5ml Gey′s液。重新沉淀细胞溶液，将其重新悬浮在无菌、无致热原的PBS中，再次沉淀，并重悬于无菌、无热原质的PBS中。用血球计数器测定细胞数量，调细胞密度至2X108/ml。使该溶液滤过70μm的细胞滤器，将其保存在冰上直至使用。6-8周龄的B6D2F1雌性小鼠用作接受者。给每个接受者尾静脉注射800μl(18)细胞。实验组接受DBA/2移植物(DBA/2＞F1)；对照动物组接受B6D2F1移植物(F1＞F1)。注射的14天后检测动物的慢性GVHD的产生。
对慢性GVHD的阻断 小鼠接受抗TWEAK mAb AB.D3、抗CD40LmAb MR1、对照mAb Ha4/8的处理或不接受任何处理。治疗的时间安排是移植物注射之4小时前以及之后的2、4和6天每次腹膜内注射mAb 250μg。
对疾病发生情况的检测 实验的第14天，处死小鼠并称重。然后无菌技术取脾并称重。依照脾重比体重的比值计算对照F1＞F1组每个动物的脾指数，计算后取一个均值。其它组的平均脾指数用对照值校正。依照前述方法分离这些脾脏中的脾细胞，在无菌PBS中稀释到1×107细胞/ml的浓度。染色100μl细胞的下列细胞表面标志以便FACS分析。所述所有mAb均购自Pharmingen(San Diego，CA.USA)。链亲和素试剂购自南方生物技术公司(Birmingham，AL.，USA)。脾细胞用生物素化抗-H-2Kb染色，H-2Kb是区别供体细胞(H-2Kb-)和宿主细胞(H-2Kb+)的一种单体型标志，它通过与直接偶联的FITC或PE标记的抗-CD4、抗-CD8、抗-B220、抗-CD69、抗-I-Ad、抗-L-选择素、抗-H2Dd在包含阻断Fc受体非特异结合的10μg/ml FcBlocktm(Pharmingen)的PBS/0.5％牛血清白蛋白(BSA)/0.1％叠氮纳(FACS缓冲液)中的不同组合来实施所述区别。将细胞与mAb在冰上孵育1小时。然后将每个标本重悬在2ml FACS缓冲液中，洗涤，离心以沉淀细胞。将细胞重新悬浮在包含CyChrome标记的链亲和素的FACS缓冲液中，其中链亲和素与生物素化的mAb结合而为FACS分析提供第三条途径。最后一次洗涤后，用FACS扫描仪和Cellquest软件(Becton Dickenson，San Jose，CA.USA)分析。
使细胞沉淀，将其以1×107细胞/ml的浓度重新悬浮在包含10％胎牛血清(FBS)/4mM谷氨酰胺的DMEM中，进行Ig分泌的体外分析。6孔培养板中每孔加入1ml，24小时后收集细胞上清液。
抗-TWEAK抗体的来源 在本发明的一个实施方案中，直接针对TWEAK的抗体(Ab)行使TWEAK阻滞剂的功能。可针对TWEAK蛋白可能的单体型、双体型或三体型产生Ab，而不管它们是否包含异源亚单位。此外，可以针对TWEAK蛋白的可溶型、突变型、改变型或嵌合形式产生Ab。此发明中的抗一TWEAK Ab可以是多克隆或单克隆的(mAb)，也可以通过修饰使它们阻断TWEAK与其受体结合的能力、它们的体内生物可利用性、稳定性或其它所需最优选。
直接针对TWEAK的多克隆抗体血清可以通过常规技术制备，包括用完全弗氏佐剂(CFA)中的人TWEAK皮下注射动物如山羊、兔子、大鼠、仓鼠或小鼠，然后，使用不完全佐剂(IFA)腹膜内或皮下加强注射。用常规免疫学方法筛选含有直接针对TWEAK的所需Ab的多克隆抗血清。
用常规方法制备直接针对人TWEAK的仓鼠单克隆抗体(mAb)，即用CFA中的重组可溶性人TWEAK皮下注射亚美尼亚(armenian)仓鼠，然后，用IFA中的重组可溶性人TWEAK腹膜内或皮下加强注射。根据布达佩斯条约的规定，将产生仓鼠抗TWEAK mAb AB.D3的杂交瘤细胞系(AB.D3.7.2.)存放在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)，保藏号为＿＿。一旦该申请被授予专利，对公众获得上述ATCC保藏物的所有限制永远取消。
各种形式的抗TWEAK Ab也可以通过常规DNA重组技术制备(Winter和Milstein，自然349，293-99(1991))。例如，“嵌合”抗体可通过动物抗体的抗原结合区与人抗体的恒定区的连接而构建(Cabilly等，US 4,816,567；Morrison等，美国国家科学院院报81，6851-55(1984))。当嵌合Ab用于人体的临床治疗时，可以降低动物Ab引发的可观察到的免疫应答。
另外，识别TWEAK的重组“人源化抗体”可以人工合成。人源化Ab是主要包含人IgG序列的嵌合体，其中已插入特异性抗原结合区(WO94/04679)。用所需抗原免疫动物，分离相应的Ab，再去除可变区序列中与抗原特异结合的部分。任何将动物源抗原结合区克隆到人的抗体基因中已删除抗原结合区的相应部位。人源化Ab使人类抗体中异源(种间)序列的使用最小化，并减少受治疗者中激发免疫应答的可能性。
不同类别的重组抗-TWEAK Ab的构建，也能通过制造含抗TWEAK可变区与分离自不同类免疫球蛋白的人的恒定区(CH1、CH2、CH3)的嵌合或人源化Ab来完成。例如，抗原结合价提高了的抗-TWEAK IgM Ab也可以重组产生，其方式是将抗原结合位点克隆到携有人IgM重链恒定区的载体上(Arulanandam等，实验医学杂志177，1439-50(1993)；Lane等，欧洲免疫学杂志22，2573-78(1993)；Traunecker等，自然339，68-70(1989))。
除此之外，标准重组DNA技术可以通过改变抗原结合位点邻近区的氨基酸残基来改变重组Ab与它们的抗原的亲和力。人源化Ab的抗原结合亲和力可通过基于分子模型的诱变提高(Queen等，美国国家科学院院报86，10029-33(1989)；WO 94/04679)。
有可能根据靶向的组织类型或预想的具体治疗方案提高或降低抗TWEAK Ab对TWEAK的亲和力。例如，通过使病人抗TWEAK Ab的水平保持不变，而修饰TWEAK途径的能力下降，将有利于进行半预防性治疗。同样，对TWEAK的亲和力提高的TWEAK Ab有利于短期治疗。
仓鼠抗人TWEAK单克隆抗体的产生举例说明于实施例1。
抗TWEAK mAb在阻断慢性GVHD(一种由抗原引起的免疫性疾病)的发生中的应用。我们现在显示，在小鼠慢性移植物抗宿主疾病(GVHD)模型中TWEAK阻滞剂mAb AB.D3对免疫应答的发生的作用。对慢性GVHD的阻断能力包括对B细胞活化和增殖的作用，和对分泌型IgG产生的作用。小鼠用250μg抗TWEAK mAb AB.D3、抗-KLH对照mAb Ha4/8或抗-CD40L mAb MR1进行腹膜内(ip)注射，或不作任何处理。4小时后，给小鼠静脉注射(iv)0.5m1 1×108个自DBA/2中分离的脾细胞。静脉注射的DBA/2脾细胞构成同种异体移植物。给予移植物的2、4和6天后，小鼠再次用250μg抗TWEAK mAb AB.D3、抗-KLH对照mAb Ha4/8或抗-CD40L mAb MR1处理。对照组小鼠接受1×108个不能在B6D2F1接受者体内引起疾病的B6D2F1脾细胞。另外，未接受移植物或未接受处理的B6D2F1小鼠用作对照。给予移植物的14天后，处死小鼠，检查疾病的证据。
未经处理的接受移植物的小鼠的表现能提示发生了慢性GVHD的各种症状。脾增大是供体T细胞和宿主B细胞活化，并且，正经历多克隆扩增，伴随细胞数量的显著增加的证据。在B细胞亚群上出现表面蛋白如CD69提示B细胞的活化。CD4+和CD8+T细胞失去L-选择素分子表示T细胞活化。Ig分子如IgG类、IgA和IgE分泌到血清中或体外细胞培养液中提示B细胞已经活化，并且已进行了Ig类别转换。鉴于此，血清中或体外细胞培养液中抗自身Ig的出现提示正在生成的Ig对自身抗原存在不适当的识别作用。最后，检测抗体存活可判断不同治疗效果。
在脾增大、B细胞活化和GVHD期间Ig的分泌方面我们对对照小鼠和未经处理的接受同种异体移植物的小鼠进行了比较。抗CD40L mAb MR1在这些实验中被用作阳性对照，因为以前已有实验证明，阻滞CD40L/CD40之间的相互作用是一种有效的干扰慢性GVHD发生的方式(Durie等，临床研究杂志941333-1338(1994))。针对匙孔_血蓝蛋白(KHL)的仓鼠mAb Ha4/8作为阴性处理对照。两个实验的结果显示在表2中。在两个实验中，用抗-TWEAK mAbAB.D3进行的处理可降低脾肿大程度约33％(与未经处理的同种异体移植物接受者相化)。用阴性对照mAb Ha4/8处理无效果，但用抗CD40L mAb MR1处理可阻断脾肿大近70％。为研究抗TWEAK mAbAB.D3处理对细胞群体的影响，对注射移植物14天后的受体小鼠的脾细胞进行FACS分析。从每组小鼠中取3-4个小鼠的脾细胞进行分离和汇集。受体B细胞的活化是慢性GVHD的确定特征。在未治疗组和对照mAb治疗组的小鼠中，一小部分但可观察到的B200+B细胞表达活化标志物CD69(图4和表3)。相反，在MR1或AB.D3治疗的小鼠中确无B200+B细胞表达CD69。在AB.D3小鼠脾脏中，未检测到B细胞活化可能是因为几种作用机制中的一种或一种以上在起作用，包括T细胞的活化失败、B细胞活化失败或细胞死亡(凋亡)。其次，我们检测不同处理组中小鼠脾细胞培养液中IgG的总量，以判断B细胞群CD69活化标志物的丢失是否与功能表现即IgG的产生相关。未经处理的对照小鼠、MR1处理的小鼠和经AB.D3处理的小鼠产生的IgG的总量比未处理的或经Ha4/8处理的同种异体移植物受体小鼠(表4)明显降低。此结果显示活化B细胞的Ig分泌作为慢性GVHD的确定特征被抗-TWEAK mAb的处理阻断。抗-TWEAK mAb在阻断慢性GVHD的发生中的应用在实施例2中说明。
其它抗体介导的疾病 许多器官特异性和系统性自身免疫病涉及病理性抗体应答。这样的情况包括重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、Chaga′s病、Grave’s病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、系统性红斑狼疮(SLE)、Wegener′s肉芽肿病、结节性多动脉炎和急性进行性新月形肾小球肾炎(摘自Benjamini等，免疫学简论(Immunology，A Short Course)，(Wiley-Liss，NewYork 3d ed.(1996))。
尽管SLE的病因尚未明确，但对临床病理的免疫学机制已相当了解。出于未知原因，SLE患者产生抗机体核成分的抗体(抗核抗体(ANA))特别是抗天然双链DNA的抗体。临床上，这些抗体的存在与SLE中发生的肾脏病变密切相关。这些抗体与DNA的复合物似乎来源于正常组织的降解，并且，象任何免疫集聚物疾病一样，这样的复合物形成沉淀，沉积在肾小球基底膜上、动脉壁中和关节滑膜腔中。这些复合物活化补体级联反应并吸引粒细胞。紧随其后的炎症反应以肾小球肾炎为特点，引起肾脏的损伤，导致蛋白尿和血尿。
SLE已经在小鼠模型中研究了几十年。阻断T和B细胞活化关键步骤的制剂如CTLA4-Ig融合蛋白和抗CD40L可阻断SLE的发生(Grewal和Flavell，免疫学综述15385-106(1996))。近来，在几个模型中对特异性针对鼠CD40配体的制剂的治疗功效进行了评价(Mohan等，免疫学杂志154，1470-1480(1995))。将诱导病理性抗体产生的细胞移入体内可使狼疮加重，这可通过投入阻断CD40/CD40配体相互作用的单克隆抗体得到抑制。而且，用抗CD40配体的抗体短期治疗狼疮小鼠时发现，抗体从它们的系统中被清除后很久还对它们的自发疾病有延续的治疗效果。实验提示，病理性B细胞即使在该治疗后9个月也不能产生抗体，提示自身免疫性记忆B细胞的扩增有一段时间的延迟，其可使治疗效果维持很长的一段时间。进一步地，抗CD40L治疗能阻断或延迟自发性SLE小鼠模型的SLE的进展(Kalled等，免疫学杂志1602158-2165(1998))。正如我们所显示的那样，调节TWEAK/TWEAK受体之间的相互作用的制剂在体内可抑制B细胞活化和Ig的产生，此发明的试剂将用于SLE的治疗或预防。
对一些致病性感染因子的正常免疫应答可引发自身抗体应答，其可超过正常范围和出现医学问题。一个实例是Chagas′病，一种炎性心肌病，它在慢性克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)感染的人和实验动物体内发生。近来，几项研究已经鉴定了Chagas′病人体内的抗自身抗体(Bach-Elias等，寄生虫研究(Parasitol.Res.)84796-799(1998))。此外，有确切实验证据表明，心脏特异性自身免疫应答的诱导是人Chagas′心肌病的可能发病机制。近期研究(Tibbetts等，免疫学杂质152，1493-1499(1994))测定心脏抗原特异性抗体可在克氏锥虫感染的心脏病C57B1/6小鼠体内产生。克氏锥虫巴西(Brazil)株的感染使C57B1/6小鼠出现与慢性感染人体中所见组织学类似的心肌病。这些小鼠的抗血清与三种心脏抗原反应，而感染了克氏锥虫Guayas株后不产生心肌病的C57B1/6小鼠不产生这些抗体。这些资料提示这些抗体是心肌病的特异性标志物。TWEAK修饰剂阻断B细胞活化和Ig产生的能力对阻断Chagas′病患者发生心脏损伤是有用的。
特定传染病或其它未知的原因所产生的自身抗体对细胞造成损伤的另一个实例是特发性血小板减少性紫癜(ITP)。在这种情况下，直接针对血小板的抗体引起血小板的破坏(通过补体或带有Fc或C3b受体的巨噬细胞)，从而导致出血。体内抑制这类抗体介导型自身免疫应答的制剂如本发明抑制抗体产生的TWEAK修饰剂也可用于治疗或预防这些自身免疫疾病。
对某些致病性感染因子的正常免疫应答也能激发过度超敏反应，其本身成为医学问题。I型超敏反应最常见实例是过敏反应。它们由IgE抗体介导，IgE通过其Fc部分结合到肥大细胞和嗜碱性粒细胞的受体上，激发能介导过敏反应的药理活性物质的释放。ITP和Goodpasture′s综合症有时被认为是II型反应，其IgM或IgG抗体结合到细胞表面的抗原上并活化补体系统时产生。然后，粒细胞被吸引到活化部位，粒细胞的裂解酶的释放损伤细胞使其被破坏。风湿性关节炎被认为是由III型超敏反应引起，其由结合到正常IgG的Fc部分的免疫复合物(在此实例中是风湿因子，一种IgM自身抗体)介导。这些免疫复合物参与引起关节的炎症和此疾病特征性的损伤。因为这些病理变化部分由抗体介导，抑制抗体产生的制剂如本发明中的TWEAK修饰剂对这些疾病的治疗和预防也是有用的。
导致对病人显著抗体介导型损伤的这类疾病的其它实例包括Graves′病和急性溶血性贫血。预计TWEAK修饰剂在预防和治疗这样的疾病方面会显示功效。
对细胞免疫应答的抑制 我们证实体内给予TWEAK蛋白活性修饰剂可阻断抗体介导的(体液的)免疫疾病、慢性GVHD。其它有效的能阻断GVHD发生的免疫系统修饰剂包括抗CD40L和CTLA4-Ig融合蛋白。这些制剂可阻断T和B细胞活化关键步骤(Grewal和Flavell，免疫学综述15385-106(1996))。所以，对所述其它有效免疫系统途径的制剂处理不限于体液免疫应答。例如，抗CD40L和CTLA4-Ig可分别或联合用于控制动物模型体内的器官移植排斥(Kirk等，美国国家科学院院报948789-8794(1997))。对移植器官的免疫应答主要由Th1 T细胞介导，并包含细胞毒细胞免疫应答。在其它多种免疫疾病如炎性肠道疾病、类风湿性关节、多发性硬化症、糖尿病、溃疡性结肠炎和Crohn′s病等自身免疫疾病中，这些细胞免疫应答引起细胞介导型损伤。基于TWEAK或TWEAK受体修饰剂具备阻断慢性GVHD发生的能力，我们的发明预计它们能在细胞免疫疾病中得到应用。
利用TWEAK和TWEAK受体修饰剂的治疗 给予有效量本发明组合物以治疗特定临床疾病。针对具体应用的优选药物和治疗有效量方案可由本领域技术人员视具体情况，如病人的病情和体重、期望治疗的程度和该病人对该治疗的耐受情况而定。
预计约5mg/kg的TWEAK或TWEAK受体修饰剂适于作为最佳治疗剂量的起点。
治疗有效剂量可通过体外实验确定，该实验测定包被靶细胞(根据所述修饰剂分别为TWEAK或TWEAK受体阳性细胞)至适当(治疗)时间段所需修饰剂的浓度。本文所述FACS和ELISA受体-配体结合实验能用来监控所述细胞包被反应。可根据这些体外结合实验的结果选出适于在动物中进行检测的修饰剂浓度范围。
本发明可溶性修饰剂(包括抗TWEAK和抗TWEAK-R抗体的分离和纯化形式、受体-Ig融合蛋白、其它TWEAK和TWEAK受体修饰剂包括天然试剂或化学衍生的试剂、和它们的盐或可药用衍生物)可用显示免疫抑制活性的任何常规可接受之给药模式单独或联合给药。
在这些治疗中使用的药物组合物也可有多种形式。例如，固体、半固体、和液体剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液或悬浮剂栓剂、注射液和浸剂(infusible solution)。优选形式取决于给药模式及所用治疗剂。给药模式可包括口服、肠胃外、皮下、静脉、伤口内或局部给药。
在本发明中，可把TWEAK和TWEAK受体修饰剂放进无菌、等渗配方中，加入或不加入刺激摄入或促进稳定的辅因子。优选配方是液体，或冻干粉剂。例如，本发明中的TWEAK和TWEAK受体修饰剂可以用5.0mg/ml一水合柠檬酸、2.7mg/ml柠檬酸三钠、41mg/ml甘露醇、1mg/ml甘氨酸和1mg/ml聚山梨醇酯(polysorbate)20的缓冲液稀释。此溶液可冰冻干燥，冰冻储存并在投药之前用无菌的注射用水(USP)重新溶解。
组合物也优选包括本领域熟知的常规可药用载体(参见Remington氏药物学，第16版，Mac出版公司，1980)。这些可药用载体包括其它药剂、载体、基因载体、佐剂、赋形剂等，如人血清白蛋白或血浆制品。组合物优选为单位剂型并通常每天给药一次或多次。
本发明的药物组合物也可以已微球体、脂质体、其它微颗粒运送系统或控释制剂的形式被置于受感染组织或血流内、附近或其它相关联部位。控释载体的适当实例包括以成型颗粒的形式存在的半渗透性多聚基质如栓剂或微胶囊。可植入式或微胶囊式控释基质包括多聚乳糖(美国专利3773319；EP58481)，L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等，生物多聚物(Biopolymers)，22，547-56(1985))；聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)或乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，生物医学研究杂志(J.Biomed.Mater.Res.)，15，167-277(1981)；Langer，化学技术(Chem.Tech.)，12，98-105(1982))。
包含TWEAK或TWEAK受体修饰剂的药物组合物的优点 本发明的TWEAK或TWEAK受体修饰剂能抑制免疫应答，表现为对慢性GVHD模型中B细胞活化和Ig产生的抑制。选择性抑制这类免疫介导型应答的能力可用于免疫性疾病包括各种自身免疫病、器官移植排斥、和急、慢性炎症的治疗。此类病理性免疫疾病的治疗通常需要对广泛的细胞类型和免疫学应答具有多种效应的免疫调节和免疫抑制制剂。这些非特异性免疫抑制剂通常需要以引起不良副作用的高且频繁的细胞毒剂量使用。例如，目前常用的三种免疫抑制剂包括类固醇、环磷酰胺和硫唑嘌呤。类固醇是多效的抗炎制剂，它以逆转多种病理性T细胞效应的方式抑制活化巨噬细胞并抑制抗原提呈细胞的活性。环磷酰胺(一种烷基化制剂)通过抑制DNA的复制和修复而介导细胞死亡。硫唑嘌呤是一种抑制DNA合成的抗增殖制剂。这些非特异性免疫抑制制剂通常需要以增加其毒性(例，肾-和肝-毒性)和引起不良反应的高剂量使用。因而，它们不适合长期使用。
因而，急需能克服常规治疗所带来的问题的其它制剂和药物。
以下实施例描述了本发明的抗-TWEAK mAb、该mAb的鉴定方法和该mAb在阻断抗原驱动型免疫疾病方面的使用。这些实施例不应解释为限制这些实例只为了达到说明的目的，而本发明只受权利要求的限制。
实施例实施例1针对TWEAK蛋白的单克隆抗体的产生识别人和鼠TWEAK蛋白的单克隆抗体在美国仓鼠体内用如所述产生于杆状病毒中的可溶性人TWEAK蛋白制成(Chicheportiche等，生物化学杂志5132401-32410(1997))。第一次免疫，每只仓鼠腹膜内注射50μg在弗氏完全佐剂(CFA)中的TWEAK。随后的各次免疫(首次免疫后的14、28、42天)每只仓鼠腹膜内注射在弗氏不完全佐剂(IFA)中的TWEAK 50(14和28天)或33(42天)μg。用不含佐剂的100μg TWEAK腹膜内注射进行脾细胞融合形成杂交瘤前的最后一次免疫。应用标准方法生成杂交瘤(Lerner，耶鲁生物医学杂志54387-402(1981))。
用ELISA format试验初步筛选Mab活性。鼠TWEAK蛋白用类似于TWEAK蛋白生成的相同方法(Chicheportiche等，生物化学杂志5132401-32410(1997))在杆状病毒中产生。用纯化的人和鼠TWEAK蛋白包被96孔板，检测各种仓鼠mAb与这些固相化蛋白的结合能力。用HRP偶联的驴抗仓鼠IgG(Jackson免疫研究，West Grove，PA USA)和相应酶反应观察固相化TWEAK蛋白对仓鼠mAb的捕获。23种mAb中有8种mAb既可识别鼠TWEAK蛋白又可识别人TWEAK蛋白(表1)。
表1克隆人TWEAK 鼠TWEAK 配体封闭 对hTWEAK/293的对mTWEAK/293的ELISAELISA FACSFACS结合 FACS结合AB.D3.7.2 +++ +++ ++ +AA.DB5+++ - +/- + +AC.H5.24 +++ +++ -nd ndAA.G9+++ - +/- + -AB.H12.1 +++ +++ -- -BA.F5.35.2*+++ +++ ++ -BG.A12.5*++ +++ ++ -BE.D5 ++ - +/- + -AF.D4 ++ - ++ -AB.G11.1*+++ +++ ++ +BE.B3.6.1*++ - -+ -AA.AC2.3.2 +++ - +/- nd ndBB.B12.1.31.3 ++ - +/- + -AA.DG7.14*+++ +++ ++ +BD.A3 ++ - -- -BC.B10.21*+++ +++ ++ +BG.E8 ++ - +/- + -AE.C10.4*+++ - ++ -AA.BB4.2*+++ - ++ -AA.EC10.2*+++ - ++ -AD.B5.9*+++ - -- -AB.D4.67.19 +++ - -- -人TWEAKELISA测定mAb与人TWEAK包被板结合的能力鼠TWEAK ELISA测定mAb与鼠TWEAK包被板的交叉反应配体封闭FACS检测mAb是否能封闭与HT29细胞结合的人TWEAK标记EBNA293转染体的FACS分析用人和鼠TWEAK的cDNA转染EBNA293细胞，3天后检测mAb的反应性种系之间抗原表位的保守性意外地使小鼠和人TWEAK之间在一定程度上保持蛋白同源性(图1)。用FACS分析来确定抗-TWEAK mAb是否能与表达在细胞表面的TWEAK蛋白结合。将人和小鼠TWEAK cDNA序列克隆至表达载体CH269(Chicheportiche等，生物化学杂志132401-32410(1997))，这些构建体用于转染以在EBNA293细胞中产生瞬时表达蛋白。包括AB.D3在内的四种mAb与表达小鼠TWEAK的EBNA293细胞紧密结合(图2)。这四种mAb也能阻断人TWEAK与已知表达一或多种TWEAK受体的HT29细胞结合(例如，图3)。这些FACS分析结果综合提示抗-TWEAK mAb能特异识别TWEAK蛋白，并能修饰TWEAK蛋白与一或多种TWEAK受体结合的能力。
实施例2抗-TWEAK mAb AB.D3在阻断慢性GVHD小鼠模型的脾肿大、B细胞活化和Ig产生方面的应用6-8周龄B6D2F1雌性小鼠按“方法”一节中所述用DBA/2脾细胞移植物诱导慢性GVHD。每个接受者尾静脉注射500μl(1×108)细胞。实验组接受DBA/2移植物(DBA/2＞F1)，对照组动物接受B6D2F1移植物(F1＞F1)。小鼠接受抗TWEAK mAb AB.D3、抗CD40L mAb MR1、对照Ha4/8的处理或不接受任何处理。移植物注射之前4小时以及注射后的2、4和6天腹膜内注射mAb 250μg。实验的第14天处死小鼠，计算对照F1＞F1组每个动物的脾重比体重的比值作为脾指数，取均值。其它组的平均脾指数用该对照值校正。两个独立实验的结果在表2中显示。接受DBA/2移植物(DBA/2＞F1)的动物，未接受任何处理或用对照mAb Ha4/8处理的动物与F1＞F1移植物对照组相比脾重明显增加。此结果反映在脾指数上，其从校正的对照值1.0增加到2.6。用抗CD40L mAb MR1处理的小鼠，脾指数降至接近对照水平(1.1)，用抗TWEAK mAb AB.D3处理的小鼠，脾肿大降低了35％，脾指数到1.7(表2)。
表2处理组实验1 实验2 均值F1＞F1(对照组)1.01.01.0DBA/2＞F1，未处理组 2.72.62.65DBA/2＞F1，Ha4/8处理组2.92.62.75DBA/2＞F1，MR1处理组 1.11.11.1DBA/2＞F1，AB.D3处理组1.81.71.75实验的第14天，处死小鼠并称重。然后无菌取脾并称重。计算对照F1＞F1组每个动物的脾重比体重的比值作为脾指数，取均值。其它组的平均脾指数用该对照值校正。
用FACS分析对照小鼠和疾病小鼠(代表各种处理组)脾脏中各群淋巴细胞的活化状态。首先，我们分析了各组小鼠中移入的供体细胞数量。在所有DBA/2＞F1处理组中，宿主小鼠脾脏中检测到的供体细胞为几乎相同的百分数(平均＝6.2％)(表3)。此结果提示不同的mAb处理不影响供体细胞的移入。
表3处理组％H-2Kb阴性(供体)细胞F1＞F1(对照组)0.2DBA/2＞F1，未处理组 5.9DBA/2＞F1，Ha4/8处理组9.9DBA/2＞F1，MR1处理组 5.5DBA/2＞F1，AB.D3处理组4.3各组小鼠脾细胞在冰上用PE-偶联的抗-H2Kb和FITC-偶联的抗-H2Dd染色，用FACS分析来检测MHC等位基因的表达。宿主脾细胞的两种标志物均为阳性，但供体脾细胞为H2Kb阴性。百分数值反映淋巴细胞群中的事件，如通过前向和侧向散射特性所确定。
随后，利用淋巴细胞活化两个标志物在B220+B细胞上表达的CD69和在CD4+和CD8+T细胞上表达的L-选择素。当比较对照组和未处理组的DBA/2＞F1小鼠时，我们注意到CD69+B细胞从2.5％增加到6.2％(表4)。CD69+B细胞数量的增加被MR1(3.3％)或AB.D3(2.1％)的处理阻断，但不被Ha4/8(6.5％)的处理阻断(图4和表3)。两个实验的数据见表4。
表4处理组％B220+/CD69+(双阳性)细胞实验1 实验2均值F1＞F1，对照组2.5 2.02.25DBA/2＞F1，未处理组 6.2 5.55.9DBA/2＞F1，Ha4/8处理组6.5 4.75.6DBA/2＞F1，MR1处理组 3.3 nd 3.3DBA/2＞F1，AB.D3处理组2.1 3.22.65脾细胞用PE-标记型抗-B220和FITC-标记型抗-CD69在冰上染色1小时，然后用FACS缓冲液洗涤并分析。百分数是基于在淋巴细胞群中收集到的基本数据，如通过前向和侧向散射特性所确定。
为了进行Ig分泌的体外分析，对从各处理组收获的脾细胞的培养上清进行ELISA分析。表5的结果为第二次实验每组3只小鼠的均值。用MR1或AB.D3处理使未处理组和Ha4/8处理的DBA/2＞f1组中观察到的自发IgG生成的4-8倍增加被阻止。
表5处理组 自发性体外IgG生成F1＞F1(对照组) 125ng/ml+/-20ng/mlDBA/2＞F1，未处理组 750ng/ml+/-65ng/mlDBA/2＞F1，Ha4/8处理组 500ng/ml+/-150ng/mlDBA/2＞F1，MR1处理组 0DBA/2＞F1，AB.D3处理组 125ng/ml+/-20ng/ml为了进行Ig分泌的体外分析，使细胞沉淀，以1×107细胞/ml的浓度重悬于含10％胎牛血清(FBS)/4mM谷氨酰胺的DMEM中。6孔培养板中每孔加入1ml。24小时后收集细胞上清液。取每个处理组3只小鼠之每只小鼠两个孔的均值。
序列表<110>BIOGEN，INC.<120>修饰TWEAK活性的试剂及其作为治疗剂在免疫性疾病的治疗中的应用<130>A068PCT<140>PCT/US00/01044<141>2000-01-14<150>60/116，168<151>1999-01-15<160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>225<212>PRT<213>鼠<400>1Val Leu Ser Leu Gly Leu Ala Leu Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Val1 5 10 15Val Val Ser Leu Gly Ser Trp Ala Thr Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ser20 25 30Gln Glu Glu Leu Thr Ala Glu Asp Arg Arg Glu Pro Pro Glu Leu Asn35 40 45Pro Gln Thr Glu Glu Ser Gln Asp Val Val Pro Phe Leu Glu Gln Leu50 55 60Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro Lys Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg65 70 75 80Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp85 90 95Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Thr100 105 110Lys Ile Asn Ser Ser Ser Pro Leu Arg Tyr Asp Arg Gln Ile Gly Glu115 120 125Phe Thr Val Ile Arg Ala Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val His130 135 140Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asn145 150 155 160Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala165 170 175Ser Ser Pro Gly Pro Gln Leu Arg Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu180 185 190Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Arg Ile Arg Thr Leu Pro Trp Ala195 200 205His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val210 215 220His225<210>2<211>249<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Ala Arg Arg Ser Gln Arg Arg Arg Gly Arg Arg Gly Glu Pro1 5 10 15Gly Thr Ala Leu Leu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly Leu Ala Leu20 25 30Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Gly Ser Arg Ala35 40 45Ser Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ala Gln Glu Glu Leu Val Ala Glu Glu
50 55 60Asp Gln Asp Pro Ser Glu Leu Asn Pro Gln Thr Glu Glu Ser Gln Asp65 70 75 80Pro Ala Pro Phe Leu Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro85 90 95Lys Gly Arg Lys Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu100 105 110Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly115 120 125Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Ala Arg Ile Asn Ser Ser Ser Pro Leu130 135 140Arg Tyr Asn Arg Gln Ile Gly Glu Phe Ile Val Thr Arg Ala Gly Leu145 150 155 160Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr165 170 175Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu180 185 190Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro Gln Leu Arg195 200 205Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu210 215 220Arg Ile Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu225 230 235 240Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val His24

本发明涉及可修饰TWEAK活性的制剂和它们作为治疗制剂在免疫性疾病的治疗中的应用。