专利名称：具有4－甲基麦角甾－7－烯－3－醇骨架的糖苷及高血糖改善剂的制作方法 已知4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇为存在于植物中的物质(非专利文献1)。但是，对于此化合物的先有技术，只有涉及具有与该化合物相似构造的洛飞烯醇(4-甲基胆甾-7-烯-3-醇的立体异构体之一)的生合成体系的技术(非专利文献2)，对于这些化合物的用途还是完全未知的。百合科芦荟属是含有库拉索芦荟(Aloe barbadensis Miller)、木立芦荟(Aloe arborescen Miller var.natalensis Berger)等的植物群，经验上已知具有各种功效，在涉及芦荟属植物用途的先有技术中，有免疫修饰性多糖类(专利文献1)、以含有芦荟提取物的丁醇馏分或者芦荟素为特征的免疫抑制改善剂(专利文献2)、属于HSP60家族蛋白质的含有芦荟素衍生物的合成抑制剂(专利文献3～5)、来源于芦荟叶皮的植物凝血素活性蛋白质(专利文献6)等。作为涉及芦荟属植物的改善血糖值的先有技术，公开了在美国的临床试验(非专利文献3)、在动物中的降血糖作用(非专利文献4和非专利文献5)、芦荟属植物中的多糖类(专利文献7)，但是在这些先有技术中，芦荟属植物的降血糖作用成分被推测为多糖类或者糖蛋白质。另外，公开了在库拉索芦荟压榨液以及以该压榨液作为有效成分的降糖药(专利文献8)中，FT-IR谱图中酯基特有的峰与活性相关，有效成分为多糖类、氨基酸、苹果酸等，而在市售的库拉索芦荟凝胶粉末、库拉索芦荟凝胶液或者库拉索芦荟凝胶提取液中，上述有效成分被破坏。并且，在其他文献中也分别公开了芦荟多糖类的降血糖作用(专利文献9)、芦荟中含有的7-羟基色酮的抗氧化作用(专利文献10)。此外，在库拉索芦荟叶皮中含有具有缓泻作用的芦荟苷及芦荟大黄素，以往在工业上不优选。血红蛋白Alc是葡萄糖和血红蛋白的结合物，依存于糖浓度并随着高血糖的程度而增加，一次生成的血红蛋白Alc直到红血球的寿命(120天)完结都不会消减，因此反映过去长期的血糖控制状态(非专利文献6)。血红蛋白Alc从1996年开始被采用于老人健康法的基本健康审查的选择检查中，还在1999年的糖尿病新诊断标准中被用作糖尿病的辅助诊断指标，因此认为其是临床上具有重大意义的指标(非专利文献7)。一旦高血糖的状态持续，则认为是葡萄糖特异性胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗性，成为导致高血糖进一步恶化的要因(非专利文献8)。由于为了预防从高血糖状态到糖尿病发病必需长期控制血糖值，因此认为有必要抑制血红蛋白Alc值的上升。为了控制前糖尿病(疑似糖尿病的状态)中的血糖值，推广了饮食疗法及运动。虽然已经有售各种用于抑制进食后引起的血糖值上升的功能性食品(特定保健用食品)，但任何一种都无非是对一过性血糖值上升具有抑制作用。因此，不能够期待长期控制血糖值，急切盼望着此次对血红蛋白Alc降低作用物质的研究。此外，现在作为糖尿病的治疗药，α-葡萄糖苷酶抑制剂、作为胰岛素分泌促进剂的磺酰脲类药物、作为胰岛素抵抗性改善药的噻唑烷衍生物等都作为医药品被使用。但是它们的药效并不令人满意，而且多有由于血糖急剧下降而引起昏睡状态的副作用等问题。考虑到上述状况，急切盼望发现不引起低血糖、可安全摄取，且具有使血红蛋白Alc值下降的长期血糖值控制作用的物质。
以往，在先有技术文献中，作为具有抑制血糖值上升效果的物质公开了如含有来源于大花紫薇成分的血糖值上升抑制剂(专利文献11)、以麦类发酵物的浓缩浸膏作为有效成分的血糖值上升抑制剂(专利文献12)等。
此外，作为以三萜糖苷为有效成分的技术，公开了如将从广东匙羹藤中提取出来的糖苷作为有效成分的糖尿病预防剂(专利文献13)、含有从大花紫薇中提取出来的科罗索酸作为有效成分的代谢改善方法以及用于此的组合物(专利文献14)、脂肪酶抑制剂(专利文献15)、具有免疫抑制活性的三萜衍生物(专利文献16)。
另外，公开了在基于具有羊毛甾烷骨架或者3，4-开环羊毛甾烷骨架的化合物的胰岛素作用增强活性(专利文献17)中，虽然对胰腺疾病的效果不明确，但其效果为增强脂肪细胞的分化调节中的胰岛素作用。
并且，公开了将选自在甾类化合物基本骨架的部分中不含双键的24-烷基胆甾烯-3-酮及24-烷基胆甾烷-3-酮的化合物作为血糖降低剂(专利文献18)。
作为具有结构类似物即4-甲基豆甾-7-烯-3-醇骨架的糖苷，报告了3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基豆甾-7-烯-3-醇存在于为瓜科植物的白泻根(Bryonia alba)中(非专利文献9)，但并不是通常具有食用经验的植物，并且也没有全合成的例子。
专利文献1特表2001-520019号公报专利文献2特开平08-208495号公报专利文献3特开平10-120576号公报专利文献4特开平10-045604号公报专利文献5特开平10-036271号公报专利文献6特开平09-059298号公报专利文献7特开昭60-214741号公报专利文献8特开2003-286185号公报专利文献9美国专利第4598069号说明书专利文献10美国专利申请公开第2003/0207818号说明书专利文献11特开2003-095941号公报专利文献12特开2002-371003号公报专利文献13特开平05-247086号公报专利文献14特开2002-205949号公报专利文献15特开平09-040689号公报专利文献16特表平11-511482号公报专利文献17特开平10-330266号公报专利文献18特开2003-048837号公报非专利文献1Chem.Pharm.Bull.，第624～626页，1993年非专利文献2Biochemica Biophysica Acta，第63～88页，2000年非专利文献3Phytomedicine，第3卷，第245～248页，1996年非专利文献4Phytotherapy Research，第15卷，第157～161页，2001年非专利文献5Phytotherapy Research，第7卷，第37～42页，1993年非专利文献6日本临床，通卷第748号，第1卷，第615～617页，1999年非专利文献7日本临床，通卷第808号，第2卷，第405～409页，2002年非专利文献8矢崎义雄·村松正宽主编，“糖尿病的最前沿”，第126～139页，羊土社，1997年非专利文献9Khimiya Prirodnykh Soedinenii，第3卷，苏联，1977年发明内容本发明的课题在于提供不引起低血糖、可安全摄取，且具有降低血红蛋白Alc值的长期血糖值控制作用的新型化合物。本发明的其他课题在于研究由在食用经验上可安全摄取、且容易获得的原料制备不含工业上非优选成分且含有有效量的上述化合物的组合物的方法。
本发明人等为了解决上述课题进行了深入的研究，结果发现从库拉索芦荟(Aloe barbadensis Miller)的叶肉(透明胶体部分)提取并精制的新型糖苷即3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇，其不引起低血糖、可安全摄取，并且具有降低血红蛋白Alc值的长期血糖值控制作用。基于上述发现完成了本发明。
即，本发明为具有下述化学式(1)所示结构的化合物(以下也称为“本发明化合物”)。
另外，本发明提供含有按干燥质量计为大于等于0.001质量％本发明化合物的组合物(以下也称为“本发明组合物”)。本发明组合物优选为百合科植物的提取物或者其馏分，百合科植物特别优选为库拉索芦荟(Aloe barbadensis Miller)。
本发明还提供将本发明化合物或者本发明组合物作为有效成分来含有的高血糖改善剂(以下也称为“本发明药剂”)。
本发明还提供含有上述高血糖改善剂的医药品或饮食品。
本发明还提供带有用于改善高血糖的说明的饮食品，其特征在于，将本发明化合物或者本发明组合物作为有效成分来含有，并具有高血糖改善作用。
以下，将上述医药品或者饮食品总称为“本发明的医药品或者饮食品”。
本发明进一步提供一种方法，其为本发明化合物或者本发明组合物的制备方法，其特征在于，从含有如权利要求1中所述化合物的百合科植物或其一部分或者它们的粉碎物中，用有机溶剂或者热水提取和浓缩含有相同化合物的馏分，百合科植物特别优选为库拉索芦荟(Aloe barbadensis Miller)。
本发明还提供在高血糖改善用医药品的制备中，本发明化合物或者含有该化合物的组合物的应用。对于本发明的应用而言，上述组合物优选为含有按干燥质量计为大于等于0.001质量％上述化合物的百合科植物的提取物或者其馏分，百合科植物特别优选为库拉索芦荟(Aloe barbadensis Miller)。
本发明还提供一种方法，其为改善高血糖的方法，其特征在于，将本发明化合物或者含有该化合物的组合物给予欲改善高血糖的对象。本发明的方法，上述组合物优选为含有按干燥质量计为大于等于0.001质量％上述化合物的百合科植物的提取物或者其馏分，百合科植物特别优选为库拉索芦荟(Aloe barbadensis Miller)。


是本发明的糖苷的苷元部分乙酰化物的GC-MS谱图(代替附图的照片显示器上显示的半色调图像)[图2]是本发明的糖苷的苷元部分乙酰化物的13C-NMR谱图(代替附图的照片显示器上显示的半色调图像)。
是表示给予了本发明化合物的小鼠的平常血糖值的经时变化图。
是表示给予了本发明化合物的小鼠的空腹时血糖值的经时变化图。

接下来，对本发明的优选实施方式进行详细说明。但本发明并不限于以下的优选实施方式，可以在本发明的范围内进行自由改变。
本发明的化合物为具有上述化学式(1)所示结构的化合物，即3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇。即，本发明的化合物具有4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇的3位羟基与D-葡萄糖的1位羟基脱水缩合的结构。
此外，本发明的组合物为含有按干燥质量计为大于等于0.001质量％、优选为大于等于0.01质量％、更优选为大于等于0.1质量％本发明化合物的百合科植物的提取物或者其馏分。本发明的组合物中含有的本发明化合物的含量的上限没有特别限定，可以举出50质量％、70质量％或者90质量％。
本发明的化合物或者含有该化合物的组合物，可以如下制备例如属于百合科植物、含有本发明化合物的植物或其一部分或者它们的粉碎物中，利用有机溶剂或者热水提取并浓缩含有相同化合物的馏分。
作为上述属于百合科的植物可以举出属于芦荟属或者葱属的植物。作为芦荟属植物可以举出库拉索芦荟(Aloe barbadensisMiller)，好望角芦荟(Aloe ferox Miller)，非洲芦荟(Aloe africanaMiller)，木立芦荟(Aloe arborescen Miller var.natalensis Berger)，女王锦芦荟(Aloe spicata Baker)等。在制备本发明的化合物或者含有该化合物的组合物时，可以使用上述植物的全部，但优选使用叶肉(透明胶质部分)。将这种植物或其一部分优选使用均化器等进行粉碎而成为液状，并用有机溶剂或者热水进行提取。作为有机溶剂，可以举出甲醇、乙醇、丁醇等醇；醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸丁酯等酯；丙酮、甲基异丁基酮等酮；乙醚、石油醚等醚；己烷、环己烷、甲苯、苯等烃；四氯化碳、二氯甲烷、氯仿等卤代烃；吡啶等杂环化合物，乙二醇等二元醇；聚乙二醇等多元醇；乙腈等腈溶剂以及这些溶剂的混合液等。此外，这些溶剂可以是无水的，也可以是含水状态。在这些溶剂中，特别优选醋酸乙酯/丁醇混合液(3∶1)或者氯仿/甲醇混合液(2∶1)。
作为提取方法可以使用在通常的植物成分提取中使用的方法。这些方法可以举出通常相对于1质量份新鲜植物或者干燥植物，使用1～300质量份的有机溶剂，一边搅拌或者振荡，一边在小于等于溶剂沸点的温度下加热回流或者在常温下用超声波进行提取。提取液可以通过过滤或者离心分离等适当方法将不溶物分离，得到粗提取物。
粗提取物可以通过比如正相或反相的硅胶柱色谱法的各种色谱方法进行精制。在正相硅胶柱色谱法中，如果作为洗脱溶剂使用氯仿/甲醇混合液的梯度溶剂，在氯仿∶甲醇＝5∶1左右本发明的化合物就会被洗脱。而在反相硅胶柱色谱法中，如果作为洗脱溶剂使用甲醇/水混合液的梯度溶剂，在浓度为95％左右的甲醇中，本发明化合物就会被洗脱。
得到的馏分可以进一步用HPLC等进行精制。
例如，通过后述实施例中所示的方法可以确认如上得到的化合物或者含有此化合物的组合物都含有本发明的化合物。例如可以通过13C-NMR等确认其是在苷元部分上结合有葡萄糖的糖苷，而且苷元部分为4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇。
本发明的化合物还可以通过缩合D-葡萄糖和4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇而进行制备。4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇可以通过从植物中进行提取和精制而获得。D-葡萄糖和4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇的缩合可以组合如第4版实验化学讲座26、1992年(第272页、第297页以及第342页中记载)所示方法而进行。即，将D-葡萄糖完全乙酰化后，将异头位变换成α-溴化物。在乙醚中使4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇与α-溴化物反应而进行β-糖基化后，在甲醇钠·甲醇中使乙酰基水解，得到目标化合物。
本发明的化合物具有降低血红蛋白Alc值的作用，其结果能够长期控制血糖值。因此，能够作为高血糖改善剂的有效成份进行使用。
此外，以往在库拉索芦荟的叶皮中含有具有缓泻作用的芦荟苷和芦荟大黄素，因而认为不优选作为不希望有缓泻作用的医药品或者饮食品。另一方面，在本发明组合物的优选方式中，由于能够通过从食用经验上可安全摄取的库拉索芦荟叶肉(透明胶质部分)中进行提取和分馏而得到，因此不含有芦荟苷和芦荟大黄素，且含有有效量的本发明化合物。因此，本发明的组合物也优选作为高血糖改善剂的有效成分。
本发明的化合物或者组合物，可以原样用作本发明的药剂或者饮食品的有效成分。并且，本发明的组合物可以是溶液，也可以通过常规方法进行冷冻干燥或者喷雾干燥而作为粉末来保存、使用。
本发明的药剂，可以将本发明的化合物或组合物、或者将它们与制剂学上允许的制剂载体进行组合，通过口服或者非口服方式给予包括人在内的哺乳动物。此外，在本发明的药剂中，本发明的化合物可以使用可药用盐。作为可药用盐，包含金属盐(无机盐)和有机盐两种，它们的清单可以举出“Remington’s PharmaceuticalSciences，第17版，第1418页，1985年”中公开的物质。具体而言，如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐及氢溴酸盐等无机酸盐，苹果酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、双羟萘酸盐、水杨酸盐和硬脂酸盐等有机酸盐，但本发明并不限定于此。还可以为钠、钾、钙、镁、铝等金属盐，或者与赖氨酸等氨基酸形成的盐。此外，上述化合物或者其可药用盐的水合物等溶剂合物也包含在本发明中。
本发明的药剂的制剂方式没有特别限定，可以根据治疗目的进行适当选择，具体而言，可以举出片剂、丸剂、散剂、液剂、悬浊剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、栓剂、注射剂、软膏剂、贴剂、滴眼剂、滴鼻剂等。在制剂化中，作为制剂载体可以使用在通常的高血糖改善用医药品中广泛使用的赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、矫味剂、稀释剂、表面活性剂、注射剂用溶剂等添加剂。另外，只要不损害本发明的效果，还可以并用本发明的化合物或组合物及其它具有高血糖改善作用的药剂。
本发明的药剂中含有的本发明化合物或者组合物的量没有特别限定，可以适当选择，如作为本发明的化合物的量，在制剂中可以是0.001～10质量％、优选为0.01～1质量％、特别优选为0.05～1质量％。
本发明的药剂有助于治疗或者预防由高血糖状态引起的疾病、如糖尿病和前糖尿病(疑似为糖尿病的状态)。特别是可用于预防从高血糖状态到糖尿病发病。
本发明的医药品中含有上述本发明的药剂(高血糖改善剂)，有助于治疗或者预防由高血糖状态引起如糖尿病和前糖尿病(疑似为糖尿病的状态)的疾病。特别是可用于预防从高血糖状态到糖尿病发病。而且，本发明的医药品能够治疗或者预防由高血糖状态引起的各种疾病·并发症等，以及减轻这些疾病·并发症等的危险。
作为这种高血糖状态引起的各种疾病·并发症，可以举出糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经障碍、糖尿病性坏疽、糖尿病引起的脑中风、糖尿病引起的心肌梗塞等。
另外，高血糖状态是指在正常范围以外的状态，正常范围是指一般规定为空腹时血糖值为小于等于110mg/dl、负荷75g糖后1小时的血糖值为小于等于160mg/dl和2小时的血糖值为小于等于120mg/dl的状态(日本临床，通卷第806号，第1卷，第28～35页，2002年)。本发明的药剂优选用于治疗血红蛋白Alc值高于健康常人的状态、如血红蛋白Alc值为大于等于5.8％的患者。
本发明的药剂或者医药品的给药时间没有特别限定，可根据疾病对象的治疗方法选择适当的给药时间。另外，给药方式优选根据制剂形态、患者年龄、性别、其他条件及患者症状的程度等来决定。
本发明药剂的有效成分的给药量根据用法、患者年龄、性别、疾病的程度及其他条件等进行适当选择。通常，作为有效成分的本发明化合物的量可以将优选为0.01～10mg/kg/日、更优选为0.1～1mg/kg/日范围的量作为标准，此外，在使用本发明组合物时，作为组合物的干燥重量可以将优选为0.1～1000mg/kg/日、更优选为1～100mg/kg/日范围的量作为标准。在任何情况下都可以1日1次或者分为多次给药。
本发明的药剂或医药品、或者为它们的有效成分的本发明化合物或组合物，都可以包含在饮食品(饮料或者食品)中。作为饮食品，只要是不损害上述有效成分的效果、可口服摄取的物质，在形态、性状上就没有特别限定，除了含有上述有效成分以外，可以使用通常用于饮食品的原料，并利用通常的方法进行制备。
本发明的饮食品中含有的本发明化合物或者组合物的量没有特别限定，可进行适当选择，例如作为本发明化合物的量，在饮食品中可以为0.0001～1质量％、优选为0.001～1质量％、特别优选为0.005～1质量％。
作为本发明的饮食品的用途，可以是利用高血糖改善效果之类的各种用途。例如，可以举出适于开始注意血糖值者的饮食品、有助于降低·除去糖尿病等生活习惯病的危险要因的饮食品等用途。
此外，在本发明的饮食品中，“高血糖改善”是指改善或预防由高血糖引起的对健康的种种损害，作为与上述“高血糖改善”意思相同的词句，在本发明中还可以例举出“高血糖预防”、“抑制血糖值上升”、“改善血糖值上升”、“预防血糖值上升”、“改善高血糖蛋白Alc值”等。
此外，本发明的饮食品有助于预防由高血糖状态引起的如糖尿病及前糖尿病(疑似为糖尿病的状态)的疾病。特别是还可以用于预防从高血糖状态到糖尿病发病。并且，本发明的饮食品能够预防由高血糖引起的种种疾病·并发症等，以及降低这些疾病·并发症等的风险。
作为由此高血糖状态引起的种种疾病·并发症，可以举出糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经障碍、糖尿病性坏疽、糖尿病引起的脑中风、糖尿病引起的心肌梗塞等。
本发明的饮食品优选作为带有用于改善高血糖的说明的饮食品等进行售卖，所述饮食品例如“表示为用于高血糖改善、含有具有高血糖改善效果化合物的饮食品”、或者“表示为用于高血糖改善、含有植物提取物的饮食品”及“记载为用于高血糖改善、含有库拉索芦荟提取物的饮食品”等。
此外，本发明的化合物或者组合物等由于具有高血糖改善作用，因此认为高血糖改善的说明中也含有抑制血糖上升的意思。因此，本发明的饮食品能够表示为“用于抑制血糖上升”。即，上述用于高血糖改善的表示也可以表示为这种“用于抑制血糖上升”。
此外，为了进行上述表示所使用的语句不仅限于“用于高血糖改善”或者“用于抑制血糖上升”，也可以为另外的语句，只要是表示改善高血糖或者抑制血糖值上升的效果的语句，就自然包括在本发明的范围之内。作为这种语句，也可以是如相对于需要者，基于确认高血糖改善或者抑制血糖值上升的效果的各种用途的表示。例如可以举出“适于对血糖值开始注意者”，“利于减轻·除去糖尿病等生活习惯病的危险要因(风险)”等表示。
上述的“表示”是指为了使需要者了解到上述用途的全部行为，只要是使想起·类推出上述用途的表示，不限于任何表示目的、表示内容、表示对象物·介质等，全部相当于本发明的“表示”。但是，优选通过需要者能够直接认识到上述用途的表述而表示。具体而言，可例举出在本发明的饮食品涉及的商品或者商品包装上记载上述用途的行为；将在商品或商品包装上记载有上述用途的表示进行转让或交付，为了转让或者交付所进行的展示、进口的行为；在与商品有关的广告、价格表或者贸易文件上记载上述用途，对它们进行展示或分发的行为，或者在将这些作为内容的信息中记载上述用途并通过电磁(国际互联网等)方法进行提供的行为等。
另一方面，作为表示，优选为被行政部门等认可的表示(例如，以行政部门规定的各种制度为基础而被认可，以这种认可为基础的方式进行表示)，特别是优选为在包装、容器、目录、小册子、POP等售卖现场的广告材料及其他书类等上的表示。
另外，例如可以举出作为保健食品、功能性食品、经肠营养食品、特殊用途食品、营养功能食品、准药品等的表示，其他被厚生劳动省认可的表示可以举出如特定保健用食品，被与此类似的制度认可的表示。作为后者的例子，可以举出作为特定保健用食品的表示、作为附带条件的特定保健用食品的表示、旨在影响身体构造和机能的表示、减轻疾病风险的表示等，详细而言，作为典型的例子可以举出作为在健康增进法实施细则(平成15年4月30日日本厚生劳动省令第86号)中规定的特定保健用食品的表示(特别是保健用途的表示)以及与此类似的表示。
实施例1接着给出实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
以下给出从库拉索芦荟中制备3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇的例子。
按下述方法从库拉索芦荟中提取并精制3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇。
利用均化器使100kg库拉索芦荟的叶肉(透明胶质部分)形成液状，向其中添加100L醋酸乙酯/丁醇混合液(3∶1)，并进行搅拌。
放置一晚后，分层为醋酸乙酯/丁醇混合液和水层，回收醋酸乙酯/丁醇混合液。将此醋酸乙酯/丁醇混合液在减压下浓缩，得到的醋酸乙酯/丁醇混合液提取物的重量为13.5g。
使用上述水层和醋酸乙酯/丁酯混合液提取物，使用后述的糖尿病模型小鼠进行高血糖改善作用的评价，结果确认了与醋酸乙酯/丁醇混合液提取物相同的效果，因此尝试了此提取物成分的分离、精制。首先，通过薄层色谱法(Merck公司制，硅胶60F254及RP-18F2543)对上述提取物进行研究，结果认为使用了氯仿/甲醇混合液的正相硅胶柱色谱法的分离方法是适合的。因此，在填充有400g硅胶60(Merck公司制)的柱中，上样在1ml氯仿/甲醇混合液(1∶1)中溶解有13g上述提取物的溶液，使其吸附于柱后，使用氯仿/甲醇混合液，通过使甲醇浓度逐步上升的逐步梯度洗脱法(各混合比为氯仿/甲醇＝100∶1、25∶1、10∶1、5∶1及1∶1)进行洗脱，在每个上述混合液的混合比下分馏洗脱液。除去各馏分溶剂后的粗精制物的收量分别为1.44g、3.0g、1.17g、1.28g、2.27g。在这些馏分中，通过使用了上述模型动物的方法确认了在氯仿∶甲醇＝5∶1下洗脱的馏分(粗精制物A)中存在活性成分。而且，在利用薄层色谱法进行分析后，未能确认存在芦荟苷和芦荟大黄素。
为了进一步从上述粗精制物A中进行活性成分的分离精制，使用薄层色谱法(Merck公司制，硅胶60F254及RP-18F2543)对此粗精制物A进行研究后，认为使用了甲醇的反相硅胶柱色谱法的分离方法是适合的。因此，将上述粗精制物A溶解在1ml氯仿/甲醇混合液(1∶1)中，并上样于填充有180g COSMOSIL 140(Nacalai Tesque公司制)的柱上，使其吸附在柱上后，依次用600ml的85％甲醇溶液、600ml的95％甲醇溶液及100ml的100％甲醇进行洗脱。3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇从95％甲醇的洗脱馏分中被浓缩分离出来，除去其溶剂后的重量为370mg。以下，称此化合物为化合物1。
对化合物1进行薄层色谱法研究，结果显示了与β-谷甾醇葡萄糖苷极为接近的Rf值，因此推测其为在苷元部分结合有1分子糖的糖苷。并且，为了研究化合物1的糖组成，将化合物1进行甲醇分解后作为TMS衍生物，并利用GC-MS进行测定。其结果如下测定化合物1糖部分的TMS衍生物，其主峰的保留时间为14.28min、14.61min、16.34min，与葡萄糖标准品(Nacalai Tesque公司制)主峰的保留时间14.27min、14.60min、16.33min基本一致。另外，并未见到与半乳糖标准品(Kishida公司制)和木糖标准品(Kishida公司制)的主峰相当的峰。因此，确认化合物1中含有的糖的种类为葡萄糖。
由以上的结果推测化合物1为在苷元部分结合有1分子葡萄糖的糖苷。但是，用13C-NMR(125MHz、CDCl3)测定化合物1，其结果确认了杂质的存在，因此认为在结构确定上还必需进行进一步精制。因此，将化合物1甲醇分解后，进行乙酰化，从而确认了苷元部分的结构及苷元部分与糖的结合部位。以下给出其方法。
将50mg化合物1溶解于含有5％盐酸的甲醇(50ml)后，加热回流6小时进行甲醇水解，然后进行干燥，即得残渣(约30mg)。用硅胶柱色谱法(己烷∶氯仿＝9∶1)精制该残渣，即得化合物2(10mg)。在该化合物2(5mg)中加入醋酸酐·吡啶(各2滴)，在70℃下加热30分钟进行乙酰化，然后蒸馏除去反应液的溶剂，即得化合物3。用GC-MS和13C-NMR(125MHz、CDCl3)分析该化合物3，结果分别示于图1和图2中。测定条件和结果如下。另外，作为标准物使用的3-乙酰氧基-4-甲基麦角甾烷-7-烯，是从芦荟中提取精制后，用13C-NMR确认了结构后进行乙酰化而制成的。
；C-136.8，C-227.3，C-378.7，C-437.0，C-546.9，C-626.8，C-7117.4，C-8139.4，C-949.7，C-1034.9，C-1121.6，C-1239.7，C-1343.6，C-1455.1，C-1523.1，C-1628.2，C-1756.3，C-1812.0，C-1914.2，C-2036.5，C-2119.0，C-2233.9，C-2330.6，C-2439.1，C-2532.6，C-2620.4，C-2718.4，C-2815.6，C-2915.3[GC-MS]装置GC-17A/GCMS5050A(岛津)GC柱NEUTRA BOND-5(GL Scienses)柱温100℃(2分)→(10℃/分)→300℃(28分)进样温度250℃载气He(1.3mL/分)界面温度300℃MS方式EI离子化能量70eV[结果]标准物质3-乙酰氧基-4-甲基麦角甾-7-烯4tR[min]＝39.4；m/z456[M]+，441[M-CH3]+，396[M-AcOH]+，381[M-CH3-AcOH]+化合物3tR[min]＝39.2；m/z 456[M]+，441[M-CH3]+，396[M-AcOH]+，381[M-CH3-AcOH]+由NMR的测定结果可知，化合物3与3-乙酰氧基-4-甲基麦角甾-7-烯的文献值一致(油化学，第36卷，第5号，第301～319页，1987年)。由此结果可确认化合物2为4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇。使用FAB-MS进行测定，结果是化合物1的分子量为576。在脱水缩合化合物2(苷元部分)和葡萄糖时，所得化合物的分子量为414(化合物2)+180(葡萄糖)-18(水)＝576，与化合物1的分子量一致。
由上述结果可确认化合物1的结构为3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇。
以下给出各自的分子式、分子量及化学式。
(化合物1)分子式C35H60O6分子量576化学式下述化学式(1)[化2] (化合物2)分子式C29H50O分子量414化学式下述化学式(2)[化3]
(化合物3)分子式C31H52O2分子量456化学式下述化学式(3)[化4] [制备例2]加热干燥库拉索芦荟的叶肉(透明胶质部分)，在0.3g粉碎的干燥库拉索芦荟粉末中加入60ml的60％、80％、或者100％乙醇后，在60℃下加热回流1小时。将提取液在1500rpm下离心分离20分钟，将上清液在减压下浓缩，完全除去乙醇，即得粗提取物。使用60％、80％及100％的乙醇提取得到的粗提取物干燥重量分别为65mg、42mg、18mg。通过薄层色谱法确认这些粗提取物中都含有3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇。

加热干燥库拉索芦荟的叶肉(透明胶质部分)，在0.3g粉碎的干燥库拉索芦荟粉末中加入60ml水后，在95℃下加热回流5小时。将提取液在1500rpm下离心分离20分钟，将上清液冷冻干燥，即得75mg粗提取物。通过薄层色谱法确认此粗提取物中含有3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇。
加热干燥库拉索芦荟的叶肉(透明胶质部分)，将其粉碎并进行干燥，在21kg由此制备的库拉索芦荟粉末中，加入90升氯仿/甲醇混合液(2∶1)后，在室温下浸渍一晚，然后过滤，向过滤残渣中再次加入90升氯仿/甲醇混合液(2∶1)，进行4次同样的操作。在28℃下浓缩得到的滤液(350升)，最终得到784g粗提取物。其中，向780g粗提取物中加入2升氯仿/甲醇混合液(2∶1)，搅拌1小时后过滤，回收氯仿/甲醇混合液层(A)。向过滤残渣中依次加入2.5升水和2升醋酸乙酯，搅拌1小时后回收醋酸乙酯层(B)，向残余的水层中再次加入5升氯仿，搅拌1小时后回收氯仿层(C)。
混合回收的A、B及C有机溶剂提取液，在23℃下浓缩后，上样于硅胶柱(玻璃柱52mm×350mm，填充剂IR-63/210-W(Daiso株式会社制))。接着，用薄层色谱法检测洗脱物，同时依次用10升己烷/氯仿混合液(1∶1)、10升氯仿、20升氯仿/甲醇混合液(10∶1)及20升氯仿/甲醇混合液(5∶1)进行洗脱，按各洗脱溶剂的顺序，回收馏分1(约1升)、馏分2(约1.5升)、馏分3(约1.5升)和馏分4(约1.5升)。
其中，由薄层色谱法确认馏分3中含有目标糖苷后，除去溶剂，即得131.6g粗提取物。将此130g粗提取物再次上样于硅胶柱[玻璃硅胶柱70mm×500mm，填充剂SP-60-40/60(Daiso株式会社制)]，分别将10升氯仿/甲醇混合液(30∶1)、50升氯仿/甲醇混合液(20∶1)、10升氯仿/甲醇混合液(10∶1)、10升氯仿/甲醇混合液(1∶1)作为洗脱溶剂，在压力10kgfcm-2、流速40ml/min的条件下依次洗脱。用馏分收集器将洗脱液划分为每100ml一个馏分，回收馏分1～8。
利用薄层色谱法确认回收的馏分，结果可知在馏分7中存在目标糖苷和杂质，因此浓缩此馏分，再次上样于硅胶柱[玻璃柱70mm×500mm，填充剂SP-60-40/60(Daiso株式会社制)]分别将10升氯仿/甲醇混合液(20∶1)、10升氯仿/甲醇混合液(10∶1)作为洗脱溶剂，在压力10kgfcm-2、流速40ml/min的条件下依次洗脱。结果在氯仿/甲醇混合液(10∶1)洗脱馏分中得到了25.3g为目标糖苷的3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇。
本试验用于评价3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇对高血糖状态的改善效果。
(1)样品的制备将在上述制备例1中得到的3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇作为试验样品。
(2)试验方法作为II型糖尿病模型小鼠使用了6周龄、雄性db/db小鼠(从CLEA JAPAN公司购入)。将该小鼠分组为1组7只。将试验样品溶解于DMSO后，用生理盐水将3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇的浓度调至15μg/ml。最终DMSO浓度调至0.2％。使用灌胃器对该II型糖尿病模型小鼠1日1次连日口服给予1ml试验样品溶液。而且将不含有试验样品的溶液作为阴性样品。使用AntsenseII(拜耳三共公司制)经时测定空腹时血糖值和平常血糖值。空腹时血糖值是在绝食15小时后进行测定的。
(3)高血糖改善效果图3和图4中显示了平常血糖值和空腹时血糖值在试验样品给药期间的经时变化。虽然观察到在给予了阴性样品的小鼠中，在平常血糖值和空腹时血糖值的任何一个中血糖值都急剧上升，但在连续给予了试验样品的小鼠中，明显地观察到了抑制血糖值上升的效果。
本试验用于评价3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇对血红蛋白Alc的降低作用。
(1)样品的制备将在上述制备例1中制备的3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾烷-7-烯-3-醇作为试验样品。
(2)试验方法作为II型糖尿病模型小鼠使用了6周龄、雄性db/db小鼠(从CLEA JAPAN公司购入)。将该小鼠分组为1组7只。将试验样品溶解于DMSO后，用生理盐水将3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇的浓度调成1、5、15μg/ml。最终DMSO浓度调至0.2％。使用灌胃器对该II型糖尿病模型小鼠1日1次连日口服给予1ml试验样品溶液。而且将不含有试验样品的溶液作为阴性样品。在开始给药后的第35天，使用DCA2000(拜耳三共公司制)测定血红蛋白Alc。
(3)血红蛋白Alc的降低作用开始给药后第35天的血红蛋白Alc测定结果示于表1中。与给予了阴性样品时的血红蛋白Alc值相比，统计学上可见连续给予了5或15μg的试验样品组均具有显著性的血红蛋白Alc下降，显示了长期血糖值控制效果。此外，在给药期间，发生副作用症状和给药后引起低血糖状态的例子一次都没有，体重和病理检查也未发现异常。
表1

*统计学上有显著性差异。
本试验用于进行提取粗精制物A对血红蛋白Alc的降低作用和给药量的研究，其中，该粗精制物A含有源自库拉索芦荟的3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇。
(1)样品的制备使用在上述制备例1中得到的含有3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-甲基麦角甾-7-烯-3-醇的提取粗精制物A。
(2)试验方法作为II型糖尿病模型小鼠使用了6周龄、雄性db/db小鼠(从CLEA JAPAN公司购入)。将该小鼠分组为1组7只。将试验样品溶解于DMSO后，用生理盐水将提取粗精制物A的浓度调成25、100、200μg/ml。最终DMSO浓度调至0.2％。使用灌胃器对该II型糖尿病模型小鼠1日1次连日口服给予1ml试验样品溶液。而且将不含有试验样品的溶液作为阴性样品。在开始给药后的第35天，使用DCA2000(拜耳三共公司制)测定血红蛋白Alc。
(3)血糖值和血红蛋白Alc值开始给药后第35天的血红蛋白Alc测定结果示于表2中。与阴性试验的血红蛋白Alc值相比，可见连续给予了100或200μg试验样品组的血红蛋白Alc降低，在统计学上显示了有显著性差异的长期血糖值控制效果。而且，在给药期间，发生副作用症状和给药后引起低血糖状态的例子一次没有发生，体重和病理检查也未发现异常。
表2

*统计学上有显著性差异。
产业实用性本发明的化合物为不引起低血糖、可安全地给药或摄取，且具有可降低血红蛋白Alc值的长期血糖值控制作用。此外，本发明的组合物可使用食用经验上可安全摄取、获得容易的植物如芦荟属或者葱属的百合科植物来进行制备。另外，本发明的组合物为含有有效量的本发明化合物的物质，优选方式中不含有为医药品或饮食品中非优选成分的芦荟苷或芦荟大黄素。


3－O－β－D－吡喃葡萄糖基－4－甲基麦角甾－7－烯－3－醇，或者含有该化合物的百合科植物的提取物或其分馏物，将含有大于等于0.001质量％上述化合物的组合物作为高血糖改善剂的有效成分。