专利名称：一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用的制作方法十字花科作物包括油菜和大宗蔬菜，如大白菜、甘蓝、花椰菜、苤蓝、茎芥菜、芥菜、萝卜、小白菜、瘤芥菜(榨菜)及特种作物板蓝根和山葵等，每年发生根肿病面积达2000多万亩(次)，特别是一旦发生，病害逐年加重，十字花科植物根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae woron.)侵染引起。十字花科根肿病对蔬菜产量影响极大，十字花科作物，最严重的可能会导致减产70% -80%，甚至让菜农颗粒无收，不能在同地块种植十字花科作物。由于近些年来，种子和蔬菜种苗大范围、远距离引种，根肿病发生范围扩大，西自新疆的霍尔果斯、西藏的察隅，东至台湾，北自黑龙江，南至海南岛全国各省区均有分布。特别是大棚温室育苗和漂浮育苗更加快了病害流行速度，致使新的病区只能种植一年，第二年就无法种植。病菌能在土壤中存活10年以上，且可以通过侵染杂草而得到繁殖，导致轮作不能很好地起到防病作用，水旱轮作导致病菌均匀扩散，还会加重病害。目前，防治根肿病的措施主要有检疫，农业栽培措施，抗病品种、及化学防治措施，但防治效果均不理想。经文献检索，尚未见利用甲基营养型芽孢杆菌制备生物制剂，并应用于大田防治十字花科蔬菜根肿病的公开报道。
本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种高效、无毒、安全无残留的甲基营养型芽孢杆菌及其应用。本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BWJ已经保藏。保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京.中关村；保藏日期2012年5月28日；保藏号CGMCC NO :6159。本发明的生产菌株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BWJ,分离自云南省昆明市郊蔬菜根际，经形态学、培养性状、常规生理生化、Biolog全自动鉴定系统测定和16S rDNA序列测定及其系统发育学分析，该生产菌株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BffJ 为一个新菌株。该菌株具有以下特征(I)菌落圆形，表面有皱褶，不透明，白色，革兰氏染色阳性，在显微镜下菌体短杆状，产芽孢，周生鞭毛。(2)该菌株抑菌谱广、抑菌能力强，能在大白菜等多种作物根际定植，对一些细菌性海棠叶斑病菌、甘蓝黑腐病菌、魔芋细菌性软腐病菌、水稻细菌性病菌等病原细菌都有较强的抑制作用，菌株BWJ对尖镰孢菌抑制效果最好，其次是辣椒疫霉病菌和立枯丝核菌、茄镰胞菌，而对茄镰胞菌的抑菌效果也非常明显。(3)具有以下生理生化特征=Biolog生理生化特征能利用糊精、甘露聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、L-阿拉伯糖、纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡糖酸、a-D-葡萄糖、麦芽糖、D-甘露醇、D-山梨糖醇、蔗糖、L-苹果酸、丙酮酸、N-乙酰-L-谷氨酸、D-丙氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰氨、L-谷氨酸、L-丝氨酸、甘油等。不能利用吐温40,N-乙酰-甘露、L-岩藻糖、L-鼠李糖、水杨苷、果糖-6-磷酸、葡糖-I-磷酸、葡糖-6磷酸。本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus) BWJ菌株用于大田防治十字花科蔬菜根肿病制剂的制备中，即通过常规的液体或固体培养，获得包括细菌菌体培养物；通过常规的液体发酵生产，加入润湿剂、展着剂，或与吸附载体按一定比例混合后，经过滤、浓缩、粉碎和晾干，制备成液剂或可湿性粉剂。本发明具有高效、无毒、安全无残留，BWJ菌株活菌控病、促生效果较好，综合性状较好，易于工业化生产的特点，其生产菌株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus) BffJ能够用于制备大田防治十字花科蔬菜根肿病的制剂中。 拮抗试验采用平板对峙I)菌悬液的制备将得到的芽孢杆菌和病原细菌分别接入装有50ml的NAA液体培养基的三角瓶中，置于28° C、160r/min摇床上培养48h。将菌悬液用无菌水适当稀释，摇均勻后，用600nm波长、Icm比色皿测定OD值。测定时用无菌NAA培养基作空白对照。用无菌水稀释使得菌悬液的为OD值0. 5，待用。2)对病原细菌抑菌作用的测定取上步所得病原细菌菌悬液200ul加入培养皿中，将冷却至45° C左右的NAA培养基倒入己加过病原细菌菌悬液的培养皿中，混匀。等完全凝固后，放置牛筋环于培养基表面，取上步所得BWJ菌悬液200 Ul加入牛筋环，28° C中培养2-4d。观察、记录试验结果。3)对病原真菌抑菌作用的测定在PDA平板中心接种植物病原菌菌盘(直径5mm)，两侧2cm处接种BWJ菌株。置28°C培养箱中培养，观察抑菌情况。表I防菌BWJ菌株对植物病原细菌的抑菌效果
本发明涉及一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用，属生物技术领域。本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus) BWJ已于2012年5月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.6159。本发明的甲基营养型芽孢杆菌用于大田防治十字花科蔬菜根肿病制剂的制备中。本发明具有高效、无毒、安全无残留，BWJ菌株活菌控病、促生效果较好，综合性状较好，易于工业化生产的特点，其生产菌株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus) BWJ能够用于制备大田防治十字花科蔬菜根肿病的制剂中。