专利名称：一种用秸秆类木质纤维素原料生产乙醇的方法秸秆类木质纤维素资源的主要成分是纤维素、半纤维素和木素。其中，纤维素、半纤维素是可发酵糖的来源，含量占木质纤维的66-75% (纤维质原料的绝干重量)。秸秆类木质纤维素大量存在于自然界中且能够不断再生，但其利用度相当低，只有极少部分被用作造纸原料、饲料和制备化学品。乙醇俗称酒精，不仅是一种非常重要的有机化工原料和溶剂，而且因其可再生和对环境无污染，被认为是可替代石油类不可再生资源的最有发展前景的液体燃料，我国燃料乙醇的市场规模正急剧扩大。以秸秆类木质纤维素为原料制备乙醇是这类原料能源化利用最为广泛的课题。乙醇常规发酵的方法是半连续的高糖发酵，这种常规发酵的缺点是糖醇转化率很低，综合成本过高，使得目前秸秆乙醇很难投入大规模生产。中国专利200910229716. 8“从秸秆中制备酒精的方法”专利公开了将秸秆与pH值调至2-4的酸性水溶液按照1份2-3份的质量比投入到蒸煮罐中，常压下加热至60-90°C 进行蒸煮4-8小时；将蒸煮后的反应物压榨，得到的溶液中和、调整浓度15-25%，按常规发酵工艺生产乙醇。1吨秸秆可得0.15或0.20吨乙醇。该方法糖醇转化率较低，综合成本过尚ο因此，需要一种增加秸秆的糖醇转化率，降低秸秆乙醇的生产成本的方法。
本发明的目的是提供一种生产成本低、生产效率高、资源利用率高的利用秸秆类木质纤维素生产乙醇的方法。本发明提供的一种用秸秆类纤维素原料生产乙醇的方法，包括以下步骤将秸秆类木质纤维素原料酶解，制成的秸秆酶解糖液加入酿酒酵母进行低糖发酵和厌氧发酵，当发酵液中的总糖浓度降至0. 8% -1. 2%时开始添加秸秆酶解糖液，维持发酵液中的总糖浓度在2% -3%。本发明提供的一种用秸秆类纤维素原料生产乙醇的方法，包括以下步骤1)酵解将秸秆类木质纤维素原料酶解，得到秸秆酶解糖液；2)低糖有氧发酵将制成的秸秆酶解糖液加入酿酒酵母进行低糖发酵，使其总糖浓度为2-3% ；3)当细胞浓度即光密度达到15-20时，进入第二阶段厌氧发酵；4)当厌氧发酵液中的总糖浓度降至0. 8% -1. 2%时，开始采用流加的方式添加秸秆酶解糖液，维持发酵液中的总糖浓度在2% -3%。本发明提供的一种用秸秆类纤维素原料生产乙醇的方法，进一步优选，包括以下步骤1)酵解将秸秆类木质纤维素原料酶解，得到秸秆酶解糖液；2)低糖有氧发酵将制成的秸秆酶解糖液加入酿酒酵母进行低糖发酵，使其总糖浓度为2-3%;无菌空气以通风比为1 0.4-0.8的通风速率流入发酵培养基中，搅拌转速为300-500rpm，维持溶氧浓度为60-80%，温度控制在30-31°C，好氧培养6_12小时；3)当细胞浓度即光密度达到15-20时，进入第二阶段厌氧发酵，搅拌转速为 100-300rpm，温度控制在31-33 °C，厌氧发酵60-70小时；4)当厌氧发酵液中的总糖浓度降至0. 8% -1. 2%时，开始采用流加的方式添加秸秆酶解糖液，维持发酵液中的总糖浓度在2% -3%，发酵55小时后停止流加，当残糖降至 0-0. 2%时停止发酵。其中，所述秸秆类木质纤维素原料选自玉米秸秆、油菜秸秆、高梁秸秆、小麦秸秆、 稻草秸秆或玉米芯中的一种或几种。上述所述浓度以g/100ml计；所述步骤2)的发酵培养基由以下质量百分比的成分组成秸秆酶解糖液 20-30 %，酵母膏 0. 1-0. 3 %，玉米浆 1-3 %，磷酸二氢钾 0. 04-0. 06 %，硫酸铵 0. 04-0. 06 %， 磷酸氢二铵0. 1-0. 2%，其余为水，pH 5. 0-6. 0。优选地，发酵培养基由以下质量百分比的成分组成秸秆酶解糖液25%，酵母膏0. 2 %，玉米浆2 %，磷酸二氢钾0. 05 %，硫酸铵0. 05 %，磷酸氢二铵0. 15 %，其余为水， pH5. 0-6. O0所述步骤幻的发酵培养基还可以由以下质量百分比的成分组成秸秆酶解糖液20-30 %，酵母膏0. 1-0. 5 %，蛋白胨0. 01-0. 05 %，玉米浆0. 5-1. 0 %，磷酸二氢钾 0. 04-0. 06%，硫酸镁 0. 04-0. 06%，其余为水，ρΗ5· 0-6. 0。所述添加的方式为流加，发酵55小时后，停止流加直至发酵结束。流加的方式可以大大的降低高糖的底物抑制作用，提高糖醇转化率，缩短发酵周期，降低生产成本。所述步骤4)中添加秸秆酶解糖液的总糖浓度在20-30%。所述秸秆酶解糖液由秸秆酶解后制得，含糖浓度以葡萄糖计为2-8%葡萄糖，在步骤4)加入前需要进行浓缩处理。所述发酵生产乙醇的酵母即酿酒酵母为基因工程酵母S. cerevisiaeZU-10，购自浙江大学，普通酵母只能利用葡萄糖发酵制备乙醇，该菌种不仅可以利用葡萄糖还可以利用木糖发酵制备乙醇。本发明所采用的秸秆酶解糖的制备过程为(本人在专利200910259678. 0“一种乙醇和木糖醇的联合发酵方法”中已经叙述过)1)蒸煮将秸秆类木质纤维素原料加入浓度为1. 6-2. 2%碱液，在90-120°C下蒸煮0. 5-2小时；或将秸秆类木质纤维素原料加入浓度为0. 1-1. 0%酸液，在120-180°C下蒸煮0. 1-2. 5小时；2)固液分离将蒸煮液固液分离，获得秸秆黑液和秸秆蒸煮渣；3)秸秆蒸煮渣酶解用纤维素酶、木聚糖酶或纤维二糖酶中的一种或多种，对秸秆蒸煮渣进行酶水解，得酶解液；酶用量为每克酸解渣2-100PFIU纤维素酶，1-50IU纤维二糖酶，10-500PFIU木聚糖酶；酶解过程中控制pH为2. 0-7.0，温度为20_80°C，酶解时间为10-240小时；4)固液分离酶解液固液分离得到富含葡萄糖和木糖的秸秆酶解糖和富含木质素的酶解渣。本发明利用秸秆类纤维素原料生产乙醇的方法，该方法体现在将秸秆酶解糖以一定的速度流加进入秸秆乙醇发酵体系中，既有效减少了乙醇发酵的周期，提高了乙醇浓度， 又解决了高浓度发酵下的底物抑制作用，提高了糖酒转化率，从而有效提高了秸秆类纤维素原料的综合利用率。与常规发酵方法制备乙醇相比，本发明大大提高了糖醇转化率，使得用秸秆类木质纤维素原料生产乙醇的糖醇转化率由原来的不到46%提高到现在的49%以上。与200910229716. 8专利申请中的方法相比，该发明的糖醇转化率大大的提高了， 从而进一步提高了秸秆类木质纤维素原料的综合利用率，此外在秸秆酶解糖液制备过程中产生的黑液还可以用来制备水泥减水剂，提取香兰素等，进一步提高秸秆资源的价值。5
发酵摇瓶培养基的组成为秸秆酶解糖液(含葡萄糖30% ) 30%，酵母膏0.2%，玉米浆1%，磷酸二氢钾0. 05%，硫酸铵0. 05%，磷酸氢二铵0. 15%,pH5.8,自来水配制；将摇瓶菌种接种到上述发酵摇瓶培养基中培养，接种量为10% (v/v)，35°C培养 72小时，摇床转速为200rpm。5、发酵罐培养发酵罐中发酵培养基的组成为秸秆酶解糖液(含葡萄糖25% )30%，酵母膏 0.2%，玉米浆1%，磷酸氢二钾0. 05%，硫酸铵0. 05%，磷酸氢二铵0. 15%, pH5. 8，自来水配制。将摇瓶种子培养或种子罐中种子培养的菌种接种到上述发酵罐培养基中培养，接种量为10% (ν/ν)，31-35°C培养70小时，摇床转速为200rpm。根据秸秆酶解糖液的体积选择培养基，将培养的酿酒酵母菌种接种到含有秸秆酶解糖液的发酵罐中培养，接种量为10% (ν/ν)，根据该菌株在生长、代谢的不同阶段对氧气及不同碳源需求量的差异，进行有氧、厌氧两段组合发酵技术，在发酵罐培养的第一阶段为有氧发酵阶段，无菌空气以通风比为1 0.8的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为300-500rpm，维持溶氧浓度(DO)为60%，温度控制在30°C，好氧培养8小时；当细胞浓度即光密度(OD)达到16时，进入第二阶段厌氧发酵，搅拌转速为200rpm，温度控制在 33°C，当发酵液中的总糖浓度降至0. 8%时，采用流加的方式添加秸秆酶解糖液，维持发酵液中的总糖浓度在2%左右，发酵55小时后停止流加，当残糖浓度降至0. 2%时发酵结束， 乙醇产率达到8. 9%，糖醇转化率达到49. 4%。实施例21、平板培养平板培养基的组成为秸秆酶解糖液(含葡萄糖3% ) 1. 0L,占总重量的25%，酵母膏0. 5%，蛋白胨0. 5%，琼脂2% ；将酿酒酵母菌种接种到该培养基中，32°C培养观小时；2、摇瓶种子培养摇瓶种子培养基的组成为葡萄糖3 %，酵母膏0.5%，蛋白胨0. 15%，玉米浆 0.5%，磷酸二氢钾0. 05%，硫酸镁0. 06%,pH5. 0,自来水配制；将平板培养的酿酒酵母菌种接种到上述摇瓶种子培养基中，500ml三角瓶装液量 100ml，32°C培养四小时，摇床转速为200rpm ；3、种子罐种子培养种子罐种子培养基的组成为秸秆酶解糖液20% (含葡萄糖5% )，酵母膏0. 5%， 蛋白胨0. 05 %，玉米浆0.8%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0. 06 %，pH5. 5，自来水配制；将摇瓶培养的酿酒酵母菌种接种到上述种子罐种子培养基中，接种量为5% (ν/ v)，32°C培养沘小时，搅拌转速为200rpm，通风比为1 0.3。4、发酵摇瓶培养发酵摇瓶培养基的组成为秸秆酶解糖液(含葡萄糖25-30%)30%,酵母膏0.2%， 玉米浆1%，磷酸二氢钾0. 05%，硫酸铵0. 05%，磷酸氢二铵0. 15%,pH5.6,自来水配制；将摇瓶菌种接种到上述发酵摇瓶培养基中培养，接种量为20% (v/v)，32°C培养 70小时，摇床转速为200rpm。5、发酵罐培养
发酵罐中发酵培养基的组成为秸秆酶解糖液(含葡萄糖25-30% )30%，酵母膏 0.2%，玉米浆1%，磷酸氢二钾0. 05%，硫酸铵0. 05%，磷酸氢二铵0. 15%, pH5. 2，自来水配制；将摇瓶种子培养或种子罐中种子培养的菌种接种到上述发酵罐培养基中培养，接种量为15% (v/v)，31°C培养70小时，摇床转速为200rpm。根据秸秆酶解糖液的体积选择培养基，将培养的酿酒酵母菌种接种到含有秸秆酶解糖液的发酵罐中培养，接种量为20% (ν/ν)，根据该菌株在生长、代谢的不同阶段对氧气及不同碳源需求量的差异，进行有氧、厌氧两段组合发酵技术，在发酵罐培养的第一阶段为有氧发酵阶段，无菌空气以通风比为1 0.4的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为500rpm，维持溶氧浓度(DO)为70%，温度控制在31°C，好氧培养6小时；当细胞浓度即光密度(OD)达到16时，进入第二阶段厌氧发酵，搅拌转速为150rpm，温度控制在33°C， 当发酵液中的总糖浓度降至1. 0%时，采用流加的方式添加秸秆酶解糖液，维持发酵液中的总糖浓度在2. 5%左右，发酵55小时后停止流加，残糖浓度降至0. 15%时发酵结束，乙醇产率达到8.7%，糖醇转化率达到48. 3% ο实施例31、平板培养平板培养基的组成为秸秆酶解糖液(含葡萄糖3% ) 1. 0L，酵母膏0. 5%，蛋白胨 0. 5%，琼脂2%。将酿酒酵母菌种接种到该培养基中，32°C培养沈小时；2、摇瓶种子培养摇瓶种子培养基的组成为葡萄糖3 %，酵母膏0.5%，蛋白胨0. 15%，玉米浆 0.5%，磷酸二氢钾0. 05%，硫酸镁0. 06%, pH5. 3,自来水配制；将平板培养的酿酒酵母菌种接种到上述摇瓶种子培养基中，500ml三角瓶装液量 100ml，31 °C培养30小时，摇床转速为200rpm ；3、种子罐种子培养种子罐种子培养基的组成为秸秆酶解糖液20% (含葡萄糖5% )，酵母膏0. 5%， 蛋白胨0. 05 %，玉米浆0.8%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0. 06 %，pH5. 7，自来水配制；将摇瓶培养的酿酒酵母菌种接种到上述种子罐种子培养基中，接种量为5% (ν/ v)，33°C培养30小时，搅拌转速为200rpm，通风比为1 0.5。4、发酵摇瓶培养发酵摇瓶培养基的组成为秸秆酶解糖液(含葡萄糖25-30%)30%,酵母膏0.2%， 玉米浆1%，磷酸二氢钾0. 05%，硫酸铵0. 05%，磷酸氢二铵0. 15%,pH5.8,自来水配制；将摇瓶菌种接种到上述发酵摇瓶培养基中培养，接种量为10% (v/v)，33°C培养 72小时，摇床转速为200rpm。5、发酵罐培养发酵罐中发酵培养基的组成为秸秆酶解糖液(含葡萄糖25-30% )30%，酵母膏 0.2%，玉米浆1%，磷酸氢二钾0. 05%，硫酸铵0. 05%，磷酸氢二铵0. 15%, pH5. 8，自来水配制；将摇瓶种子培养或种子罐中种子培养的菌种接种到上述发酵罐培养基中培养，接种量为10% (ν/ν)，33°C培养74小时，摇床转速为200rpm。
根据秸秆酶解糖液的体积选择培养基，将培养的酿酒酵母菌种接种到含有秸秆酶解糖液的发酵罐中培养，接种量为20% (ν/ν)，根据该菌株在生长、代谢的不同阶段对氧气及不同碳源需求量的差异，进行有氧、厌氧两段组合发酵技术，在发酵罐培养的第一阶段为有氧发酵阶段，无菌空气以通风比为1 0.6的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为300rpm，维持溶氧浓度(DO)为65 %，温度控制在30°C，好氧培养10小时；当细胞浓度即光密度(OD)达到18时，进入第二阶段厌氧发酵，搅拌转速为IOOrpm，温度控制在 32°C，当发酵液中的总糖浓度降至1.2%时，采用流加的方式添加秸秆酶解糖液，维持发酵液中的总糖浓度在3%左右，发酵55小时后停止流加，当残糖浓度降至0. 2%时发酵结束， 乙醇产率达到9.1%，糖醇转化率达到49. 8 %。实施例41、平板培养平板培养基的组成为秸秆酶解糖液(含葡萄糖3% ) 1. 0L，酵母膏0. 5%，蛋白胨 0. 5%，琼脂2%。将酿酒酵母菌种接种到该培养基中，32°C培养沈小时；2、摇瓶种子培养摇瓶种子培养基的组成为葡萄糖3 %，酵母膏0.5%，蛋白胨0. 15%，玉米浆 0.5%，磷酸二氢钾0. 05%，硫酸镁0. 06%, pH5. 3,自来水配制；将平板培养的酿酒酵母菌种接种到上述摇瓶种子培养基中，500ml三角瓶装液量 100ml，31 °C培养30小时，摇床转速为200rpm ；3、种子罐种子培养种子罐种子培养基的组成为秸秆酶解糖液20% (含葡萄糖5% )，酵母膏0. 5%， 蛋白胨0. 05 %，玉米浆0.8%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0. 06 %，pH5. 7，自来水配制；将摇瓶培养的酿酒酵母菌种接种到上述种子罐种子培养基中，接种量为5% (ν/ v)，33°C培养30小时，搅拌转速为200rpm，通风比为1 0.5。4、发酵摇瓶培养发酵摇瓶培养基的组成为秸秆酶解糖液(含葡萄糖25-30%)30%,酵母膏0.2%， 玉米浆1%，磷酸二氢钾0. 05%，硫酸铵0. 05%，磷酸氢二铵0. 15%,pH5.8,自来水配制；将摇瓶菌种接种到上述发酵摇瓶培养基中培养，接种量为10% (v/v)，33°C培养 72小时，摇床转速为200rpm。5、发酵罐培养发酵罐中发酵培养基的组成为秸秆酶解糖液(含葡萄糖25-30% )30%，酵母膏 0.2%，玉米浆1%，磷酸氢二钾0. 05%，硫酸铵0. 05%，磷酸氢二铵0. 15%, pH5. 8，自来水配制；将摇瓶种子培养或种子罐中种子培养的菌种接种到上述发酵罐培养基中培养，接种量为10% (ν/ν)，33°C培养74小时，摇床转速为200rpm。根据秸秆酶解糖液的体积选择培养基，将培养的酿酒酵母菌种接种到含有秸秆酶解糖液的发酵罐中培养，接种量为20% (ν/ν)，根据该菌株在生长、代谢的不同阶段对氧气及不同碳源需求量的差异，进行有氧、厌氧两段组合发酵技术，在发酵罐培养的第一阶段为有氧发酵阶段，无菌空气以通风比为1 0.6的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为300rpm，维持溶氧浓度(DO)为80 %，温度控制在31°C，好氧培养10小时；当细胞浓度即光密度(OD)达到18时，进入第二阶段厌氧发酵，搅拌转速为120rpm，温度控制在 33°C，当发酵液中的总糖浓度降至1.2%时，采用流加的方式添加秸秆酶解糖液，维持发酵液中的总糖含量在3%左右，发酵55小时后停止流加，当残糖浓度降至0. 时发酵结束， 乙醇产率达到8.9%，糖醇转化率达到48. 7 %。实施例51、平板培养平板培养基的组成为秸秆酶解糖液(含葡萄糖3% ) 1. 0L,占总重量的25%，酵母膏0. 5%，蛋白胨0. 5%，琼脂2% ；将酿酒酵母菌种接种到该培养基中，32°C培养28小时；2、摇瓶种子培养摇瓶种子培养基的组成为葡萄糖3 %，酵母膏0.5%，蛋白胨0. 15%，玉米浆 0.5%，磷酸二氢钾0. 05%，硫酸镁0. 06%,pH5. 0,自来水配制；将平板培养的酿酒酵母菌种接种到上述摇瓶种子培养基中，500ml三角瓶装液量 100ml，32°C培养29小时，摇床转速为200rpm ；3、种子罐种子培养种子罐种子培养基的组成为秸秆酶解糖液20% (含葡萄糖5% )，酵母膏0. 5%， 蛋白胨0. 05 %，玉米浆0.8%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0. 06 %，pH5. 5，自来水配制；将摇瓶培养的酿酒酵母菌种接种到上述种子罐种子培养基中，接种量为5% (ν/ v)，32°C培养28小时，搅拌转速为200rpm，通风比为1 0.3。4、发酵摇瓶培养发酵摇瓶培养基的组成为秸秆酶解糖液(含葡萄糖25-30%)30%,酵母膏0.2%， 玉米浆1%，磷酸二氢钾0. 05%，硫酸铵0. 05%，磷酸氢二铵0. 15%,pH5.6,自来水配制；将摇瓶菌种接种到上述发酵摇瓶培养基中培养，接种量为20% (v/v)，32°C培养 70小时，摇床转速为200rpm。5、发酵罐培养发酵罐中发酵培养基的组成为秸秆酶解糖液(含葡萄糖25-30% )30%，酵母膏 0.2%，玉米浆1%，磷酸氢二钾0. 05%，硫酸铵0. 05%，磷酸氢二铵0. 15%, pH5. 2，自来水配制；将摇瓶种子培养或种子罐中种子培养的菌种接种到上述发酵罐培养基中培养，接种量为15% (v/v)，31°C培养70小时，摇床转速为200rpm。根据秸秆酶解糖液的体积选择培养基，将培养的酿酒酵母菌种接种到含有秸秆酶解糖液的发酵罐中培养，接种量为20% (ν/ν)，根据该菌株在生长、代谢的不同阶段对氧气及不同碳源需求量的差异，进行有氧、厌氧两段组合发酵技术，在发酵罐培养的第一阶段为有氧发酵阶段，无菌空气以通风比为1 0.4的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为500rpm，维持溶氧浓度(DO)为75%，温度控制在30°C，好氧培养6小时；当细胞浓度即光密度(OD)达到16时，进入第二阶段厌氧发酵，搅拌转速为IOOrpm，温度控制在32°C， 当发酵液中的总糖浓度降至1. 0%时，采用流加的方式添加秸秆酶解糖液，维持发酵液中的总糖含量在2. 5%左右，发酵55小时后停止流加，残糖浓度降至0. 时发酵结束，乙醇产率达到9.0%,糖醇转化率达到49. 2% ο虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。


本发明提供了一种用秸秆类木质纤维素原料生产乙醇的方法，包括以下步骤将秸秆类木质纤维素原料酶解，制成的秸秆酶解糖液加入酿酒酵母进行低糖发酵，当发酵液中的总糖浓度降至0.8-1.2％时开始添加秸秆酶解糖液，维持发酵液中的总糖浓度在2-3％。本发明采用低糖发酵的方法制备，既有效减少了乙醇发酵的周期，提高了乙醇浓度，又解决了高浓度发酵下的底物抑制作用，提高了糖酒转化率，从而有效提高了秸秆类纤维素原料的综合利用率。