专利名称：一种采用耳石微化学研究日本鳗鲡迁徙行为的方法日本鳗鲡(Anguilla japonica)是一种洄游鱼类,广泛分布于台湾、中国大陆、韩国及日本等东亚国家水域，其产卵场已被证实位于与其育肥的淡水河流相距数千公里马里亚纳岛西方水域(14° N，142-143° E)。但目前其洄游习性、生长栖息地的位置等仍存在较多的空白。我国是世界第一产鳗大国，在近几年的世界鳗鲡养殖产量中(20万吨左右)，年产值逾百亿元，年出口创汇7-8亿美元，是我国出口创汇最多的农产品之一。长江口是我国 鳗苗的主产区和目前仅存的成鳗渔业水域，但目前自然水体中的鳗鲡成体和鳗苗资源日渐稀少，鳗鲡全人工繁殖虽然已被突破，但还停留在实验阶段，人工养殖的鳗苗至今仍完全仰赖天然采捕，天然鳗苗一直被称为水中的“软黄金”，因此，对日本鳗鲡进行年龄和洄游生活史的研究是非常必要的，对我国日本鳗鲡的养殖、繁殖和资源保护至关重要。鱼类共有3对耳石，位于内耳的听囊内。分别称之为微耳石、矢耳石以及星耳石。耳石长期被认为是一种时间记录器，因为耳石生长轮是以日和年的规律沉积的，耳石会随着鱼体生长速度的日周期及年周期的节律变化，分别出现日轮及年轮记号。同时，耳石还扮演着鱼类环境记录器的功能。耳石中的元素大约有31种左右。锶(Sr)是耳石中最富变化的元素，在化学周期表中与钙同属碱族元素，最容易取代耳石主要成份(碳酸钙)中的钙(Ca)，而沉积在耳石中。海水中的锶浓度是淡水环境中的100倍。因此，沿着耳石孵化中心至耳石边缘的Sr/Ca比的时间变化，便可以推测鱼类在海水与淡水之间的洄游履历。因此，对于体表无鳞片的日本鳗鲡，耳石是鉴定其年龄和洄游生活史的良好材料。而耳石中心至边缘Sr/Ca比值的准确测定是日本鳗鲡生活史研究的关键技术问题。质子扫描微探针技术(简称PIXE)，采用MeV的离子束轰击样品，与样品原子发生碰撞时，质子有一定几率会激发样品原子的内层电子，产生内层空穴。原子外壳层电子会填补空穴，发出特征X射线。用探测器探测X射线的能力和强度即可确定样品物质中所含元素的种类和含量。其能力和灵敏度较电子探针高1-2个量级，可达ppm量级，且具有快速、无损和多元素同时分析的优点。本方法首次将PIXE技术应用于日本鳗鲡耳石Sr/Ca比值测量，并通过比对耳石年轮标志，可快速确定日本鳗鲡从孵化至捕获的整个生活史阶段在海洋、淡水和河口的迁徙行为，并且耳石无损伤。
本发明所要解决的技术问题是提供一种日本鳗鲡耳石生活史横切面从核心至边缘Sr/Ca比值快速、精确测量的方法，该方法可有效的分析和确定日本鳗鲡生活史过程中的迁徙行为。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现—种采用耳石微化学研究日本鳗鲡迁徙行为的方法，包括如下步骤I)挖取取出日本鳗鲡的一对矢耳石，超声清洗掉耳石表面的薄膜和粘液，晾干；2)包埋取其一，凹面向上放入塑料耳石磨具，倒入冷埋树脂进行包埋，静放至硬化；3)制片将包埋有耳石的磨具，沿着耳石横轴方向从磨具上、 下两侧先后研磨至接近耳石核心；然后精磨成100-150微米厚的薄片，直至两侧核心和轮纹均清晰可见；最后将耳石磨片两面抛光；4)贴膜将制备好的耳石磨片超声洗净，晾干后贴在镀有铝的迈拉聚酯薄膜(mylar膜)上,放入真空祀室；5)耳石中心的定位用控制软件OMDAQ选取“面扫描”模式，采用PIXE方法对耳石磨片进行面扫描，得耳石磨片Ca元素分布轮廓图，比对耳石磨片，确定第一个年轮在耳石磨片Ca元素分布轮廓图上的位置，在该位置选取一个中间小区域再次进行“面扫描”，得到该区域Sr元素的分布轮廓图，根据耳石中心高Sr元素的原则，定位耳石磨片中心；6)生活史横切面扫描在Ca元素分布轮廓图上确定一条从耳石中心至耳石边缘的线，将OMDAQ软件调整为“线扫描”模式，沿该线扫描30-40分钟，得到耳石磨片中心至耳石磨片边缘的Sr和Ca元素含量；7)生活史分析比对耳石磨片中心至边缘各年轮中的Sr/Ca比值高低，确定该尾日本鳗鲡每一年在河口，淡水和海洋中的迁徙行为。由于探测器对Sr和Ca元素探测敏感度不同，测量得到的Sr和Ca元素含量存在误差，可用分析纯级的碳酸钙和碳酸锶作为标样，精确校正耳石中的Sr/Ca比值。本发明采用镀有铝的迈拉聚酯薄膜(mylar膜)作为耳石的本底吸收片，可有效降低Sr元素测量误差，将Sr:Ca比值的探测灵敏度提高90倍，解决了耳石中Sr元素含量低，探测费时较长这一问题。PIXE技术成熟，对分析样品无损伤，灵敏度达到ppm级可探测极其微量元素，且辐射剂量极低，操作安全。本发明具有如下有益效果和实质性特点本发明解决了耳石中Sr元素含量低，探测费时较长且误差大、日本鳗鲡耳石较大，分析整个耳石生活史横切面Sr/Ca比值费时长以及其耳石中心不在几何中心，难以精确定位，采取快速线扫描方式容易丢失生活史部分阶段信息等问题，提供了一个可精确定位耳石中心，探测灵敏，快速分析耳石生活史横切面Sr/Ca比值变化的方法，结合耳石年轮标志，有效分析日本鳗鲡在淡水、河口和海洋等栖息地的迁徙行为。图I为本发明日本鳗鲡耳石形态及包埋后研磨方向示意图。图2为本发明日本鳗鲡耳石横切面的磨片形态及年轮标志。图3为本发明PIXE分析日本鳗鲡耳石横切面的示意图，其中a为快速面扫描得到的Ca元素的分布轮廓；b为比对耳石磨片照片后，确认的耳石第一个年轮的大致位置；c为区域b快速扫描得到的Sr元素的分布轮廓图；d为高Sr元素含量的耳石中心；e为沿着耳石生活史横切面中心至耳石边缘元素扫描线位置。图4为本发明示例2尾雄性日本鳗鲡耳石磨片从中心至边缘Sr/Ca比值变化，其中1-4为年轮标志的位置。
标样校正由于探测器对Sr和Ca元素探测敏感度不同，测量得到的Sr和Ca元素含量存在误差，用分析纯级碳酸钙和碳酸锶作为标样，精确校正耳石中的Sr/Ca比值。生活史分析比对日本鳗鲡耳石横切面中心至边缘各年轮中的Sr/Ca比值高低，可以精确确定其每一年在河口，淡水和海洋中的迁徙行为。图4为2个雄性日本鳗鲡耳石横切面中心至边缘各年轮中的Sr/Ca比值。耳石中心为其海洋孵化和洄游开始阶段，海洋孵化场Sr/Ca比值很高，为20-28 X 10_3 ;洄游至河口区域Sr/Ca比值降低为8X10—3，而淡水栖息地Sr/Ca比值仅为4X 10_3。18号样本各年轮中的Sr/Ca比值4-8X 10_3之间频繁波动，表明在其生活史的几年中，在淡水和河口栖息地之间有频繁迁徙行为；而20号标本，各 年轮中的Sr/Ca比值一直在4X 10_3附近，表明其一直栖息在淡水栖息地，没有发生迁徙。以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范 围。


本发明公开了采用耳石微化学研究日本鳗鲡迁徙行为的方法，采用质子扫描微探针技术分析日本鳗鲡耳石生活史横切面的微化学组成，从而确定日本鳗鲡迁徙行为，包括耳石挖取、包埋、制片、贴膜、耳石中心定位、生活史横切面扫描、标样校正和生活史分析。本发明解决了耳石中Sr元素含量低，探测时间较长、误差大以及日本鳗鲡耳石磨片中心不在几何中心，难以精确定位，采取快速线扫描方式容易丢失生活史部分阶段信息等问题，提供了一个可精确定位耳石中心，探测灵敏，快速分析耳石生活史横切面Sr/Ca比值变化的方法，结合耳石年轮标志，有效分析日本鳗鲡在淡水、河口和海洋等栖息地的迁徙行为。