专利名称：一种pH敏感型黄芩苷眼用在体凝胶制剂的制作方法传统眼部给药方式 常采用滴眼液的形式，但滴眼液存在滞留时间短、生物利用度低等问题，在人体内药物与角膜的接触时间大约仅有l_2min，眼部生物利用度一般少于10%。因此，眼用液体制剂的先天不足，促使人们探索开发滞留时间长，兼有缓控释能力的眼部固体给药系统。环境敏感凝胶药物给药系统是随着药用高分子材料科学的迅猛发展而诞生的新型剂型，提高了患者的顺应性。环境敏感凝胶是指以溶液状态给药后立即在用药部位发生相转变，形成的非化学交联的半固体制剂。其中，PH敏感型眼用凝胶在非生理状态下为自由流动的液体，给药后在眼部PH值下形成凝胶，延长药物在眼内的滞留时间以提高生物利用度。本制剂采用黄芩苷为活性药物，其是由唇形科植物黄芩的干燥根中提取的ー种黄酮类化合物。研究表明，黄芩苷对临床眼科常见病原菌，如金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色葡萄球菌，枯草杆菌等均有很强的抑菌杀菌作用，其对结膜炎，角膜炎的治疗作用已得到肯定(专利公开号CN1943596);另据报道，采用硒性白内障及体外晶状体氧化损伤模型研究黄芩苷对这两类晶状体抗氧化体系的影响，研究结果显示，对形成白内障的大鼠给予黄芩苷后，其超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶活力(GSH-Px)升高，可溶性蛋白含量上升，丙ニ醛的含量下降，从而表明了黄芩苷可以清除自由基，增强GSH-Px，SOD活力，提高它们的抗氧化能力，因此黄芩苷还具有治疗白内障的作用[专利公开号CN 1515288，參考文献I.张永钦，黄芩甙对白内障晶状体作用的研究[J]，眼科研究，1998，16⑶；2.刘新文，黄芩黄酮对硒性白内障晶状体抗氧化酶表达的影响[J]，中国生物化学与分子生物学报，2002，18 (4)]。但是，黄芩苷几乎不溶于水，脂溶性也差，并且其稳定性与pH密切相关。由于黄芩苷苷元母核在碱性溶液(PH > 7)中迅速开环形成查儿酮，在2h已降解10%以上。因此在碱性条件下不稳定(參考文献1.于波涛，黄芩苷稳定性研究[J]，中草药，2002，33 (3)，;王雷，黄芩苷在不同溶媒中的稳定性研究[J]，中国药师，2006,9 (2))。目前国内上市的黄芩苷眼用产品主要是滴眼液，其pH值一般在7-8。由于滴眼液这ー剂型本身存在的缺点及黄芩苷本身在不同PH值下的理化性质，使得滴入眼部的黄芩苷大部分流失，生物利用度较低。因此本发明选用黄芩苷作为制剂活性成分，将其做成pH敏感型黄岑苷眼用在体凝胶剂(Baicalin-containing in situ pH-triggeredgellingsystem for sustained ophthalmic drug delivery),不但提高了活性成分黄岑苷的稳定性，而且有望得到角膜滲透能力强并具有缓释作用的新型制剂，从而提高黄芩苷的治疗效果。
本发明提供ー种pH敏感型黄芩苷眼用在体凝胶制剂及其制备方法和用途。本发明的眼用凝胶制剂为淡黄色，在体外为液体，滴入眼内成为凝胶，凝胶黏度随外界应カ的增加而降低。它以黄芩苷为活性成分，辅以PH敏感材料、增稠剂、等渗调节剂、防腐剤、缓冲液等制成眼用凝胶制剂，并精确控制处方的PH值，不仅能实现pH敏感型眼用剂型的正常转换，还保证了黄芩苷的活性和溶解性，很好地解决了现有技术中存在的黄芩苷滴眼液的问题。具体地，本发明包括以下几个方面本发明的ー个方面涉及ー种pH敏感型眼用在体凝胶制剂，其包含下列组分组分重量份黄芩苷O. 05-10 ； pH 敏感材料0.1-3;增稠剂0.1-10;等渗调节剂0.1-10;防腐剂0.001-3;PH5-6.2 的缓冲液 80-100。pH敏感材料用于调节凝胶基质在人体生理条件和非生理条件下，液态和半固体凝胶态之间的转变，可增大药物生物利用度，并提高病人顺应性。其中所述PH敏感材料包括但不限于丙烯酸聚合物、醋酸纤维素酞酸酯(CAP)和壳聚糖中的至少ー种，在本发明的一个实施方案中，所述pH敏感材料为丙烯酸聚合物，具体为卡波姆(CarbopoI ),例如为Carbopol 974P NF、Carbopol 98ONF或Carbopol 934P nf。增稠剂用于调节凝胶基质的粘度，依据药物释放程度和病人顺应性调节用量。所述增稠剂的成份和含量为本领域的常规选择，其包括但不限于羟丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素、こ基纤维素、聚维酮和聚こ烯醇中的ー种或数种，其中HPMC可以为E4M、E10M、F4M或K4M，在本发明的一个实施方案中，为HPMC E4M、HPMC F4M或HPMC K4M。所述等渗调节剂的成份和含量为本领域的常规选择，其包括但不限于氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨醇或丙ニ醇中的ー种或数种，在本发明的一个实施方案中，所述等渗调节剂为氯化钠。所述防腐剂的成份和含量为本领域的常规选择，其包括但不限于苯甲醇、三氯叔丁醇、硫柳汞、洗必泰、苯扎氯铵、苯扎溴铵、尼泊金甲、こ、丙酯中的ー种或数种，在本发明的一个实施方案中，所述防腐剂为苯扎溴铵。所述缓冲液的成份和含量为本领域的常规选择，其包括但不限于pH5-6. 2的磷酸盐缓冲液、枸櫞酸盐缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液中的ー种或数种。在本发明中，所述磷酸盐缓冲液可以是PBS缓冲液，或者是由磷酸氢ニ钠和磷酸ニ氢钠组成的缓冲液。在本发明的实施方案中，所述缓冲液为PH5-6. 2的PBS缓冲液。在本发明的ー个实施方案中，所述缓冲液的PH值为5. 8或6. O。根据缓冲液在眼用制剂中的作用以及其所占的重量份，可以认为本发明所述眼用制剂的PH值为5-6. 2。优选地，本发明的眼用在体凝胶制剂，其包含下列组分(按重量份计)0· 05-10份黄芩苷、0.1-3 份CarbopoI 、O.ト ο 份 hpmc e4m、hpmc F4M 或 hpmc κ4μ、ο·ト 10 份氯化钠、O. 001-3份苯扎溴铵和80-100份PH5-9的磷酸盐缓冲液。更优选地，本发明的眼用在体凝胶制剂，其包含下列组分(按重量份计)O. 05-1. 5份黄芩苷、O. 2-2份CarbopoI 、0· 3-3份HPMC E4M、HPMC F4M或HPMC Κ4Μ、0· 9-1份氯化钠、O. 001-0. I份苯扎溴铵和90-100份ρΗ5· 8-6. O的磷酸盐缓冲液。在本发明的一个实施方案中，其由下列组分(按重量份计)组成O. I份黄芩苷、O. 3份CarbopoI 、O. 6份HPMC Ε4Μ、0· 9份氯化钠、O. 001份苯扎溴铵和94份ρΗ5· 8的磷酸盐缓冲液。在本发明的另ー个实施方案中，其由下列组分(按重量份计)组成O. I份黄芩苷、O. 3份CarbopoI 、O. 6份HPMC F4M、0· 9份氯化钠、O. OOl份苯扎溴铵和94份ρΗ5· 8的磷酸盐缓冲液。在本发明的另ー个实施方案中，其由下列组分(按重量份计)组成O. I份黄芩 苷、O. 3份Carbopol 、0.6份hpmc Κ4Μ、ο· 9份氯化钠、O. OOl份苯扎溴铵和94份ρΗ5· 8的磷酸盐缓冲液。本发明的另一方面涉及所述的眼用在体凝胶制剂的制备方法，其包括以下步骤(I)制备基质按照上述各重量份，取pH敏感材料和增稠剂，在不断搅拌下加入适量缓冲液中，搅拌均匀，即得基质；(2)制备药物溶液按照上述各重量份，取黄芩苷、等渗调节剂和防腐剤，逐渐加入缓冲液中，混合均匀，即得药物溶液；(3)混合将⑵步制得的药物溶液在不断搅拌下加入⑴步制得的基质中，搅拌均匀，溶液通过微孔滤膜过滤，再从滤器上加缓冲液至总量。本发明的另一方面涉及所述的眼用在体凝胶制剂在制备预防和/或治疗结膜炎和/或角膜炎的药物中的用途。本发明的另一方面涉及所述的眼用在体凝胶制剂在制备预防和/或治疗白内障的药物中的用途。其中所述白内障优选为早期白内障。发明的有益效果本发明提供了ー种pH敏感型黄芩苷眼用在体凝胶制剂，该制剂组成合理，在体外(pH值约为5-6. 2)为液体，滴入眼内(pH值约为6. 8)成为凝胶，凝胶粘度随外界应カ的增加而降低。本发明的眼用制剂具有以下优势I)本发明的pH敏感型眼用在体凝胶制剂在解决不同pH条件下剂型正常转换的同时，能够很好地保留黄芩苷的活性和溶解性，解决了现有技术中黄芩苷滴眼液生物利用度低，以及在不同PH值条件下，特别是在碱性条件下稳定性差、容易失去活性的问题；2)在体凝胶制剂的应用可以增加黄芩苷的角膜滲透能力，因而增加了有效药物浓度，极大的提高了黄芩苷的生物利用度；3)在体凝胶制剂的应用可以增加黄芩苷在角膜的附着时间，起到缓释的作用，有效的解决了单独黄芩苷滴眼液存在的代谢过快，不能较长时间保留的问题。图I本发明的眼用在体凝胶剂在pH5. 8和pH6. 8条件下的凝胶显微结构。
其中A为凝胶溶液在pH5. 8时的结构，B为凝胶溶液滴加蒸馏水后呈现的结构，C为凝胶溶液的PH调节至6. 8时的结构。图2本发明的眼用在体凝胶剂的基质粘度的pH变化范围图3本发明的眼用在体凝胶剂在ρΗ5· 8 (非生理条件)和ρΗ6· 8 (生理条件)下的
流变学实验結果。图4黄芩苷滴眼液与pH敏感型在体凝胶的体外消除试验結果。其中A为黄芩苷滴眼液，B为pH敏感型在体凝胶；其中ROI O :位置參比，ROI I 角膜表面，ROI 2:鼻泪管，ROI 3:咽部。图5黄芩苷滴眼液与pH敏感型在体凝胶Y -闪烁照相图片。其中左侧三幅为黄芩苷滴眼液，右侧三幅为pH敏感型在体凝胶；在IOmin内共采集63帧动态图像，其中A为前期图像，B为中期图像，C为末期图像。图6黄芩苷滴眼液和pH敏感型眼用在体凝胶剂的房水药物动力学曲线。其中横坐标为时间(t/h)，单位为h(小吋)，纵坐标为药物浓度(C)，单位为μ g · mL 1 ο

浓度0/o(w/v)
介质Oh 0.5h l.Oh 2.0h 4.0h 6.0h 8.0h IOh
H20 100.0±0.0 100.2±0.2 100.2±0.3 100.1±0.2 100.0±0.3 99.8±0.2 100.1±0.1 99.6±0.2pH 5.8 PBS 100.0士0.0 100.5±0.1 100.1 士0.2 100.2±0.2 99.9士0.2 100.0土0.1 99.8±0.2 99.8±0.1_pH 6.0 PBS lOO.OiO.O 99.9土0.2 100.0±0.3 100.1±0.2 99.6±0.2 99.2±0.3 98.9±0.3 98.0±0·3_ρΗ 6.2 PBS 100.0士0.0 100.0±0.3 99.8±0.2 99.8±0.4 99.4±0.2 99.0士0.3 98.5±0.3 96.3±0.3_pH 6.4 PBS 100.0士0.0 99.8±0.1 99.7±0.4 99.7±0.3 99.2±0.3 98.6士0.2 97.1±0.4 94.1±0·5pH 6.6 PBS 100.0士0.0 99.8±0.2 99.8±0.5 99.4±0.3 99.2±0.4 97.7士0.4 95.9±0.7 93.5±0.7_pH 6.8 PBS lOO.OiO.O 99.2土0.4 98.5±0.4 96.2土0.4 93.3±0.3 92.2±0.5 88.5±0.9 85.3±1.1pH7.0PBS」100.0±0.0|96.5±0.5 I 91.5±0.6 l_89.1±0.6 _^82.9±1.0 丄78.0士 1.6 l_ 72.3±2.4 | 65.7±3.3
由表I可知,黄岑苷在pH5. 8,6. O和6. 2时的稳定性较好，当pH大于6. 6时,稳定性迅速下降。实施例10激光共聚焦显微镜考察凝胶显微结构为了考察本发明药物pH敏感型黄芩苷眼用在体凝胶剂在pH5. 8和pH6. 8条件下微观结构的变化，发明人将荧光探针FITC标记于实例I所制备的凝胶上，取O. 01% FITC水溶液与凝胶涡旋混合，在激光共聚焦显微镜下考察其微观结构。微观结构见图I。图IA中，凝胶溶液在pH5. 8时呈ー线性聚合物，图IB为药物滴加约O. 5mL蒸馏水后呈现的结构，线性结构并未改变，仅被少许稀释；而图IC为滴加2M氢氧化钠调节pH至6. 8，可明显看到pH值升高后，其微观结构线性结构相互联结而形成团状凝胶网络。结果表明，随着PH的变化凝胶微观结构发生了明显的改变，在非生理偏酸性条件下，卡波姆(Carbopol )呈线性结构，骨架中含有大量的可解离基团，生理条件下，荷负电羧基间的静电排斥使Carbopol 分子链伸展，増加了生成氢键的可能性，因而形成团状结构，具有更适宜的凝胶强度。 实施例11凝胶基质粘度的pH变化范围为了判定凝胶基质的在不同pH值下粘度的变化，从而确定凝胶液态-固态间的pH转化点，发明人对不同pH下的凝胶粘度作出比较。方法如下固定凝胶基质处方，在适宜的pH范围内，采用实施例I处方，固定处方基质，分别将基质调节pH至 5. 0,5. 8,6. 0,6. 2、6· 5 和 7. 0，然后采用 Brookfield流变仪(DV-IIIjUSA)分别测定粘度，将所得粘度对PH值作图，得凝胶粘度对pH的变化曲线(见图2)。结果表明，凝胶基质的粘度变化拐点在pH5. 8-6. O之间，pH > 6. 2后粘度迅速上升，由此可说明非生理条件下，PH5. 8的凝胶基质处于液体状态，当趋近于生理条件时，可逐渐形成胶体状态。实施例12流变学试验为了说明本发明药物的释放情况，发明人还进行了流变学研究，其方法如下取本发明实施例I所制得的样品药物制剂，并将溶液用0. 5M氢氧化钠溶液分别调pH值至pH6. 8±0. I。上述溶液在非生理条件(pH5. 8±0. 1，25°C)，生理条件(pH6. 8±0. 1，350C )下，采用Brookfield流变仪(DV-III，USA)进行流变学考察。样品在测试前要在水浴中平衡5分钟，将所测样品放入与流变仪配套的适配器中，选择适宜转子，调节剪切速率为O 25S—1，加速度为0. lS_Vmin。流变学曲线见图3。结果表明非生理条件与生理条件下的聚合物皆随剪切速率的降低，表现为假塑性流体性质。HPMC在生理条件下粘度低于非生理条件，原因是由于HPMC粘度并不受pH值影响，调节pH值过程当中被稀释；Carbopol 在非生理条件下粘度为2. 02mPa. s,具有牛顿流体性质，调节PH值至6. 8后呈现加速性流体性质，并且粘度増大；空白基质和载药在体凝胶在非生理条件与生理条件下，粘度发生明显改变，PH为6. 8时发生相转变，说明在体凝胶为PH依赖型凝胶。载药后凝胶粘度略微提高，更加有助于凝胶在角膜处的粘附能力。说明加入卡波姆后，尤其增加了在生理条件下，药物在角膜处的粘附能力。实施例13角膜滞留时间试验为了考察药物在体内的缓释效果，发明人对凝胶的在体角膜滞留时间进行了研究。将99mTc-DTPA均匀混合于黄芩苷滴眼液和pH敏感型在体凝胶中。给药时，所有制剂的放射活性介于2. IMBq/lOO μ L 2. 7MBq/100 μ L剂量之间。将家兔用兔夹板固定，使其保持清醒状态卧于SPECT系统(Toshiba GCA 602A, Japan)的监测器前，低能高分辨率探头距离兔眼5cm。待测的放射性标记溶液于室温放置30min，然后滴加100 μ L至左眼角膜表面12点钟位置。SPECT系统自动调节至140KeV测定99mTc的放射线，给药5S后开始连续动态采集。采用128X128像素矩阵，IOmin内先后以36 X 5S再12 X IOS最后15X20S的顺序采集63帧动态图像。 根据99mTc-DTPA放射性活度在IOmin内的变化趋势进行讨论，结果如图4。全部图像均划分出4个感兴趣区域(ROI)，分别为ROI O位置參比，ROI I角膜表面，ROI 2鼻泪管和ROI 3咽部，放射性标记物的移动准确地落在这些区域内。自动校正衰变后，将角膜表面区域的残留放射活性对时间作图以评价消除动力学參数自动校正衰变后，将角膜表面区域的残留放射活性对时间作图以评价消除动力学。由图4可知黄芩苷滴眼液组(A) IOmin内角膜区域的放射活度一直呈现衰减趋势，鼻泪管和咽部中的放射活度也快速由上升转为下降趋势，提示药物以滴眼液的形式给药后，迅速经内眼角消除到达鼻泪管和咽部，未在角膜前区域滞留；pH敏感型在体凝胶组(B)放射活度在角膜区域IOmin内没有明显的衰减，鼻泪管和咽部中的放射活度由低至高，維持平台期，说明药物大部分滞留于角膜表面区域，并且呈缓慢释放趋势。再根据药物在IOmin内兔眼在体的动态流动位置进行讨论，SPECT系统在IOmin共采集63帧动态图像，选取实验的前、中、末期Y -闪烁照相图片，将黄芩苷滴眼液与pH敏感型在体凝胶的结果进行对比，结果见图4。由图5结果可知，黄芩苷滴眼液在兔眼内流动较快，实验中期制剂溶液沿鼻泪管转移，实验末期时已明显看出溶液到达咽部，并通过咽部毛细血管扩散；而凝胶制剂则较溶液转移缓慢，中期和末期都未见明显的扩散趋势。说明PH敏感型在体凝胶角膜粘附性良好，有效的解决了单独黄芩苷滴眼液存在的代谢过快，不能较长时间保留的问题，起到了缓释的作用。实施例14动物药代动力学试验-在体微渗析技术为了解药物在眼内动态变化的规律及特点，给临床合理用药提供參考，发明人还对本发明药物PH敏感型黄芩苷眼用在体凝胶剂(实施例I制备的样品)进行了临床前动物药代动力学研究，方法和结果如下实验前，以3只家兔为实验动物，采用微渗析技术进行眼内药代动力学的研究。手术前3天向家兔眼内滴入氧氟沙星滴眼液，以消除眼部炎症。手术前O. 5和4h，家兔耳缘静脉注射100U · kg-1肝素钠，以防止由于炎症反应引起前房内纤维生成手术时。结膜下注射利多卡因注射液进行局部麻酔，将其固定于兔盒中，用开睑器撑开眼睑，开始手木。用针头在眼角部位角膜缘处做贯通性穿刺，将微渗析探针由针孔导出，抽去针头，调整探针的位置使渗析窗恰好全部浸入房水中，探针两端分别在鼻颖侧和外眼角固定。创ロ处滴入氧氟沙星眼药水防止感染。经过2天恢复期，待创ロ完全愈合后开始体内药代动力学实验。以生理盐水为灌注液，流速设定为3. 0μ L · HIirT1，冲洗O. 5h后，在结膜囊内滴入IOOyL黄芩苷滴眼液(黄芩苷pH5. 8磷酸缓冲盐溶液，对照组)及黄芩苷pH敏感型眼用在体凝胶，同时开始收集样品，在最初的Ih内每IOmin收集样品，然后每20min收集样品，所有样品立即进行HPLC測定。
房水药物浓度測定结果表2和表3，两组溶液的房水药物动力学曲线见图6。表2黄芩苷滴眼液给药后房水药物浓度測定(η = 3)


本发明涉及一种pH敏感型黄芩苷眼用在体凝胶制剂，其包含下列组分(按重量份计)，0.05-10份黄芩苷，0.1-3份pH敏感材料，0.1-10份增稠剂，0.1-10份等渗调节剂，0.001-3份防腐剂和80-100份pH5-6.2的缓冲液。本发明还涉及所述pH敏感型黄芩苷眼用在体凝胶制剂的制备方法，以及其在制备预防和/或治疗结膜炎、角膜炎或白内障的药物中的用途。