一种从条纹拟海牛中提取的抑制肿瘤新生血管生成的化合物制作方法

易杨华, 许强芝, 吴厚铭, 孙金华, 丁健, 童云广

2002年4月3日

2001年9月17日

2001年9月17日

中国人民解放军第二军医大学, 中国科学院上海有机化学研究所, 中国科学院上海药物研究所

A61P35/00GK1342657SQ0112678

海牛 条纹 肿瘤 提取 抑制

1.一种从条纹拟海牛中提取的抑制肿瘤新血管生成的化合物，其特征在于具有如下化学结构 命名为Philinopside A2.一种从条纹拟海牛中提取化合物PhilinopsideA的方法，其具体步骤如下(1)提取将原料条纹拟海牛(干品)浸泡于2.5-4倍重量的60-90％乙醇中，提取30小时以上，重复提取2-4次，合并提取液，减压回收乙醇，浸膏混悬于30％乙醇中，以乙醚萃取3-5次，乙醚萃取液弃去；下层乙醇液减压回收，得浸膏；浸膏溶于蒸馏水中，通过大孔树脂柱，用水、50％乙醇和95％乙醇依次洗脱，95％洗脱液减压回收得浸膏；(2)分离上述浸膏采用硅胶柱层析，以CH2CL2∶CH3OH∶H2O＝(6-10)∶(1.5-3)∶1的混合溶剂洗脱，收集含PhilinopsideA部分，再经Sephadex HL-20柱层析，以CH2CL2CH3OH＝(0.8-1.5)∶1混合溶剂洗脱，含PhilinopsideA部分再经C18反相层析，以含水甲醇作洗脱剂，得纯品3.一种如权利要求1所述的化合物Philinopside A的用途，其特征在于用于制备抗癌药物

本发明涉及医药技术领域，具体是一种从海洋动物条纹拟海牛中分离得到的抑制肿瘤新生血管生成的化合物PhilinopsideA本发明从条纹拟海牛中提取分离的新化合物，其化学结构式如下 由于该化合物首次从条纹拟海牛中提取获得，故命名为PhilinopsideAPhilinopsideA的理化性状如下白色无定形粉末，熔点222-225(分解)，分子式C55O22H85SO3Na电喷雾离子质谱1224[M+Na+H]，1062[1224-glc]红外光谱3419(OH)，2932(CH3，CH3)，1747(C＝O)，1456和1375(CH3，CH2)，1233(酯键)，1039(C-O-C)1H和13C核磁共振数据见表1表1.PhilinopsideA的1H和13C核磁共振数据δc δH HMBC13C1H HMBC甙元部分136.2 1.42m，1.42m糖部分xy1 1 105.7 4.80d，J＝7.0 C3227.3 2.04m，1.87m 2 83.84.11m389.3 3.34dd，J＝3，11 C1xy1 3 76.44.09m439.8 4 75.35.19m(SO3Na)548.2 1.1.t，J＝7.6 5 64.5 419m，4.86dd，J＝4，12623.5 2.05mQui 1 105.3 5.14d，J＝7.6 C2xy17120.5 5.74m 2 75.64.03m8145.63 75.84.35m947.3 3.56br.d，J＝14.2 4 86.13.69t，J＝910 35.7 5 71.94.09m11 22.8 21.7m 6 18.01.82d，J＝6.212 31.6 2.06m，2.24m xy1 1 105.64.93d，J＝7.6 C4Gui13 59.5 2 73.93.80m14 47.6 3 87.24.27m15 43.9 1.86m，2.67m C13，21 4 69.04.22m16 75.1 6.04m 5 66.74.37m，3.75m17 54.9 2.7d，J＝9.3 g1c 1 105.3 5.46d，J＝7.9 C3xy118 179.62 75.24.32m19 24.2 131s C9，103 88.13.78m20 85.2 4 70.74.11m21 28.5 1.67s C17，20，22 5 78.34.08m22 47.7 2.53m 6 62.13.83m，4.55dd，J＝2.1，1. 4，23 38.6 1.98m OCH354.73.88s24 124.4 5.19m25 132.126 21.5 2.08s27 22 4 2.12s30 17.5 1.23s C3，4，5，3131 28.9 1.13s C3，4，5，3032 32.4 1.05s C8，13，14，15Ac169.9，21.5 1.96sxy1木糖，Qui喹喏糖，glc葡萄糖，J值Hz，HMBC碳氢远程相关同时，通过测定二维氢氢相关谱(DQCOSY)和碳氢相关谱(HMQC)和接力谱(TOCSY)确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构通过测定NOE相关谱，确定了该化合物的立体构型如下 Philinopside A的立体构型和部分NOE相关本发明还提供了从条纹拟海牛中提取PhilinopsideA的方法，其步骤如下(1)提取将原料条纹拟海牛(干品)浸泡于2.5-4倍重量的60-90％乙醇中，提取30小时以上，重复提取2-4次，合并提取液，减压回收乙醇，浸膏混悬于30％乙醇中，以乙醚萃取3-5次，乙醚萃取液弃去；下层乙醇液减压回收，得浸膏；浸膏溶于蒸馏水中，通过大孔树脂柱，用水、50％乙醇和95％乙醇依次洗脱，95％洗脱液减压回收得浸膏；(2)分离上述浸膏采用硅胶柱层析，以CH2CL2∶CH3OH∶H2O＝(6-10)∶(1.5-3)∶1的混合溶剂洗脱，收集含PhilinopsideA部分，再经Sephadex HL-20柱层析，以CH2CL2∶CH3OH＝(0.8-1.5)∶1混合溶剂洗脱，含PhilinopsideA部分再经C18反相层析，以含水甲醇作洗脱剂，得纯品本发明对PhilinopsideA进行了抑制肿瘤新生血管生成、体外抗肿瘤等实验，表明其具有明显的抑瘤、抗瘤效果一、抑制肿瘤新生血管生成及受体酪氨酸激酶实验材料和方法DMEM购自Gibco公司(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)；matrigel购自Becton Dichinson，USA；抗酪氨酸磷酸化单克隆抗体PY-99，VEGFR-2多抗，PDGFR-β多抗购自Santa Cruz；羊抗鼠生物素标记IgG(H+L)，Horseradish-Peroxidase-Streptavidin聚合物购自Vector公司；多聚赖氨酸，刺激因子VEGF，PDGF-BB购自Sigma；HRP-羊抗鼠二抗购自Calbiochem；其它试剂为国产分析纯细胞培养人微血管内皮细胞株(human microvascular endothelial cell line，HMEC-1)；NIH-3T3购自American Type Culture Collection；VEGFR-2稳定高表达的3T3细胞株由质粒转染得到细胞培养于含15％胎牛血清的DMEM培养基中，于5％CO2孵箱中培养待细胞处于对数生长期时进行实验1.内皮细胞增殖实验HMEC-1细胞2*103cells/100μl/孔种于96孔板，24小时待细胞贴壁后，加入不同浓度的A2，每个浓度三个复孔，并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔加药在37℃、5％CO2条件下培养72小时后，倾去培养液，用10％冷TCA固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥然后加入由1％冰醋酸配制的SRB(Sigma)4mg/ml溶液100μ1/孔，室温中染色15分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥最后加入150μl/孔的Tris溶液，酶标仪540nm波长下读数2.内皮细胞管腔形成抑制实验Matrigel胶在0℃融化后，迅速加入到96孔板中(60μl/孔)，在37℃静置1小时，使胶凝固每孔加入HMEC-1细胞悬液5*103cells/100μl/孔同时分别加入不同浓度A2，使其最终浓度为5μM，1μM，0.2μM，0.04 μM在37℃、5％CO2、95％湿度下培养24小时在倒置显微镜下观察，随机选三个视野拍照(*100)，每个照片的管腔总长度用图形处理软件Adobe Photoshop测量，并计算抑制率3.内皮细胞迁移抑制实验1∶3倍稀释的Matrigel胶20μl铺于Transwell膜(8μm孔径Boyden Chamber transwell，Costar，Cambrige，MA)上，25℃让其干燥将含不同药物浓度(5μM，1μM，0.2μM，0.04μM)的HMEC-1细胞悬液2*104cells/100μl/孔加入到上室，下室加入0.6ml同上室含相同浓度药物的DMEM培养基37℃、5％CO2、95％湿度下培养48小时用棉签小心去除膜上未迁移的细胞，将细胞固定，伊红染色在相差显微镜(Olympus Japan)下观察并拍照(*100)，随机选3个视野计算迁移细胞数，并计算抑制率4.受体酪氨酸激酶自磷酸化抑制实验(A)把高表达VEGFR-2的细胞约2*104cells/100μl(20％FBS/DMEM)种于96孔用0.1％多聚赖氨酸包被的培养板中，待其长满，换无血清培养夜，饥饿24小时加入不同浓度的化合物，作用1h，用500ng/ml的VEGF刺激5-10分钟，倒去培液，用4％的多聚甲醛常温下固定30分钟然后依次用50％、75％、100％的乙醇溶液洗涤细胞脱水，常温下干燥用含5％BSA的T-PBS(0.2％Tween-20)封闭96孔板，依次加入抗酪氨酸磷酸化抗体PY-99，羊抗鼠生物素标记IgG(H+L)，三抗Horseradish-Peroxidase-Streptavidin，37℃各1小时，分别用T-PBS洗涤三次最后加入底物ABTS，37℃孵育1小时，酶标仪405nm读数用150ng/ml PDGF-BB刺激NIH-3T3细胞，PDGFR的受体磷酸化水平检测通过同样方法进行(B)表达VEGFR-2的细胞约2*104cells/100μl(20％FBS/DMEM)种于96孔培养中，待其长满，换无血清培养夜，饥饿24小时加入不同浓度的化合物，作用1h，用500ng/ml的VEGF刺激5-10分钟，加入100μl裂解液HNTG[20mM HEPES(PH 7.5)，150mM NaCl，0.2％TritonX-100，and 10％glycerol]和5mM Na3VO4，2mM Na4P2O7，5mM EDTA裂解细胞，转移到用VEGFR-2多抗包被过的酶标板中，37℃孵育2小时0.2％的Tween-20PBS洗涤三次依次加入抗酪氨酸磷酸化抗体PY-99，HRP偶联的羊抗鼠二抗，分别用T-PBS洗涤三次最后加入底物0.5mg/ml用0.1％H2O2，100mM柠檬酸，250mM Na2HPO4配置的OPD，37℃孵育30分钟，酶标仪490nm读数用150ng/ml PDGF-BB刺激NIH-3T3细胞，PDGFR的受体磷酸化水平检测通过同样方法进行上述实验结果表明，PhilinopsideA具以下显著活性1.能明显抑制内皮细胞HMEC-1的增殖，其平均IC50为1.60±0.48μM(n＝2)，作用效果成明显量效关系2.能明显抑制内皮细胞的管腔形成，其IC50为0.058±0.018μM(n＝2)，作用效果成明显量效关系3.能明显抑制内皮细胞的迁移其IC50为0.046μM，作用效果成明显量效关系4.对两个与血管生成密切相关的酪氨酸激酶受体VEGFR-2，PDGFR-β的酪氨酸激酶活性有明显的抑制作用，用方法A测得A2对VEGFR-2的IC50为2.6+0.1μM(n＝2)；对PDGFR的IC50为4.9+0.3μM(n＝2)二、体外抗肿瘤实验材料和方法DMEM购自Gibco公司(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)；磺酰罗单明B(sulforodamine B，SRB)，四氮唑盐(MTT)购自Sigma公司；三氯醋酸(TCA)和Tris base unbuffer均为国产分析纯细胞株P-388小鼠淋巴瘤 HL-60人白血病MOL-4人白血病A-549人肺癌SPCA4人肺腺癌SGC-7901人胃癌MKN-28人胃癌 HCT-116人结肠腺癌BEL-7402人肝癌 MCF-7人乳腺癌HO-8910人卵巢癌1.SRB法根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以90μl/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24小时再加药10μl/孔每个浓度设三复孔并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养72小时，然后倾去培养液，用10％冷TCA固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气干燥最后加入150μl/孔的Tris溶液，酶标议520nm波长下测定OD值2.MTT法按不同肿瘤生成速率，将一定数量处于对数生长期的肿瘤细胞90μl/孔接种于96孔培养板内，培养24小时后加入药液10μl/孔，对每个细胞株，每个浓度均为三个复孔肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养48小时后，加MTT(Sigma)液5mg/ml用生理盐水配制20μl/孔；继续培养4小时后，加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/LHCL)50μl/孔，于CO2培养箱中过夜然后在570nm用酶标仪测定OD值3.按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率，半数抑制量IC50值采用Logit法计算 表2 Philinopside A对肿瘤细胞的抑制作用浓度(μM) IC50μM细胞株 P-388 MOL-4 HL-60 A-549 MKN-28 SPC-A4 SGC-7901 HCT-116 BEL-7402 MCF-7 HO-8910A2 0.9±0.1 0.4+0.2 0.6±0.3 1.2+0.1 1.8±1 1.5±0.7 1.4±0.8 1.6±0.4 2.4+0.1 2.3+0.2 2.3±0.5试验结果表明Philinopside A能明显抑制11株来源肿瘤细胞的增值，且作用效果成明显的量效关系上述试验结果表明PhilinopsideA可作为一种研制新的抗癌药物的先导化合物，可用于制备抗癌药物对该PhilinopsideA进行抑制肿瘤新生血管生成及受体酪氨激酶试验和体外抗肿瘤试验，都获得较为满意的效果，具体过程和结果见前所述