血清dkk1在制备肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病鉴别诊断试剂中的用途[0002]肝脏原发性肿瘤包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、肝内胆管癌、混合性肝细胞癌、胆管囊腺瘤、肝母细胞瘤、血管瘤、类癌、淋巴癌、上皮样血管内皮瘤、鳞状细胞癌、畸胎瘤、以及平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤等其它肝脏肉瘤。肝细胞癌(HCC)是其中一种组织学亚型。肝细胞癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率位居世界第六位，死亡率位居第三位。在西方国家其发病率逐年上升，中国更是肝细胞癌高发国。据统计，全球2008年肝癌新增患病人数约74.8万，死亡69.6万，其中一半均发生在中国。目前，肝细胞癌的病因尚未完全明确，其发生是一个涉及多因素、多阶段和多基因累积变异的过程，主要的因素有病毒感染、黄曲霉毒素的摄入、酒精中毒、水污染、肝螺旋杆菌以及肝硬化等。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是肝细胞癌的主要致病因素，尤其是在亚洲和非洲；丙型肝炎病毒(h印atitis C virus,HCV)感染呈世界性分布，是欧美等西方国家肝细胞癌发病率升高的主要因素。在发展中国家，60%的肝细胞癌患者有HBV感染，33%有HCV感染，在发达国家，此比率分别为23%和20%。肝硬化是肝细胞癌发生最危险的因素，也是肝硬化病人主要的死因。由于大多数肝细胞癌患者就诊时已属中晚期，失去了最佳治疗时机，目前仅有30-40%的肝癌患者能实施有效手术治疗，五年生存率仅有3-5%。所以及时有效的诊断肝癌是提高患者生存率的关键之一。[0003]目前，筛查和诊断肝癌最常用的方法是影像学和血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)检测。影像包括超声、CT、MRI等,但影像检测花费昂贵,难以广泛应用，且易受操作者经验影响，而且难以区分肝癌和非恶性增生。AFP是当前全世界应用最广泛的肝细胞癌标志物。当其界值为20ng/mL时，AFP诊断肝细胞癌的灵敏度仅为55-60%,产生约40%的假阴性率。另外部分非肝癌的慢性肝病患者血清AFP浓度也升高，包括15-58%的慢性乙型肝炎病人，10-43%的慢性丙型肝炎病人和11-47%的肝硬化患者，产生一定的假阳性率。因此发现新的可靠的能弥补AFP不足的肝细胞癌诊断标志物，可极大提高和改善临床综合治疗效果，有助于肝细胞癌患者生存期的延长和生存质量的提高。理想的肿瘤标志物需要有较高的特异性，能够将肝细胞癌与肝炎、肝硬化、肝脏再生结节等区别开来，同时还需有较高的灵敏度，能够诊断早期肝细胞癌，且具有易检测、可重复、非侵入性的特点。[0004]DKKl是Wnt信号通路的抑制因子，最早克隆于1998年，发现其在非洲爪蟾早期发育中能够抑制fct诱导的轴的复制而参与头部的形成。Wnt通路是一条对胚胎发育起重要调节作用的信号通路，参与细胞增殖、分化、凋亡、细胞极性和运动等过程，其通路中信号分子的突变或异常表达与多种疾病及癌症相关。fct通路受几种分泌蛋白的调控，包括DKK、WIF(ffnt-1nhibitor factor)和 SFRP(secreted frizzled related protein)等。DKK 家族包含进化上相对保守的4个成员(DKK1-4)。DKKl编码一个分泌型糖蛋白，含有两个富含半胱氨酸的保守区域(Cysl、Cys2),能够与低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6 (low_densitylipoprotein receptor-related protein 5/6,LRP5/6)结合，并在膜蛋白 Kremenl/2 参与下通过引起LRP5/6内吞,抑制Wnt-Frizzled_LRP5/6复合体的形成,而抑制经典的fct信号通路。[0005]随后本发明人采用ELISA方法，首次在10种不同类型人肿瘤细胞培养上清中检测出高浓度的DKKl蛋白，提示多种人肿瘤细胞分泌和高表达DKKl，DKKl可用于人类恶性肿瘤的临床血清诊断。于是2005年本发明人申报了国家发明专利(CN200510110298.2)和国际PCT专利(PCT/CN2006/000382)。DKKl用于癌症血清诊断的中国专利和国际专利均为本发明人首次在国内和国际上提出申请。[0006]但是，本领域目前对血清DKKl的临床意义，特别是鉴别诊断肝细胞癌患者和AFP阳性(血清AFP>20ng/ml)慢性肝病患者的能力并不清楚。
[0007]本发明的目的在于提供血清DKKl在制备肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病鉴别诊断试剂中的用途。
[0008]在本发明的第一方面，提供DKKl蛋白或其编码基因在制备鉴别(区分)肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病的诊断试剂中的用途。
[0009]在本发明的第一方面，提供DKKl在制备鉴别(区分)肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病的诊断试剂盒中的用途。
[0010]在一个优选例中，所述的诊断试剂选自(但不限于):
[0011]特异性扩增DKKl蛋白的编码基因的引物；或
[0012]特异性识别DKKl蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
[0013]特异性抗DKKl蛋白的抗体。
[0014]在另一优选例中，所述的慢性肝病选自(但不限于):肝硬化，慢性乙型肝炎。
[0015]在本发明的第一方面，提供一种用于鉴别(区分)肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病的试剂盒，所述的试剂盒中含有:
[0016](I)检测甲胎蛋白或其编码基因(较佳地，为血清中的甲胎蛋白或其编码基因)的表达情况或表达量的诊断试剂；和
[0017](2)检测DKKl蛋白或其编码基因(较佳地，为血清中的DKKl蛋白或其编码基因)的表达情况或表达量的诊断试剂。
[0018]在一个优选例中，所述的试剂盒中，先使用⑴的诊断试剂检测待测样品(较佳地，为血清)中甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量；再使用(2)的诊断试剂检测待测样品(较佳地，为血清)中的DKKl蛋白或其编码基因的表达情况或表达量，若甲胎蛋白检测为阳性，DKKl检测为阴性则该待测样品的提供者倾向于为慢性肝病。
[0019]在另一优选例中，所述的待测样品是血清。
[0020]在另一优选例中，所述的试剂盒中，所述的检测甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂选自(但不限于):[0021]特异性扩增甲胎蛋白的编码基因的引物；或
[0022]特异性识别甲胎蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
[0023]特异性抗甲胎蛋白的抗体。
[0024]在另一优选例中，所述的检测DKKl蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂选自(但不限于):
[0025]特异性扩增DKKl蛋白的编码基因的引物；或
[0026]特异性识别DKKl蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
[0027]特异性抗DKKl蛋白的抗体。
[0028]在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括:
[0029]核酸抽提试剂(如核酸抽提液)；和/或
[0030]聚合酶链反应试剂(如dNTP，Taq酶)；和/或
[0031]蛋白免疫印迹试剂；和/或
[0032]酶链免疫反应试剂(如显色液或杂交液)。
[0033]在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括:说明诊断试剂如何使用的使用说明书。
[0034]在本发明的另一方面`，提供一种鉴别肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病的方法，其特征在于，所述方法包括:
[0035](a)检测待测样品(较佳地，为血清)中甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量;
[0036](b)检测DKKl蛋白或其编码基因的表达情况或表达量，若甲胎蛋白检测为阳性，DKKl检测为阴性则该待测样品的提供者倾向于为慢性肝病。
[0037]在另一优选例中，使用所述的试剂盒进行测定。
[0038]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。



[0039]图1.评估血清DKKl蛋白鉴别诊断肝细胞癌(HCC)和慢性肝病患者(慢性乙型肝炎患者和肝硬化)的能力的研究设计。
[0040]正常人(healthycontrols, HC);慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)；肝硬化(liver cirrhosis, LC);肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC);酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA);受试者工作特征(receiveroperating characteristics, ROC) ；DKK I:dickkopf-l ；AFP:alpha-fetoprotein,甲胎蛋白。
[0041]图2、测试集和验证集各组中血清DKKl蛋白和血清AFP蛋白的浓度。
[0042]图A和C为正常对照组(healthy controls, HC)、慢性乙型肝炎组(chronichepatitis B,CHB)、肝硬化组(liver cirrhosis, LC)和肝细胞癌组(HCC)血清 DKKl 蛋白的浓度。图B和D为血清AFP蛋白在这4组中的浓度，当血清AFP浓度高于1210ng/ml时，其浓度以 1210ng/ml 计算。*，Ρ〈0.001。
[0043]图3、血清DKKl对肝细胞癌患者和慢性肝病患者的鉴别诊断能力。
[0044]图A和C为以肝细胞癌(HCC)为病人组，以慢性乙型肝炎(chronic hepatitisB，CHB)和肝硬化(liver cirrhosis, LC)为对照组制作的ROC曲线。图B和D为DKKl和AFP分别在慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)患者中的阳性率，及DKKl在AFP阳性(AFP+，>20ng/ml)慢性乙型肝炎(CHB)和AFP阳性(AFP+)肝硬化(LC)患者中的阳性率。
[0045]图4、血清DKKl对肝细胞癌患者和AFP阳性慢性肝病患者的鉴别诊断能力。
[0046]以AFP 阴性(血清AFP < 20ng/ml, AFP-negative)或AFP 阳性(血清AFP>20ng/ml,AFP-positive)肝细胞癌(HCC)为病人组，以AFP阳性慢性乙型肝炎(chronic hepatitisB，CHB)和AFP阳性肝硬化(liver cirrhosis, LC)为对照组制作的ROC曲线。
[0047]图5、血清DKKl对具有肝硬化背景或无肝硬化背景的肝细胞癌患者和肝硬化患者的鉴别诊断能力。
[0048] 图A和F为肝硬化患者(liver cirrhosis, LC)、具有肝硬化背景的肝细胞癌患者(HCC with cirrhosis)和无肝硬化背景的肝细胞癌患者(HCC without cirrhosis)血清中DKKl的蛋白浓度。图B和G为以肝硬化背景肝细胞癌为病人组，以肝硬化为对照组制作ROC曲线评估DKK1、AFP及两者联合后的诊断能力。图C和H为以无肝硬化背景肝细胞癌为病人组，以肝硬化为对照组制作ROC曲线评估DKKUAFP及两者联合后的诊断能力。图D和I为以AFP阴性(血清AFP ( 20ng/ml,AFP-negative)且具有肝硬化背景肝细胞癌为病人组，以肝硬化(LC)为对照组制作ROC曲线评估DKKl的诊断能力。图E和J为以AFP阳性(血清AFP>20ng/ml，AFP-positive)且具有肝硬化背景肝细胞癌(HCC)为病人组，以肝硬化(LC)为对照组制作ROC曲线评估DKKl的诊断能力。
[0049]图6、血清DKKl对肝细胞癌患者和慢性乙肝患者的鉴别诊断能力。
[0050]图A和D为以肝细胞癌(HCC)为病人组，以慢性乙肝患者(chronic hepatitis B，CHB)为对照组制作ROC曲线评估DKKl、AFP及两者联合后的诊断能力。图B和E为以AFP阴性(血清AFP ( 20ng/ml,AFP-negative)肝细胞癌(HCC)为病人组，以慢性乙肝患者(CHB)为对照组制作ROC曲线评估DKKl的诊断能力。图C和F为以AFP阳性(血清AFP>20ng/ml,AFP-positive)肝细胞癌(HCC)为病人组，以慢性乙肝患者(CHB)为对照组制作ROC曲线评估DKKl的诊断能力。

[0051]本发明人通过分析大量的肝细胞癌样本，从中分析了 DKKl和AFP的表达情况，首次发现DKKl可良好地鉴别(区分)肝细胞癌和甲胎蛋白(AFP)阳性慢性肝病，减少甲胎蛋白检测的假阳性情况。
[0052]本发明中，本发明人设计了大样本多中心队列研究，通过检测测试集队列(包括213例正常人、98例慢性乙型肝炎患者、96例肝硬化患者和424例肝细胞癌患者)血清中的DKKl蛋白浓度，在国内外首次发现血清DKKl在鉴别诊断肝细胞癌和慢性肝病(尤其是AFP阳性慢性肝病)中具有较高的灵敏度和特异性，并在验证集(包括99例正常人、73例慢性乙型肝炎患者、72例肝硬化患者和209例肝细胞癌患者)中验证了血清DKKl的鉴别诊断价值。
[0053]如本文所用，“AFP阳性慢性肝病”是指一种非癌症的适应症，其血清AFP>20ng/ml。AFP是公知的肝细胞癌标志物，由于目前临床诊断以AFP作为肝癌标志物较为普遍,临床上AFP阳性慢性肝病易于被诊断为肝癌。[0054]在本发明中，术语“DKK1蛋白”的氨基酸序列与GenBank登录号AAQ89364提供的蛋白序列基本上相同，也包括DKKl蛋白的同源蛋白。“DKK1蛋白的编码基因”的核苷酸序列与GenBank登录号NM_012242.2提供的核苷酸序列基本上相同或其简并的变异体，也包括DKKl基因的同源基因。术语“AFP蛋白”的氨基酸序列与GenBank登录号AAH27881.1提供的蛋白序列基本上相同。“AFP蛋白的编码基因”的核苷酸序列与GenBank登录号NM_001134.1提供的核苷酸序列基本上相同或其简并的变异体。
[0055]目前临床上，肝癌主要分为以下几类:(I)肝细胞癌，起源于肝细胞的恶性肿瘤；
(2)胆管癌，起源于肝内外胆管上皮细胞的恶性肿瘤，约占原发性肝癌的20%，近年来发病率逐年升高；(3)混合性原发性肝癌，同一肝癌肿块内，肝细胞癌与胆管细胞癌并行；(4)肝血管瘤，较为常见的肝脏良性肿瘤，占肝良性肿瘤的5-20% ； (5)肝腺瘤:在肝脏良性肿瘤中，其发病率仅次于肝血管瘤，发病机理可能与性内分泌紊乱有关，主要发于女性；(6)肝脏局灶性结节性增生，肝脏良性病变，发病原因暂不清；(7)肝类癌，恶性肿瘤原发性肝类癌较少见，继发性肝类癌主要有消化道等脏器的类癌转移所致，较常见；(8)肝母细胞瘤:一种具有多种分化方式的恶性胚胎性肿瘤，是儿童中最常见的肝肿瘤；(9)转移性肝癌:原发灶在身体其它部位，转移至肝生长的恶性肿瘤。
[0056] 此外，还有慢性肝病(例如肝炎、肝硬化)也表现为肝部不适，易于被诊断为肝癌。根据以上肝癌以及肝病的特点可知，在临床上肝癌存在复杂性，如何进行区分认定、提高临床诊断准确性是人们亟待解决的问题，临床上非常需要能够准确诊断肝细胞癌(特别是常规难以准确诊断的AFP阴性肝细胞癌、早期肝细胞癌或小肝细胞癌)的标志物。而AFP尽管已经被作为一种经典的肝癌标志物，但其却不能够完全解决临床上准确细分、诊断的难题，误诊率居高不下。而DKKl这一标志物，尽管本发明人在先已经将之与癌症相关联，然而其是否可以对肝癌的类型进行细分是以往的研究中未知的。
[0057]基于本发明人的新发现，DKKl蛋白或其编码基因可作为鉴别(区分)肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病的标志物(标记物)。通过分析待测样品(样本)中DKKl蛋白或其编码基因的表达情况，从而得知受试者的患病状况，为疾病的诊断或预后提供依据。所述的待测样品或待测样本是患者的体液，较佳地是血清。
[0058]可采用各种技术来检测DKKl的表达情况，这些技术均包含在本发明中。检测核酸可用的已有技术如(但不限于):基因芯片技术、探针杂交技术、聚合酶链反应(PCR)、Northern Blot等方法。检测蛋白可借助于质谱分析仪器等，或可通过Western Blot或ELISA等方法。
[0059]作为本发明的一种选择方式，通过定量或半定量的聚合酶链反应(PCR)法来分析样品中DKKl基因的表达情况以及表达量，从而可做出判断。较佳地，通过RT-PCR实现检测。
[0060]基于本发明的新发现，本发明还提供了特异性识别DKKl蛋白或其编码基因的试剂。任何可识别DKKl蛋白或其编码基因的试剂均包含在本发明中，用作鉴别(区分)肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病的标志物。所述的特异性识别DKKl蛋白或其编码基因的试剂例如是:特异性扩增DKKl蛋白的编码基因的引物；或特异性识别DKKl蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗DKKl蛋白的抗体。
[0061]本发明还提供了一种特异性识别DKKl蛋白或其编码基因的试剂的用途，用于鉴别(区分)肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病。
[0062]作为本发明的一种实施方式，所述的试剂是抗DKKl的抗体；更特别的例如是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0063]本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的抗原可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生，所述的动物如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
[0064]本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
[0065]所述的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本中的DKKl水平，从而用于鉴别(区分)肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病。
[0066]作为本发明的另一种实施方式，所述的试剂是特异性扩增DKKl基因的引物，在得知了 DKKl的核苷酸序列后，人们易于基于此设计出引物。
[0067]也可利用基因芯片技术来进行DKKl的检测。在得知了 DKKl的核苷酸序列后，人们易于基于此设计出探针。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照现有公知技术。
[0068]利用所述的抗体、探针或引物，可以检测体液中DKKl的水平，因而可用于鉴别(区分)肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病，或者用于制备检测制剂或试剂盒等。
[0069]本发明还提供了用 于鉴别(区分)肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病的试剂盒，该试剂盒包括:特异性识别DKKl蛋白或其编码基因的试剂。更佳地，所述的试剂盒还包括:特异性识别AFP蛋白或其编码基因的试剂；从而可通过先检测待测样品中AFP的存在情况来确定AFP阳性的样品；进一步地检测DKKl的存在情况，以确定疾病是慢性肝病还是肝细胞癌；这种检测手段将使得肝细胞癌和慢性肝病的检测更为准确、可极大地减少误诊。所述的特异性识别DKKl蛋白或其编码基因的试剂例如是:特异性扩增DKKl蛋白的编码基因的引物；或特异性识别DKKl蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗DKKl蛋白的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)。所述的特异性识别AFP蛋白或其编码基因的试剂例如是:特异性扩增AFP蛋白的编码基因的引物；或特异性识别AFP蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗AFP蛋白的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)。
[0070]所述的试剂盒中还可含有:核酸抽提试剂(如核酸抽提液)；和/或聚合酶链反应试剂(如dNTP，Taq酶)；和/或蛋白免疫印迹试剂；和/或酶链免疫反应试剂(如显色液或杂交液)。
[0071]作为一种优选方式，所述的试剂盒中还可含有:用于免疫组织化学分析的试剂，所述的试剂例如:第二抗体、染色剂、显色剂等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书等。更具体地，所述的试剂盒可以是一种基于酶联免疫反应(ELISA)技术的试剂盒，用于鉴别(区分)肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病。ELISA技术以及基于该技术的检测试剂对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
[0072]作为另一种优选方式，所述的试剂盒中还可含有:(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于:Taq酶，PCR缓冲液，dNTP, DNA聚合酶等；或⑶各种提取DNA (即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于:酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或(C)提取DNA的试剂盒。
[0073]所述的特异性识别DKKl蛋白或其编码基因的试剂、或特异性识别AFPl蛋白或其编码基因的试剂也可固定于试纸上，制备成免疫胶体金试纸或类似检测材料。
[0074]此外，所述的试剂盒中还可含有本发明的试剂盒的使用说明书和/或标准操作程序。
[0075]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0076]1、材料和方法
[0077]1、血清标本收集
[0078](I)血清标本
[0079]测试集血清标本共831例，其中213例正常人(healthy controls, HC)血清、98例慢性肝炎患者(chronic hepatitis B,CHB)血清和 96 肝硬化患者(liver cirrhosis,LC)血清来自苏州大学第一附属医院感染科，424例肝细胞癌患者血清来自复旦大学附属中山医院肝外科；验证集血清标本共453例，包括99例正常人血清、73例慢性肝炎患者血清和72肝硬化患者、209例肝细胞癌患者血清，均来自第二军医大学附属东方肝胆外科医院。血清在临床诊断时即收取，收取时间自2008年10月至2011年6月。血清收集于促凝管内，2，000-3, OOOrpm离心18_20min，吸取上清于离心管中，_80°C分装保存。两组队列肝细胞癌患者、肝炎患者、肝硬化患者临`床病理特征如表1-3所示。
[0080]测试集和验证集中肝细胞癌患者临床特征见表1。
[0081]表1
[0082]