Let-7家族miRNA在制备治疗神经再生相关疾病的药物中的应用的制作方法[0002]神经损伤是临床常见病例，且发病率呈逐年增加趋势。神经营养因子(neurotrophic factor, NTF)是对神经细胞起特殊营养作用的多肽分子,不仅参与调节神经元的发育和成熟 ，而且在成年神经系统中也发挥效应，具有抑制成年神经元损伤后凋亡、促进神经再生、调节突触可塑性和传递神经递质等功能。有报道NTF在胚胎发育、细胞分化、神经再生、创伤愈合、免疫调节及肿瘤发生等许多方面都发挥着重要的生物学调节作用。NGF(神经生长因子)是最早确认而且研究得最为清楚的神经营养因子，是由神经元、神经支配的靶组织或胶质细胞产生的能促进中枢和外周神经分化、生长和存活的活性蛋白质，在神经系统的发育和正常的生理功能维持以及神经损伤后的再生中起着重要作用。再生微环境中的神经生长因子(NGF)具有明显的促神经再生的作用，因此外源加入或肌肉注射NGF治疗神经损伤得到了广泛的研究，我们课题组也在人工神经移植物中尝试加入NGF来修复长距离坐骨神经缺损，取得良好效果，但NGF不易通过血神经屏障，生物活性半衰期较短，而长期大量用药会引起毒副作用，在临床应用中注射部位肌痛和痛觉过敏等导致了尽管NGF有很好的修复神经再生效果，但至今仍难应用于临床，因此开发一种可以调控NGF表达的药物来替代NGF的使用有潜在的应用价值。[0003]miRNA (microRNA,微RNA)是一类长度约22nt的非编码小分子RNA，由其前体分子在酶的作用下加工生成，广泛存在于生物体中。在动物机体，miRNA通过转录后调控许多基因和蛋白的表达，通过核酸序列互补性结合到特定的靶mRNA上来调节靶mRNA翻译或降解靶基因mRNA，是一种起负调控作用的分子。目前研究显示miRNA参与了生物体发育、分化、生长、免疫应答等生理过程，且其表达及功能失调可能导致肿瘤发生，自身免疫性疾病以及病毒感染等多种病理现象，miRNA在神经系统的调控作用也逐渐被人报道。基础和临床研究表明，miRNA无论在正常生理过程还是在疾病过程中都是重要的调节因子。不同于以往的有或无的调节特点，miRNA主要是在数量上对靶基因进行调节。这一特点是mi RNA单靶点强大的调节作用或一些分子的拮抗剂和激动剂所无法比拟的。这展示了 miRNA在临床应用方面的巨大前景。[0004]let-7家族miRNA是一组序列高度同源,功能相似的miRNA,包括miR-98, let_7a,let-7b, let-7c, let_7d, let_7e, let_7f, let_7g, let_7i。let_7家族miRNA在物种间高度保守，某些成员受甲基化、转录后修饰及Lin28基因的调控，同时也调节RAS、HMGA2、⑶C25A、⑶K6、FAS、CASP3等靶基因，与生命中的多种的生物学现象和生理过程息息相关。[0005]现有文献报道了 let-7家族miRNA相关的功能主要包括在肿瘤发生中的调节作用、对凋亡的调节作用以及在发育过程中的调节作用。迄今为止还没有关于miRNA调节NGF的相关报道，对于let-7家族miRNA在神经再生领域的功能也缺乏清楚的了解。因此，本领域对于调节NGF的新靶点和手段有迫切的需要。
[0006]本研究首次证实let-7家族miRNA可直接祀向调控NGF的表达,首次探讨了 let_7家族miRNA在神经损伤再生过程中的调控作用，丰富了 miRNA对神经再生的调控作用研究，有助于Let-7家族miRNA作为调控NGF的新的治疗靶点的研究与开发。[0007]本发明的目的是提供let-7家族miRNA在在制备治疗神经再生相关疾病的药物中的应用。
[0008]本发明具体技术方案如下:
本发明提供了 let-7家族miRNA及其调节剂或者经化学修饰的let_7家族miRNA及其调节剂在制备治疗神经再生相关疾病的药物中的用途，所述治疗神经再生的相关疾病是指周围神经损伤、中枢神经损伤、视神经损伤或脑损伤疾病，所述let-7家族miRNA选自miR-98, let_7a, let_7b, let_7c, let_7d, let_7e, let~7f, let_7g, let_7i,其核苷酸序列如 SEQ ID N0.1-9 所示。
[0009]上述调节剂选自所述let-7家族miRNA的抑制剂或增效剂，抑制剂优选let_7家族miRNA的反义核酸序列；增效剂优选是let-7家族miRNA模拟核酸。
[0010]miRNA的模拟核酸是模拟生物体内源的miRNA，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能 。而miRNA抑制核酸是化学修饰的专门针对细胞中特异性的靶miRNA的抑制剂，在本发明中使用了原RNA序列的反义序列。
[0011]人工合成的miRNA已经成功应用于沉默预期靶基因表达及其功能研究。miRNA模拟核酸能够进一步增强内源miRNA的沉默作用，降低细胞内蛋白的表达量，进行功能获得性研究。相反，使用化学合成的方法合成miRNA抑制核酸，特异的祀向抑制单个的miRNA分子，可以削弱内源miRNA对特定基因的沉默效应，提高蛋白表达量，进行功能缺失性研究，可用来筛选miRNA靶点，筛选调控某一基因表达的miRNA，筛选影响细胞发育过程的miRNA。化学合成的miRNA模拟核酸和抑制核酸已经成为研究动植物基因家族的功能的有用工具，并且也是癌症治疗和临床研究的一种新策略。
[0012]miRNA模拟核酸和抑制剂的设计可采用本领域常规技术。目前miRNA模拟核酸和抑制剂的合成已经商业化，可以从各生物公司购得。例如，本发明所用的miRNA的模拟核酸和抑制核酸来自广州锐博生物科技有限公司。序列分析表明，至少有1/3的人类基因与miRNA调控相关。研究基因的功能通常是将其从基因组中敲除，然后观察敲除前后的变化，但在miRNA的功能研究中，研究人员一般采用增强或减弱该miRNA的表达来鉴定其功能。
[0013]本发明以miR-98和let_7d为例，其抑制剂可以选自以下抑制核酸: miR-98 抑制核酸(单链):5’ AACAAUACAACUUACUACCUCA3’ SEQ ID N0.10 let-7d 抑制核酸(单链):5’ AACUAUGCAACCUACUACCUCU3’ SEQ ID N0.11 以miR-98和let-7d为例，其增效剂可以选自以下模拟核酸:
miR-98 模拟核酸(双链):5’ UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU3’ SEQ ID N0.12 3’ ACUCCAUCAUUCAACAUAACAA5’ SEQ ID N0.13
let-7d 模拟核酸(双链):5’ AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU3’ SEQ ID N0.143’ UCUCCAUCAUCCAACGUAUCAA5’。SEQ ID N0.15
本发明所述的用途，进一步的来说，let-7家族miRNA及其调节剂或者经化学修饰的let-7家族miRNA及其调节剂在作为药物进行给药时，可以通过体外转染细胞，然后将转染细胞移植损伤处发挥修复作用。所述细胞选自神经损伤处的胶质细胞或干细胞诱导分化为胶质细胞。转染方法为本领域常规技术，具体的操作示例如下:取原代培养纯化的施万细胞，利用Lipofectamine RNAiMAX (invitrogen)将设计合成了的let_7模拟核酸或抑制核酸转入细胞，96孔板模拟核酸用量为4pmol，抑制核酸用量为8pmol，24孔板模拟核酸用量为25pmol，抑制核酸用量为50pmol。或者，将所述miRNA及其调节剂或经化学修饰的miRNA及其调节剂直接给药于损伤处，给药方式为常规给药途径，包括但不限于直接注射、静脉输液、口服靶向给药等。
[0014]虽然miRNA模拟核酸和抑制剂能够治疗性地靶向miRNA功能，但是直接用于机体时，容易受到核酸酶的攻击并降解，可能导致活性降低，因此为了避免上述情况的发生或提高miRNA模拟核酸和抑制剂的作用，可以进一步通过化学修饰改进miRNA及其抑制剂或增效剂的稳定性、效力和/或毒性。本发明所述的化学修饰包括硫代修饰、甲氧基修饰、氟代修饰、胆固醇修饰、Cy3和Cy5标记、生物素修饰、氨基修饰、DNP修饰、炔基修饰中的一种或几种。
[0015]目前现有技术下有多种对RNA进行修饰的方法，如可参考中国专利201080035109公开的技术方案对R A序列进行化学修饰，或者可以直接从商业化的生物技术公司购得。在本发明中，化学修饰的miRNA及其调节剂交由广州锐博生物公司合成。
[0016]本发明中采用的化学修饰的let-7家族miRNA调节剂优选let_7家族miRNAantagomir 或 agomir。
[0017]antagomir是根据microRNA成熟体序列设计,经过特殊标记与化学修饰的单链小RNA,是专门用于抑制内源性microRNA的高效阻断剂。Agomir是经过特殊标记和化学修饰的双链小RNA，通过模拟内源性的miRNA来调节靶基因的生物学功能。
[0018]antagomir及agomir化学修饰结构如下:
antogimir对抑制核酸的3’端进行胆固醇修饰,5’端两个硫代骨架修饰,3’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰。
[0019]agomir在反义链进行修饰，3’端进行胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰全链甲氧基修饰。
[0020]本发明以Let_7d miRNA为例， let_7d agomir (双链):
5’ AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU3’ SEQ ID N0.14
3，chol-s-s-s-s-(mU) (mC) (mU) (mC) (mC) (mA) (mU) (mC) (mA) (mU) (mC) (mC) (mA) (mA)(mC) (mG) (mU) (mA) (mU) (mC) (mA) (mA)-s_s5’ SEQ ID N0.16Let_7d antagomir:
5，s-s- (mA) (mA) (mC) (mU) (mA) (mU) (mG) (mC) (mA) (mA) (mC) (mC) (mU) (mA) (mC) (mU)(mA)(mC)(mC)(mU)(mC)(mU)-s-s-s-s_chol3’ SEQ ID N0.17其中，chol为胆固醇修饰、s为硫代修饰、m为甲基化修饰。
[0021]antagomir 和 agomir 具有如下优点:1、与普通miRNA inhibitor和mimics相比，antagomir和agomir与细胞膜亲和力更高，细胞转染实验转染试剂用量显著减少。
[0022]2、特别适合动物体内干扰实验.并且在体内实验中具有更高的稳定性和抑制效果，可以采用全身注射或局部注射等多种方式给药，操作简便。
[0023]3、可富集于靶细胞，实现高效的特异性稳定干扰
4、抑制持续时间长，至少达到一周时间，干扰效果最长可持续5-6周。
[0024]另一方面，本发明涉及一种调控机体NGF表达的方法，将上述let-7家族miRNA及其调节剂或者经化学修饰的let-7家族miRNA及其调节剂体外转染细胞，然后将转染细胞移植损伤处，调控NGF表达；或者，将上述let-7家族miRNA及其调节剂或者经化学修饰的let-7家族miRNA及其调节剂直接给药于损伤处，调控NGF表达。
[0025]本发明所述let-7家族miRNA除了可以直接作为药物用于治疗神经再生相关疾病，还可以作为药物的靶点，通过与药物的作用，上调或抑制机体miRNA的表达，进而进一步调控机体NGF的表达而发挥作用 。
[0026]本发明研究了 let-7家族miRNA在神经损伤再生过程中的调控作用，在一个具体实施中let-7家族miRNA通过调控靶基因NGF的表达，影响了神经再生中胶质细胞雪旺细胞的增殖、迁移、NGF的分泌和轴突的生长从而调控神经再生。
[0027]本发明中的一个及多个实施例的研究结果表明，let-7家族miRNA可以直接靶向调控NGF的表达，通过抑制翻译降低NGF的表达和分泌，而Let-7的抑制剂可以促进NGF的表达和分泌，从而进一步影响轴突生长。由此，可利用let-7家族miRNA对NGF的调节作用来调控NGF的表达和分泌，治疗神经损伤，代替或改进NGF在临床应用上的副作用，作为调控NGF的替代手段治疗神经再生。
[0028]本发明的优点:由于血脑和血神经屏障的存在，很多药物不能进入神经内发挥作用，而miRNA由于分子较小，可以通过血脑和血神经屏障；另外尽管已经发现NGF有很好的促神经再生作用，但由于其副作用而不宜应用与临床，通过调控NGF的表达和分泌可以有效的避免NGF的副作用。



[0029]图1 Let-7miRNA 直接靶向 NGF3’ UTR。(A)NGF3，UTR 与 Let_7miRNA 家族匹配区分析和克隆构建；(B)荧光素酶双报告基因分析(**p〈0.01)。
[0030]图2 Let-7miRNA 抑制 NGF 的翻译。(A) Let_7d 和 miR-98 对 NGF mRNA 没有明显影响；(B)Let-7d和miR-98明显影响了 NGF的蛋白表达(**ρ〈0.01)。
[0031]图3 Let-7miRNA 抑制施万细胞的增殖(*0.01〈ρ〈0.05，**ρ〈0.01)。
[0032]图4 NGF Knockdown 能够逆转 Ant1-Let_7miRNA 的促增殖效应(**ρ〈0.01),表明let-7miRNA家族影响雪旺细胞的增殖是通过NGF发挥作用的。
[0033]图5 Let-7miRNA抑制施万细胞的迁移(#ρ〈0.01)。
[0034]图6 NGF Knockdown 能够逆转 Ant1-Let_7miRNA 的促迁移效应(**ρ〈0.01),表明let-7miRNA家族影响雪旺细胞的迁移是通过NGF发挥作用的。
[0035]图7 Let-7miRNA能够抑制雪旺细胞NGF的分泌(#ρ〈0.01)。
[0036]图8 Let_7miRNA转化雪旺细胞后能够抑制轴突生长。[0037]图9 Let-7miRNA能够在体内抑制雪旺细胞的迁移(#p〈0.01)。
[0038]图10 Let-7miRNA能够在体内抑制轴突的生长(#ρ〈0.01)。

[0039]以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
[0040]在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0041]下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0042]在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0043]实施例中miR-98抑制核酸序列如SEQ ID N0.10所示，let_7d抑制核酸序列如SEQID N0.11所示，miR-98模拟核酸(双链)序列如SEQ ID N0.12-13所示，let_7d模拟核酸(双链)序列如 SEQ ID N0.14-15 所示。let_7d agomir (双链)序列如 SEQ ID N0.14 和16所示。
[0044]实施例lLet_7miRNA靶基因的确定。
[0045]将包含Let-7与其靶基因NGF匹配区的3’-UTR构建到pLUC荧光素酶报告基因的下游(示意图如图1A所示)，构建报告基因质粒，同时将匹配区的ACC突变为UGG，构建突变质粒作为阴性对照。将构建的包含NGF3’ -UTR的pLUC荧光素酶报告基因(24孔板每孔
0.6ug质粒)和Let-7d或miR-98模拟核酸(24孔板每孔25pmol模拟核酸)共同转入293T细胞，24小时后收细胞，测定报告基因。结果如图1B所示，相比Con组，过表达Let-7d和miR-98模拟核酸的荧光素酶活性明显被抑制；而Let-7miRNA与NGF3’ -UTR的匹配区被突变后，过表达Let-7d和miR-98模拟核酸的荧光素酶活性则没有明显变化。这表明，Let-7家族miRNA可以特异性地与NGF3’ UTR区种子序列相匹配并直接靶向调控NGF的表达。
[0046]实施例2Let_7miRNA对NGF表达的影响
采用RT-PCR和Western Blot来确定NGF的mRNA水平和蛋白水平。PCR引物为 NGF-forword:5，CCAAGGACGCAGCTTTCTATC3，(SEQ ID N0.18) ；NGF-reverse:5’CTGTGTCAAGGGAATGCTGAAG3’ (SEQ ID N0.19) ? 体系为 94°C变性 40 秒，60°C退火 30 秒，72°C延伸45秒。如图2A所示，与Con组相比，Let_7d和miR-98 (模拟核酸)的NGF mRNA水平没有明显变化，与Ant1-Con组相比，Ant1-Let_7d和AntiniR-98 (抑制核酸)的NGFmRNA水平也没有明显变化；如图2B所示，与Con组相比，Let_7d和miR-98的NGF蛋白水平明显降低，与Ant1-Con组相比，Ant1-Let_7d和Anti_miR-98的NGF蛋白水平明显增高。这表明，let-7家族miRNA沉默NGF的机制是通过抑制翻译而不是导致NGF mRNA的降解。
[0047]实施例3Let-7miRNA对施万细胞的调控作用研究。
[0048] (I)细胞取材及培养:原代施万细胞，取大鼠坐骨神经，用胶原酶和胰酶消化，用DMEM加10%胎牛血清培养以及100U/ml青霉素-链霉素培养，37°C，5% CO2孵育(参考文献B.Yu, et al.在坐骨神经损伤早期，miR-182通过靶向FGF9和NTM抑制雪旺细胞的增殖和迁移(miR-182inhibits Schwann cell proliferation and migration by targetingFGF9and NTM, respectively at an early stage following sciatic nerve injury)[J].Nucleic Acids Res, 2012，40:10356-65.)。[0049](2)细胞转染:用 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen 公司)转染 miR-98、let-7d的模拟核酸和抑制核酸，以及对照，转染原代施万细胞，96孔板mimic用量为4pmol,inhibitor 用量为 8pmol, 24 孔板 mimic 用量为 25pmol, inhibitor 用量为 50pmol,培养液为无血清培养基Opt1-MEM。6-8h后加含10%血清的完全培养基，然后分别进行增殖、迁移和分泌实验。
[0050]Let-7miRNA抑制施万细胞增殖。EDU测定细胞增殖(广州锐博生物公司试剂盒)。图3显示相比Con组，Let-7d和miR-98组明显抑制施万细胞增殖，；同时,相比Ant1-Con组，Ant1-Let-7d和miR-98组都明显促进了施万细胞的增殖。这表明，Let_7家族miRNA抑制施万细胞增殖。
[0051 ] Let-7miRNA通过NGF抑制施万细胞增殖。采用NGF knockdown看能否逆转Ant1-Let-7d和Anti_miR-98对施万细胞增殖的促进作用。将NGF siRNA(24孔板每孔50pmol)和 let-7 和 miR-98 抑制核酸(Ant1-Let_7d 或 Ant1-miR-98, 24 孔板每孔 50pmol)用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂共同转染入施万细胞。结果如图4所示,相比Ant1-con组，Ant1-Let-7d和Ant1-miR-98明显促进了施万细胞增殖，而NGF knock down能够逆转Ant1-Let-7d和Ant1-miR-98的促增殖效应。这表明Let_7家族miRNA通过靶基因NGF抑制了施万细胞的增殖。
[0052]Let_7miRNA抑制施万细胞迁移。Transwell测定细胞迁移(广州锐博生物公司试剂盒)OTranswelI小室的下室表面包被Fibronectin,包被后的小室可放置在4°C保存30d。收取转染24h后的施万细胞，用DMEM培养基调整细胞密度为3 X IO5个/mL，在transwell上室中IOOyL细胞悬液。下室加入500 μ L含10%胎牛血清的完全培养基。常规培养24h后结晶紫染色，染色后Leica DC300F正置显微镜进行观察和拍照，随机选取10个视野计数细胞个数。最后，用33%冰醋酸将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm，测其OD值，间接反映迁移细胞数。图5显示相比Con组，Let-7d和miR-98组明显抑制施万细胞迁移，；同时，相比Ant1-Con组，Ant1-Let_7d和miR-98组都明显促进了施万细胞的迁移。这表明，Let-7家族miRNA抑制施万细胞迁移。
[0053]Let_7miRNA通过NGF抑制施万细胞迁移。采用NGF knockdown看能否逆转Ant1-Let-7d和Ant1-miR-98对施万细胞迁移的促进作用。将NGF siRNA(24孔板每孔50pmol)和 let-7 和 miR-98 抑制核酸(Ant1-Let_7d 或 Ant1-miR-98, 24 孔板每孔 50pmol)用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂共同转染入施万细胞。如图6所示，相比Ant1-con组，Ant1-Let_7d和miR-98明显促进了施万细胞迁移，而NGF knock down能够逆转Ant1-Let-7d和miR-98的促迁移效应。这表明Let_7家族miRNA通过靶基因NGF抑制了施万细胞的迁移。
[0054]Let-7miRNA抑制NGF分泌。ELISA测定NGF分泌(millipore试剂盒)。每个样品做三个副孔，于酶标仪上读取样品在450nm吸光值，根据标准曲线算出样品试剂浓度。将let-7模拟物和抑制剂转入原代培养的施万细胞，ELISA实验发现let_7模拟物能够明显抑制NGF分泌，Ant1-let-7能够明显促进NGF分泌(图7)，这表明le7_7家族miRNA能够抑制NGF分泌。
[0055]Let-7miRNA转染的施万细胞抑制了轴突生长。将let_7d模拟物和抑制剂转染的原代培养的施万细胞种植在1.0mm Transwell小室,DRG神经元种植在transwell板子上，共培养，24小时后，用Ant1-NF200免疫荧光标记DRG神经元，荧光显微镜拍照。结果发现，let-7模拟物能够明显抑制轴突生长，Ant1-let-7能够明显促进轴突生长(图8)，这表明Let-7家族miRNA转染的施万细胞抑制了轴突生长。
[0056] 实施例4Let_7miRNA可以在体内微环境抑制施万细胞迁移和轴突生长。
[0057]Let_7miRNA制备坐骨神经离断伤模型(5mm缺损)，将直径1.0mm的硅胶管桥接离断缺口，将let-7d agomir((经过胆固醇修饰的let_7d,提高了 miRNA的稳定性,而且不需转染试剂,可以直接用于细胞和动物实验)和matrgel (BD Biosciences) 1:1混匀后注射到硅胶管内，在7和10天，处死大鼠，取硅胶管，Ant1-SlOO免疫组化染色，从损伤近端来测量施万细胞的迁移距离。图9显示在7和10天，let-7d明显抑制了施万细胞的迁移，这表明Let-7家族miRNA可以在体内微环境抑制施万细胞迁移。用Anti_NF200免疫组化染色，从损伤近端来测量轴突的生长距离。图10显示在7和10天，let-7d明显抑制了轴突的生长距离，这表明Let-7家族miRNA可以在体内微环境抑制轴突的生长。
[0058]讨论
由于血脑和血神经屏障的存在，很多药物不能进入神经内发挥作用，而miRNA由于分子较小，可以通过血脑和血神经屏障；另外尽管已经发现NGF有很好的促神经再生作用，但由于其副作用而不宜应用与临床，通过调控NGF的表达和分泌可以有效的避免NGF的副作用。上述研究证实，let-7家族miRNA可以直接靶向调控NGF的表达，通过抑制翻译降低NGF的表达和分泌，而Let-7的抑制剂可以促进NGF的表达和分泌，从而进一步影响轴突生长。由此，可利用let-7家族miRNA对NGF的调节作用来调控NGF的表达和分泌，治疗神经损伤，代替或改进NGF在临床应用上的副作用，作为调控NGF的替代手段治疗神经再生。