专利名称：琼脂糖酶及其基因的制作方法 琼脂糖是琼脂的主要组分。琼脂糖是一种其结构为D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖通过α-1，3键和β-1，4键交替连接在一起的多糖。为了从琼脂生产寡糖，人们必须将琼脂糖降解为更小的分子。为此，传统上已知化学降解琼脂糖的方法和酶促消化琼脂糖的方法。在化学降解法中，可以用酸水解琼脂糖。在这种情况下，主要切割α-1，3键。已知有两种类型的酶消化琼脂糖，即切割琼脂糖中β-1，4键的β-琼脂糖酶和切割琼脂糖中α-1，3键的α-琼脂糖酶。通过在β-1，4键切割琼脂糖获得的寡糖称为新琼脂寡糖。新琼脂寡糖在其还原末端具有D-半乳糖，其聚合度以平均数表示。另一方面，通过在α-1，3键切割琼脂糖获得的寡糖称为琼脂寡糖。琼脂寡糖在其还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖，其聚合度以平均数表示。最近，已表明在其还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖的琼脂寡糖具有诸如以下的生理活性细胞凋亡诱导活性、制癌活性、各种抗氧化活性、免疫调节活性、抗变态反应活性、抗炎活性和抑制α-糖苷酶的活性(WO99/24447，日本专利申请11-11646号)。基于生理活性，可以提供含有所述琼脂寡糖作为其有效成分的药用组合物和功能食品或饮料。在化学降解琼脂糖的方法中控制所生产的寡糖的大小是困难的。具体地说，选择性生产具有低聚合度的较小的寡糖相当困难(例如T.Tokunaga等，Bioscience & Industry，49734(1991))。如果使用β-琼脂糖酶，由于这种酶仅切割β-1，4键，所以仅可以获得不具有上述生理活性的新琼脂寡糖。预期使用具有切割α-1，3键的活性的α-琼脂糖酶，生产具有生理活性的琼脂寡糖。已知的α-琼脂糖酶包括由海洋革兰氏阴性菌菌株GJ1B产生的酶(Carbohydrate Research，66207-212(1978)；在EuropeanJournal of Biochemistry，214599-607(1993)中提出该菌株为解琼脂交替单胞菌(Alteromonas agarlyticus)GJ1B)，以及由弧菌属(Vibrio)细菌生产的酶(JP-A 7-322878；菌株JT0107-L4)。然而，利用解琼脂交替单胞菌GJ1B来源的α-琼脂糖酶，不可能生产具有重要的生理活性琼脂二糖，因为这种酶不能消化己糖或更短的寡糖。此外，所述弧菌属细菌来源的α-琼脂糖酶不能用来用琼脂糖作为原料生产琼脂寡糖，因为该酶仅对己糖和更短的寡糖表现出其活性，而对琼脂糖根本不起作用。本发明人进行深入的研究，以便获得切割琼脂糖中α-1，3键并且产生具有重要生理活性的琼脂寡糖的酶，发现了产生具有适合于此目的的特性的酶的两种微生物。分离由这些微生物产生的酶，并且指明其理化特性以及酶特性。此外，本发明人还分离出所述两种酶的基因，发现了用所述基因(WO 00/50578)通过基因工程便捷地生产具有α-琼脂糖酶活性的多肽的方法。如果人们想通过用所述两种α-琼脂糖酶之一处理溶解的琼脂糖而获得琼脂寡糖，则反应温度需要低于约40℃，因为所述酶的最适反应温度约为40℃。在这种情况下，如果琼脂糖浓度高，则琼脂糖可能固化，可能妨碍所述酶促反应。因此，如果使用这样一种酶，则需要用低浓度的琼脂糖进行所述处理。因而不能处理高浓度的琼脂糖，琼脂寡糖的生产率低。因此，需要在即使琼脂糖以高浓度溶解时琼脂糖也不会固化的高温下具有活性的热稳定α-琼脂糖酶。另一方面，在基因工程领域广泛进行在琼脂糖凝胶电泳之后从琼脂糖中提取已经过限制性酶处理或者扩增反应的核酸等。对于所述程序，常规上使用最适温度约37℃的β-琼脂糖酶。又是在这种情况下，根据所述酶的最适温度，需要降低反应温度，并且必须通过将含有待处理核酸等的琼脂糖凝胶溶于大体积的水中降低琼脂糖浓度，以防止琼脂糖固化。这样，待回收的核酸等的浓度也不可避免地被降低。浓度的降低产生问题，因为这导致回收率降低、琼脂糖消化效率降低和程序延长。为了解决这些问题，可以在高于常规温度的温度下进行反应所用的琼脂糖酶是必不可少的。美国专利第5,869,310号中描述的黄杆菌(Flavobacterium sp.)菌株NR19来源的β-琼脂糖酶可以被认为是这样一种琼脂糖酶，虽然其最适温度并不是如此高，并且热稳定性不足。因此，需要在高浓度的琼脂糖不会固化的高温下具有活性的热稳定β-琼脂糖酶。如上所述，现有技术在琼脂寡糖生产和从琼脂糖凝胶提取诸如核酸的物质方面存在问题。发明目的本发明的主要目的是提供具有琼脂糖酶活性、可以用于有效生产琼脂寡糖、从琼脂糖凝胶有效提取诸如核酸的物质等的多肽；所述多肽的氨基酸序列；编码所述多肽的基因；生产所述多肽的方法；生产琼脂寡糖的方法以及从琼脂糖凝胶提取诸如核酸的物质的方法。
发明概述鉴于上述问题，本发明人已经进行了深入的研究和探索，以便获得在高温下切割琼脂糖中α-1，3键并且可用于生产具有重要生理活性的琼脂寡糖的酶、以及在高温下切割琼脂糖中β-1，4键并且可用于从琼脂糖凝胶有效提取核酸等的酶。结果，本发明人成功地发现了产生具有适合于所述相应目的的特性的两种酶的微生物。从所述微生物中分离出所述酶，并且指出其理化特性和酶特性。
此外，本发明人成功地分离出编码所述酶的基因，并且发现了用所述基因通过基因工程便捷地生产本发明的具有α-琼脂糖酶活性的多肽和具有β-琼脂糖酶活性的多肽的方法。因而完成了本发明。
本发明概述如下。本发明的第一方面涉及新型琼脂糖酶，所述琼脂糖酶含有选自以下的氨基酸序列或者在所述氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列(1)由SEQ ID NO22的氨基酸序列中第21号氨基酸至第437号氨基酸的417个残基组成的氨基酸序列；或者(2)由SEQ ID NO23的氨基酸序列中第318号氨基酸至第1089号氨基酸的772个残基组成的氨基酸序列。
所述琼脂糖酶的示例为具有水解D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖之间的β-1，4键的活性的酶、或者具有水解3，6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1，3键的活性的酶。
本发明的第二方面涉及编码具有琼脂糖酶活性的多肽的基因。所述基因编码第一方面的琼脂糖酶。所述基因的示例为含有由SEQ IDNO20的核苷酸序列中第61号核苷酸至第1311号核苷酸的1251个核苷酸组成的核苷酸序列或者在所述由1251个核苷酸组成的核苷酸序列中一个或多个核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列的基因、或者含有由SEQ ID NO21的核苷酸序列中第952号核苷酸至第3267号核苷酸的2316个核苷酸组成的核苷酸序列或者在所述由2316个核苷酸组成的核苷酸序列中一个或多个核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列的基因。
本发明的第三方面涉及在严谨条件下可与第二方面的基因杂交并且编码第一方面的具有琼脂糖酶活性的多肽的基因。
本发明的第四方面涉及含有第二或第三方面的基因的重组DNA分子。
本发明的第五方面涉及带有第四方面的重组DNA分子的转化子。
本发明的第六方面涉及具有琼脂糖酶活性的多肽的生产方法，所述方法包括培养能够产生琼脂糖酶的微生物(例如属于微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)所属属的微生物)，并且从培养物中收集第一方面的琼脂糖酶。
本发明的第七方面涉及具有琼脂糖酶活性的多肽的生产方法，所述方法包括培养第五方面的转化子，并且从培养物中收集第一方面的琼脂糖酶。
本发明的第八方面涉及琼脂寡糖的生产方法，所述方法包括用第一方面的琼脂糖酶消化琼脂糖，并且从消化物中收集琼脂寡糖。
本发明的第九方面涉及从琼脂糖凝胶中提取物质的方法，所述方法包括用第一方面的琼脂糖酶消化琼脂糖凝胶。
本发明的第十方面涉及用于第九方面的从琼脂糖凝胶提取物质的方法的试剂盒，所述试剂盒含有第一方面的琼脂糖酶。
本发明的第十一方面涉及改进第一方面的琼脂糖酶热稳定性的方法，所述方法包括从N末端缺失构成所述琼脂糖酶的至多30％的多肽。
发明详述此中所用的寡糖是指由2个或2个以上、10个或10个以下的单体组成的糖。琼脂寡糖是指其结构为D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖通过α-1，3键和β-1，4键交替连接在一起并且在其还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖的寡糖。新琼脂寡糖是指其结构为D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖通过α-1，3键和β-1，4键交替连接在一起并且在其非还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖的寡糖。
多糖是指除单糖和寡糖之外的糖类。
本发明的琼脂糖酶是含有由SEQ ID NO22的氨基酸序列中第21号氨基酸至第437号氨基酸的417个残基组成的氨基酸序列、或者含有由SEQ ID NO23的氨基酸序列中第318号氨基酸至第1089号氨基酸的772个残基组成的氨基酸序列的琼脂糖酶。在一个实施方案中，它是一种含有在上述氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列的多肽。例如，包括具有与所述氨基酸序列至少70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高的同源性的区的多肽。可以依照已知方法，利用用于这类计算的任何计算机程序如DNASIS(Takara Shuzo)来计算同源性。
本发明的琼脂糖酶既可以作用于多糖(例如琼脂糖)，也可以作用于寡糖(例如琼脂寡糖和新琼脂寡糖)。例如，最适反应温度为45℃或更高。对于本发明的酶并无具体限制，只要它们具有这样的特性。其实例包括由海洋微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)生产的琼脂糖酶。
对于本发明的琼脂糖酶的切割模式并无具体限制。例如，所述琼脂糖酶可以是水解3，6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1，3键的α-琼脂糖酶，或者是水解D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖之间的β-1，4键的β-琼脂糖酶。
本发明的α-琼脂糖酶是水解3，6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1，3键并且既可以作用于多糖(例如琼脂糖)也可以作用于寡糖(例如琼脂己糖)的酶。对于本发明的所述酶并无具体限制，只要它具有这样的特性。其实例包括琼脂糖酶II，即由海洋微生物NAB2-1-1(FERMBP-7855)生产的α-琼脂糖酶。
由微生物NAB2-1-1生产的琼脂糖酶II是一种水解多糖或寡糖中3，6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1，3键的酶。所述酶作用于琼脂糖、琼脂己糖和比琼脂己糖长的琼脂寡糖(例如琼脂辛糖)以及新琼脂己糖和比新琼脂己糖长的新琼脂寡糖。
本发明的β-琼脂糖酶是水解D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖之间的β-1，4键并且既可以作用于多糖(例如琼脂糖)也可以作用于寡糖(例如琼脂己糖)的酶。对于本发明的所述酶并无具体限制，只要它具有这样的特性。其实例包括琼脂糖酶I，即由海洋微生物NAB2-1-1(FERMBP-7855)生产的β-琼脂糖酶。
由微生物NAB2-1-1生产的琼脂糖酶I是一种水解多糖或寡糖中D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖之间的β-1，4键的酶。所述酶作用于琼脂糖、新琼脂己糖和比新琼脂己糖长的新琼脂寡糖(例如新琼脂辛糖)以及琼脂己糖和比琼脂己糖长的琼脂寡糖。
以下描述测定上述酶的活性以及所述酶的理化特性和酶特性的方法。
(1)酶学测定方法通过用Agarose LO3(Takara Shuzo)作为底物进行酶促反应，然后用高效液相色谱定量测定所得的琼脂四糖或新琼脂四糖，测定本发明琼脂糖酶的活性。具体地说，此中所用的用于测定纯化酶制剂的活性或者纯化过程中酶的活性的酶活性测定方法如下。
制备在含有10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)(就琼脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化钙和10mM氯化钠的20mMTris-HCl缓冲液(pH7.2)(就琼脂糖酶II而言)中含有0.2％(w/v)或0.5％(w/v)浓度的琼脂糖的溶液。将作为底物的180μl该溶液与20μl酶溶液混合。让混合物于50℃反应5-30分钟，优选反应10分钟，然后在沸水中或于75℃加热1分钟以终止反应。让30μl所述反应混合物经过TSKgelα-2500柱(内径7.8mm；长度300mm；Tosoh)。用70％乙腈溶液作为洗脱液，以0.8ml/分钟的流速，定量测定以约25分钟的保留时间洗脱出的琼脂四糖或者以约24分钟的保留时间洗脱出的新琼脂四糖。一个单位(1U)定义为在10分钟内产生1μmol琼脂四糖的酶量。
(2)最适pH让酶作用于用乙酸缓冲液(pH4.5)、苹果酸缓冲液(pH5.5)、乙酸缓冲液(pH6.0、6.5)或Tris-HCl缓冲液(pH7.0、7.5、8.8)制备的反应混合物中作为底物的琼脂糖。结果，证明琼脂糖酶I和琼脂糖酶II都在弱酸性至弱碱性条件下表现出其消化琼脂糖的活性。
(3)最适温度本发明的琼脂糖酶II在范围为45-55℃的温度下表现出高酶活性，在约50℃下表现出最高活性。本发明的琼脂糖酶I在范围为45-70℃的温度下表现出高酶活性，在约55-65℃下表现出最高活性。
(4)热稳定性在48℃、50℃、55℃、60℃或65℃下处理给定的时间之后，测定酶制剂的剩余活性。结果，琼脂糖酶II在55℃处理10分钟之后表现出40％的其活性。琼脂糖酶I在60℃处理10分钟之后，表现出100％的其活性；在60℃处理20分钟之后，表现出100％的其活性；在60℃处理30分钟之后，表现出98％的其活性；在65℃处理10分钟之后，表现出100％的其活性；在65℃处理20分钟之后，表现出95％的其活性；在65℃处理30分钟之后，表现出90％的其活性；而在65℃处理60分钟之后，表现出90％的其活性。
(5)钙离子需求已知的琼脂糖酶需要钙以表现出其活性。检查本发明的相应琼脂糖酶的钙离子需求。结果，在无钙离子时，琼脂糖酶II的活性为存在钙离子时所表现出的活性的60％。在无钙离子时，琼脂糖酶I的活性为存在钙离子时所表现出的活性的100％。因此，琼脂糖酶II和琼脂糖酶I在不加入钙离子的情况下都表现出其活性。
本发明的琼脂糖酶II在CaCl2存在下被稳定化，而它不受锰离子或镁离子的影响。
(6)分子量用10-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定，估计琼脂糖酶II和琼脂糖酶I的分子量分别为约117,000和约48,000。
(7)依照Edman降解法测定氨基酸序列依照Edman降解法测定的琼脂糖II和琼脂糖酶I的N末端氨基酸序列分别为Glu-Thr-Ile-Val-Leu-Gln-Ala-Glu-Ser-Phe和Ala-Asp-Xaa-Asp-Gly-Val-Pro-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly。琼脂糖酶II和琼脂糖酶I的N末端氨基酸序列分别示于SEQ ID NO2和SEQ ID NO1。
如下所述，分离出编码琼脂糖酶II的基因和编码琼脂糖酶I的基因。也测定了由这些基因所编码的氨基酸序列。由琼脂糖酶II基因和琼脂糖酶I基因编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO23和SEQ IDNO22。由SEQ ID NO23的氨基酸序列中第318号氨基酸至第1089号氨基酸的772个氨基酸组成的多肽表现出本发明的α-琼脂糖酶的活性，而由SEQ ID NO22的氨基酸序列中第21号氨基酸至第437号氨基酸的417个氨基酸组成的多肽表现出本发明的β-琼脂糖酶的活性。
可以从通过培养微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)所获得的培养物中，纯化本发明的琼脂糖酶。NAB2-1-1从海水中作为同化琼脂的细菌分离出。它具有以下微生物学特性。
(1)形态学制备人工海水(商品名Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入0.3％(w/v)浓度的蛋白胨(Difco)和0.02％(w/v)浓度的酵母膏(Difco)。然后用3M碳酸钠将pH调至7.8。向其中加入0.1％(w/v)浓度的AgaroseLO3(Takara Shuzo)。在高压灭菌器中灭菌后，将上述微生物接种到所述混合物中，于37℃以120rpm培养过夜。在所述培养物中生长的微生物是革兰氏阴性杆菌，所述杆菌为游动的，有极生鞭毛，为需氧菌，并且需要盐。
(2)生长制备人工海水(商品名Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入0.3％(w/v)浓度的蛋白胨(Difco)和0.02％(w/v)浓度的酵母膏(Difco)。然后用3M碳酸钠将pH调至7.8。向其中加入1.5％(w/v)浓度的琼脂(Nacalai Tesque)。将混合物高压灭菌，制备平板。当将上述微生物接种到平板上时，表明(i)它在30-40℃下生长良好；(ii)当所述细胞生长时琼脂凝胶液化；和(iii)它在pH6.0-8.0下生长良好。
NAB2-1-1于2001年1月10日(原始保藏日)保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(International Patent OrganismDepositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏号为FERM BP-7855。
可以通过分析编码16S核糖体RNA(16S rRNA)的基因的核苷酸序列，获得关于上述微生物的分类学位置的信息。已知16S rRNA基因的核苷酸序列对于每种微生物菌株是特异性的。具体地说，从微生物NAB2-1-1提取染色体DNA。用可以用来扩增所述基因中一个区或其部分的引物进行PCR。测定所扩增的DNA片段的核苷酸序列。针对已测定的序列，利用GanBank数据库进行同源性搜索。则可以了解在所述区中具有相似核苷酸序列的微生物，即分类学上密切的微生物。
依照Bulletin of Japanese Society of Microbial Ecology，1031-42(1995)中描述的方法，扩增来源于微生物NAB2-1-1的16S核糖体RNA基因的DNA片段。使用在所述文献中描述的引物27f和1492r进行PCR(引物27f和1492r的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO32和33)。分析所得的DNA扩增片段的核苷酸序列。结果，发现了分别与产生本发明的琼脂糖酶的所述微生物在上述区中具有最高约90％同源性的以下微生物Pseudoalteromonas sp.KT0812A舒氏气单胞菌(Aeromonas schubertii)可以从NAB2-1-1以及NAB2-1-1的自发或人工突变体、或者从属于NAB2-1-1所属属并且能够产生本发明琼脂糖酶的微生物中，获得本发明的琼脂糖酶。
可以依照已知的方法，例如辐射、紫外线照射或用诱变剂处理，获得人工突变体。
已知属于同一属的微生物的16S rRNA基因的核苷酸序列之间的同源性一般为约99％或更高。因此，可以同本发明的微生物NAB2-1-1一样，使用其16S rRNA基因的核苷酸序列与微生物NAB2-1-1的所述基因的核苷酸序列具有99％或更高同源性的微生物。
可以使用含有所述微生物可以利用的氮源、无机物质等以及用琼脂、琼脂糖等作为碳源的培养基，作为所述微生物培养用的培养基。可以使用市售的琼脂或琼脂糖。氮源的实例包括肉膏、酵母膏、酪蛋白水解物、胰胨和蛋白胨。优选使用酵母膏和蛋白胨。这样的氮源也可以用作除琼脂或琼脂糖之外的碳源。此外，氯化钠、柠檬酸铁、氯化镁、硫酸钠、氯化钙、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、溴化钾、氯化锶、硼酸钠、硅酸钠、氟化钠、硝酸铵、磷酸氢二钠等可以联合用作盐。
特别是，优选使用通过向由人工海水Jamarin S组成的培养基中加入蛋白胨、酵母膏和琼脂或琼脂糖制备的培养基。优选加入0.1-2.0％浓度的琼脂或琼脂糖。通过适当改变琼脂或琼脂糖的浓度，可以制备固体或液体培养基。为了生产酶，优选使用0.1-0.3％浓度的液体培养物，而为了保存细胞，则优选使用1.2-2.0％浓度的固体培养物。如果使用低熔点琼脂糖进行液体培养，则它可以以0.1-1.0％的浓度使用。
例如，培养温度为30-40℃，培养基的pH为6.0-8.0，而培养时间为12-48小时，虽然根据培养基的组成，可以或多或少地改变培养条件。
在如上所述的培养期间所产生的本发明的α-琼脂糖酶和/或β-琼脂糖酶被分泌到细胞外。然后在培养后通过离心、过滤等除去细胞，获得培养上清液。
可以运用真空浓缩或超滤来浓缩所得的培养上清液，以制备液体酶。或者，可以将培养上清液通过冻干、喷雾干燥等转变为粉状酶，以制备粗制酶制剂。可以采用常规纯化方法，例如用硫酸铵盐析或溶剂沉淀，部分纯化本发明的α-琼脂糖酶和/或β-琼脂糖酶。此外，联合运用已知的纯化方法，例如柱色谱(例如离子交换柱和凝胶过滤柱)，可以获得在电泳时产生单一条带的纯化酶制剂。
通过将如此获得的培养物或不同纯化程度的本发明的α-琼脂糖酶，与作为底物的红藻中所含有的多糖(例如琼脂或琼脂糖)反应，可以生产琼脂寡糖，例如琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂己糖。
琼脂糖是一种其结构为D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖通过α-1，3键和β-1，4键交替连接在一起的多糖。β-琼脂糖酶是水解琼脂糖中β-1，4键的酶。通过该酶的作用产生的在其还原末端具有D-半乳糖的寡糖称为新琼脂寡糖，它不表现出诸如用琼脂寡糖所观察到的生理活性。如果使用切割琼脂糖中α-1，3键的α-琼脂糖酶，则可以产生在其还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖的琼脂寡糖。来源于解琼脂交替单胞菌GJ1B和弧菌属细菌(菌株JT0107-L4)的两种酶已知是α-琼脂糖酶。然而，由解琼脂交替单胞菌GJ1B产生的α-琼脂糖酶不能作用于琼脂己糖或更短的琼脂寡糖而所述弧菌属细菌来源的α-琼脂糖酶不能消化琼脂糖。因此，用这样的α-琼脂糖酶从原料-琼脂糖有效生产琼脂二糖或琼脂四糖是不可能的。
本发明人先前发现的WO 00/50578中所述的α-琼脂糖酶是作用于琼脂糖、琼脂己糖和比琼脂己糖长的琼脂寡糖的酶。因此，它们作用于琼脂糖，产生琼脂寡糖。此外，它们还可以切割由于所述作用而产生的琼脂己糖中的单一α-1，3键。利用所述酶，有可能生产琼脂二糖和琼脂四糖，它们是依照常规方法几乎不能生产的二糖和四糖。这些酶的最适反应温度为约40℃。琼脂糖通常以1％(w/v)的浓度使用。在这一浓度下，它于50℃不固化，但于40℃固化。也就是说，如果使用常规的酶，则高浓度的琼脂糖在所述酶的最适反应温度下固化，因此可能妨碍所述酶促反应。因此，难以有效地生产琼脂二糖或琼脂四糖。
另一方面，由于本发明的α-琼脂糖酶的最适反应温度为50℃，因此，可以将其用于在琼脂糖不固化的温度下进行反应。因此，这使得能够有效地生产琼脂寡糖。
由上述理化特性可见，本发明的α-琼脂糖酶是作用于琼脂糖、琼脂己糖和比琼脂己糖长的琼脂寡糖的酶。因此，它作用于琼脂糖，产生琼脂寡糖。此外，它可以切割由于所述作用而产生的琼脂寡糖中的α-1，3键，产生诸如琼脂二糖和琼脂四糖的更小的琼脂寡糖。另外，其最适温度高，并且热稳定性非常好。因此，运用本发明的α-琼脂糖酶，有可能大量获得依照常规方法一直难以生产的二糖和四糖-琼脂二糖和琼脂四糖，而不会由于琼脂糖固化而妨碍反应。
常规α-琼脂糖酶和本发明的α-琼脂糖酶的底物特异性示于表1。在该表中，符号+和-分别代表所述酶能够和不能消化所述底物。
表1底物琼脂糖琼脂己糖琼脂四糖解琼脂交替单胞菌 + --GJ1B弧菌属细菌(JT0107-L4)- ++琼脂糖酶1-7和+ +-琼脂糖酶4-3琼脂糖酶II + +-运用本发明的α-琼脂糖酶所产生的琼脂寡糖含有琼脂二糖和琼脂四糖。所述琼脂寡糖可以含有琼脂己糖或比琼脂己糖长的琼脂寡糖，只要其存在不干扰应用目的。例如，可以用琼脂、琼脂糖或者来源于琼脂或琼脂糖的琼脂寡糖作为原料，来用本发明的α-琼脂糖酶生产琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂己糖。所述α-琼脂糖酶作用所用的条件并无具体限制，只要所述酶在所用的条件下表现出其活性。例如，优选让琼脂糖酶II于pH6.0-8.0、45-55℃下作用。对于所述反应混合物的组成并无具体限制，只要它适合于所述酶的作用。
如上所述，运用本发明的α-琼脂糖酶所产生的寡糖主要是低聚合度的己糖或更短的寡糖。然而，通过适当选择反应条件等，有可能任选地产生具有不同聚合度的寡糖。通过分离和纯化如此获得的寡糖，也有可能独立地获得琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂己糖。
通过让如上所述获得的培养物或不同纯化程度的本发明β-琼脂糖酶作用于在红藻中所含有的多糖(例如琼脂或琼脂糖)，可以将琼脂或琼脂糖消化为琼脂寡糖，例如新琼脂二糖、新琼脂四糖和新琼脂己糖。
弧菌JT0107-1，4(JP-A 8-38172)和Pseudomonas altantica(Morrice，L.M.等，Eur.J.Biochem.，135，553-558(1983))来源的酶已知是β-琼脂糖酶。其最适反应温度为约30℃。如果用这样一种酶从琼脂糖凝胶中提取核酸等，则由于琼脂糖在所述酶表现出其活性的温度固化，而妨碍了所述反应。因此，它不能得到实际应用。已知黄杆菌菌株NR19(美国专利第5,869,310号)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)N-7(JP-B 7-97987)和弧菌(Vibrio sp.)PO-303(JP-A 8-294389)来源的酶的最适反应温度高于上述酶。然而，由于其最适温度(55℃或更低)低于低熔点琼脂糖凝胶的熔点(65℃)，因此对于实际应用仍有问题。
另一方面，本发明的β-琼脂糖酶在宽范围的温度(50-70℃)下表现出高活性，并且在55-65℃表现出最高活性。因此，它使得其中琼脂糖凝胶完全熔化的反应得以进行。此外，本发明的β-琼脂糖酶的98％的活性在于65℃处理30分钟后仍得以保留，表明它的热稳定性非常好。因此，应用本发明的β-琼脂糖酶使得能够从琼脂糖凝胶中有效地提取核酸等，而不会由于琼脂糖固化受到妨碍。这样的提取依照常规方法是困难的。
本发明的α-琼脂糖酶基因是编码具有上述α-琼脂糖酶活性的多肽的基因。因此，它是指含有编码具有α-琼脂糖酶活性的多肽的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。本发明的α-琼脂糖酶基因的实例包括含有来源于微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)的编码琼脂糖酶II的核苷酸序列的基因。编码琼脂糖酶II的基因的示例为具有编码由SEQ IDNO23中第318号氨基酸至第1089号氨基酸的772个氨基酸构成的多肽的核苷酸序列的基因。
本发明的α-琼脂糖酶基因也包括含有编码具有在上述氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加或插入的氨基酸序列并且具有α-琼脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。
另外，本发明的所述基因包括具有由SEQ ID NO21中第952号核苷酸至第3267号核苷酸的2316个核苷酸组成的核苷酸序列的基因。本发明的所述基因也包括含有具有在上述核苷酸序列中一个或多个核苷酸被取代、缺失、添加或插入的核苷酸序列并且编码具有α-琼脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。
此外，本发明的基因包括含有在严谨条件下与上述基因杂交并且编码具有α-琼脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。可以依照例如T.Maniatis等(编著)，Molecular CloningA Laboratory Manual 2nd ed.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory中所述的方法进行杂交。所述严谨条件的示例为与探针于65℃在含有6×SSC(1×SSC0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠，pH7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt氏液和100mg/ml鲱精DNA的溶液中保温过夜。
本发明的β-琼脂糖酶基因是编码具有上述β-琼脂糖酶活性的多肽的基因。因此，它是指含有编码具有β-琼脂糖酶活性的多肽的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。本发明的β-琼脂糖酶基因的实例包括含有来源于微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)的编码琼脂糖酶I的核苷酸序列的基因。编码琼脂糖酶I的基因的示例为具有编码由SEQ IDNO22中第21号氨基酸至第437号氨基酸的417个氨基酸残基构成的多肽的核苷酸序列的基因。
本发明的β-琼脂糖酶基因也包括含有编码具有在上述氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加或插入的氨基酸序列并且具有β-琼脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。
另外，本发明的所述基因包括具有由SEQ ID NO20中第61号核苷酸至第1311号核苷酸的1251个核苷酸组成的核苷酸序列的基因。本发明的所述基因也包括含有在上述核苷酸序列中一个或多个核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列并且编码具有β-琼脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。
此外，本发明的所述基因包括含有在严谨条件下与上述基因杂交并且编码具有β-琼脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。所述严谨条件的示例为如上所述的那些条件。
例如，本发明的琼脂糖酶基因可以如下克隆。
从产生琼脂糖酶的微生物中制备基因组DNA。可以依照合适的已知方法，制备基因组DNA。例如，可以联合使用已知方法，例如溶菌酶处理、蛋白酶处理、RNA酶处理、苯酚处理和乙醇沉淀，制备基因组DNA。采用合适的已知方法，例如超声处理或用限制性酶消化，降解如此获得的基因组DNA。依照构建重组DNA分子的常规方法，将所得的DNA片段掺入到载体(例如质粒载体)中。然后将所述重组DNA分子导入合适的宿主(例如大肠杆菌)中，获得转化子。可以从常规方法中选择适用于待使用的载体和宿主的用于构建重组DNA分子、转化等的方法，例如在Molecular CloningA Laboratory Manual 2nd ed.中描述的那些方法。因此，获得含有带有琼脂糖酶基因的转化子的基因组文库。
接着，筛选基因组文库，以选择带有所述琼脂糖酶基因的转化子。从可以所述转化子中分离出所述琼脂糖酶基因。筛选方法的实例如下。
(1)用琼脂糖酶活性的表达作为指标进行筛选让基因组文库在琼脂平板上生长。带有琼脂糖酶基因的转化子表达具有琼脂糖酶活性的多肽。所述多肽通过其琼脂糖酶活性的作用，溶解琼脂凝胶。因此，选择在琼脂平板溶解琼脂凝胶的菌落或噬斑。
(2)用抗体进行筛选如上所述制备粗制、部分纯化或纯化的琼脂糖酶酶制剂。用所述制剂作为抗原，依照常规方法制备抗琼脂糖酶抗体。
让基因组文库在平板上生长。将生长的菌落或噬斑转移到尼龙滤膜或硝化纤维素滤膜上。已表达的重组蛋白与所述菌落或噬斑一起被转移到所述滤膜上。让滤膜上的重组蛋白与所述抗琼脂糖酶抗体反应，以鉴定与所述抗体反应的克隆。
可以依照已知方法，例如通过使过氧化物酶缀合第二抗体与已经与所述抗琼脂糖酶抗体反应的滤膜反应，让所述滤膜与显色底物一起保温，然后检测所显现出的颜色，可以鉴定与所述抗体反应的克隆。
如果使用导致在所述载体中所掺入的DNA中的基因高表达的表达载体，来构建在上述方法(1)或(2)中使用的基因组文库，则可以容易地选择带有目标基因的转化子。
(3)通过用DNA探针杂交进行筛选让基因组文库在平板上生长。将生长的菌落或噬斑转移到尼龙滤膜或硝化纤维素滤膜上。将DNA通过变性固定化到所述滤膜上。依照常规方法，让滤膜上的DNA与标记探针杂交，以鉴定与所述探针杂交的克隆。
用于这种筛选的探针包括基于上述琼脂糖酶的氨基酸序列的信息制备的寡核苷酸、基于另一氨基酸序列的信息制备的寡核苷酸、和用基于这样的氨基酸序列的信息制备的引物所扩增的PCR片段。用于所述探针的标记的实例包括但不限于放射性同位素标记、荧光标记、洋地黄毒苷标记和生物素标记。
富集了如下制备的带有琼脂糖酶基因的转化子的基因组文库，可以用作供所述筛选用的基因组文库。
依照常规方法，从产生琼脂糖酶的微生物中制备基因组DNA，用合适的限制性酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳分离，然后转印到尼龙滤膜或硝化纤维素滤膜上。依照常规方法，让滤膜上的DNA与上述标记探针杂交，以检测与所述探针杂交的DNA片段。从所述琼脂糖凝胶中提取和纯化对应于所述信号的DNA片段。
依照常规方法，将如此获得的DNA片段掺入到载体(例如质粒载体)中，构建重组DNA分子。然后将所述重组DNA分子导入合适的宿主(例如大肠杆菌)中，获得转化子。可以从常规方法中选择适用于待使用的载体的转化方法，例如在Molecular CloningA LaboratoryManual 2nd ed.中描述的那些方法。因此，获得富集了带有琼脂糖酶基因的转化子的基因组文库。
使用这样一种基因组文库，可以更有效地进行筛选。
可以在如上所述的方法(1)-(3)中筛选转化子，克隆目标基因。通过运用PCR，可以在体外进行克隆，而无需利用转化子。
从产生琼脂糖酶的微生物中制备基因组DNA。用基因组DNA作为模板，使用基于所述琼脂糖酶的氨基酸序列的信息制备的一对引物，进行PCR。因此，可以获得含有琼脂糖酶基因的DNA片段。此外，例如通过用所述片段作为探针进行杂交，或者用基于所述片段的核苷酸序列制备的引物进行PCR，可以获得全长琼脂糖酶基因。可以依照已知方法，测定如上所述获得的基因的核苷酸序列。如果所述克隆不编码完整的琼脂糖酶多肽，则通过重复包括基于所述已测定核苷酸序列制备新探针和用所述探针筛选基因组文库获得新克隆的程序，揭示所述琼脂糖酶的完整可读框(ORF)。例如，基于如此获得的信息，可以制备含有编码所述琼脂糖酶的完整ORF的克隆。
通过基因工程，通过将如上所述获得的编码所述琼脂糖酶的基因与合适的表达载体连接，可以大量生产具有琼脂糖酶活性的多肽。
以下简述用于获得本发明的基因的方法。
用溶菌酶裂解通过培养微生物NAB2-1-1而获得的细胞，然后除去蛋白质、经过乙醇沉淀等，获得染色体DNA。NAB2-1-1染色体DNA用限制性酶完全消化。将对应于所述限制性酶的连接物与已消化的DNA连接。用所得的染色体DNA作为模板，使用基于本发明的琼脂糖酶I或II的N末端氨基酸序列或内部氨基酸序列制备的引物以及对应于所述连接物的核苷酸序列的引物，进行PCR。
通过分析如上所述获得的PCR产物的核苷酸序列，可以确定编码本发明的琼脂糖酶的核苷酸序列。如果不能测定所述完整序列，则可以重复上述程序。或者，用染色体DNA作为模板，可以进行引物步查。
基于所述琼脂糖酶的氨基酸序列设计的引物可以是混合引物。或者，用基于所述N末端氨基酸序列和内部氨基酸序列制备的引物，用NAB2-1-1染色体DNA作为模板，通过PCR获得扩增产物，可以使用基于所述扩增产物的核苷酸序列制备的新引物。
如此获得的编码琼脂糖酶II的基因具有编码由1089个氨基酸构成的多肽的ORF。所述ORF的核苷酸序列示于SEQ ID NO21。由所述ORF的核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO23。在所述基因的核苷酸序列中，发现了对应于P2(琼脂糖酶II的N末端氨基酸序列)的核苷酸序列、编码具有信号肽样序列的26个氨基酸的上游核苷酸序列、和更上游区中的SD样序列。
因此，SEQ ID NO23的氨基酸序列是本发明α-琼脂糖酶的一个实例。该氨基酸序列与先前测定的琼脂糖酶II的N末端氨基酸序列的比较表明，琼脂糖酶II是一种由SEQ ID NO23的氨基酸序列中第27号氨基酸至第1089号氨基酸的氨基酸序列构成的多肽，并且所述氨基酸序列由SEQ ID NO21的核苷酸序列中第79号核苷酸至第3270号核苷酸(包括终止密码子)的核苷酸序列所编码。
在所述ORF中发现了三个推定的钙结合区(171-184、271-283和987-999)。
所述编码琼脂糖酶I的基因有一个编码由438个氨基酸构成的多肽的ORF。所述ORF的核苷酸序列示于SEQ ID NO20。由所述ORF的核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO22。在所述基因的核苷酸序列中，发现了对应于P1(琼脂糖酶I的N末端氨基酸序列)的核苷酸序列、编码20个氨基酸的上游核苷酸序列、和更上游区中的SD样序列。
因此，SEQ ID NO22的氨基酸序列是本发明的琼脂糖酶的一个实例。该氨基酸序列与先前测定的琼脂糖酶I的N末端氨基酸序列的比较表明，琼脂糖酶I是一种由SEQ ID NO22的氨基酸序列中第21号氨基酸至第438号氨基酸的氨基酸序列构成的多肽，并且所述氨基酸序列由SEQ ID NO20的核苷酸序列中第61号核苷酸至第1314号核苷酸(包括终止密码子)的核苷酸序列所编码。
如上所述获得的琼脂糖酶I的氨基酸序列与得自黄杆菌菌株NR19的已知β-琼脂糖酶的氨基酸序列仅有33％的同源性。因此，认为本发明的琼脂糖酶I具有绝对新颖的序列。
通过将编码本发明的琼脂糖酶的基因(例如编码琼脂糖酶I或琼脂糖酶II的基因)与合适的载体连接，可以构建重组DNA分子。此外，通过将所述重组DNA分子导入合适的宿主中，可以制备转化子。用通过培养所述转化子所获得的培养物，生产本发明的琼脂糖酶。因此，有可能用所述转化子大量生产本发明的琼脂糖酶(例如琼脂糖酶I或琼脂糖酶II)。
通过依照已知方法，在编码琼脂糖酶的基因中引入突变，可以产生突变型琼脂糖酶。可以使用的用于引入突变的方法的实例包括但不限于寡核苷酸双琥珀法(Hashimoto-Gotoh，T.等，Gene，152271-275(1995))、带缺口的双链体法(the gapped duplex method)(Kramer，W.等，Nucl.Acids Res.，129441(1984)；Kramer，W.等，Methods in Enzymology，154350(1987))和Kunkel法(Kunkel，T.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488(1985)；Kunkel，T.A.，Methods in Enzymology，154367(1987))。
通过表达编码在待表达的琼脂糖酶的N末端添加信号序列的多肽的基因，可以使目标琼脂糖酶分泌到转化子外。所述信号序列并不限于具体的信号序列，其示例为由SEQ ID NO22中第1号氨基酸至第20号氨基酸所示的琼脂糖酶I的信号序列。这一信号序列由SEQ IDNO22中的第1号核苷酸至第60号核苷酸的核苷酸序列编码。或者，所述信号序列的示例为由SEQ ID NO23中第1号氨基酸至第26号氨基酸所示的琼脂糖酶I的信号序列。这一信号序列由SEQ ID NO21中的第1号核苷酸至第78号核苷酸的核苷酸序列编码。
可以用来构建重组DNA分子的载体的示例包括但不限于质粒载体、噬菌体载体和病毒载体。可以根据使用所述重组DNA的目的，选择合适的载体。如果构建重组DNA分子以生产琼脂糖酶，则优选含启动子和/或供表达控制用的其它区的载体。这样的质粒载体的实例包括但不限于pKF19k、pT7BlueT和pET16b。可以用于制备转化子的宿主包括但不限于诸如细菌、酵母和丝状真菌的微生物以及哺乳动物、鱼类、昆虫等的培养细胞。用适合于所述宿主的载体构建的重组DNA分子来构建转化子。
以下简述通过基因工程生产琼脂糖酶I的方法。
将含有编码具有例如始于SEQ ID NO22的第21号氨基酸的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的DNA片段，插入到合适的质粒载体(例如pKF19k(Takara Shuzo)、pT7BlueT(Takara Shuzo)或pET16b(TakaraShuzo)中，构建质粒。在合适的液体培养基中，培养用这样的质粒转化的大肠杆菌(例如大肠杆菌JM109或BL21(DE3)pLysS)。如有需要，用IPTG等进行诱导。让所述质粒中所插入的DNA片段所编码的多肽表达。单位体积的培养物中由这种转化子表达的β-琼脂糖酶活性通常高于用NAB2-1-1培养物所观察到的所述活性。
对于琼脂糖酶II，用编码具有例如始于SEQ ID NO23的第27、181或318号氨基酸的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的DNA片段，通过如上关于琼脂糖酶I所述的基因工程，可以制备表达琼脂糖酶II的转化子。所得的转化子表达α-琼脂糖酶活性，单位体积的培养物中的所述活性通常高于用NAB2-1-1培养物所观察到的所述活性。
如上所述通过基因工程生产的本发明的琼脂糖酶，可以通过常规纯化方法例如用硫酸铵盐析或溶剂沉淀进行部分纯化。此外，联合运用已知的纯化方法，例如柱色谱(例如阴离子交换柱或凝胶过滤柱)，可以获得电泳时产生单一条带的纯化酶制剂。
如果通过基因工程生产的本发明的琼脂糖酶不溶解，则可以依照已知方法将其溶解并回收。
通过让如此获得的不同纯化程度的本发明重组α-琼脂糖酶与作为底物的红藻中所含有的多糖(例如琼脂或琼脂糖)反应，可以生产琼脂寡糖，例如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂己糖和琼脂辛糖。
例如，通过用1％(w/v)琼脂糖作为底物，于50℃反应16小时，可以生产所述琼脂寡糖。
同样，通过让如此获得的不同纯化程度的本发明的重组β-琼脂糖酶作用于已经经过核酸等电泳的琼脂糖凝胶，可以有效地提取琼脂糖凝胶中的物质(例如核酸)。
例如，在于1％(w/v)或3％(w/v)琼脂糖凝胶上电泳的情况下，通过让本发明的重组β-琼脂糖酶于67℃作用于含有目标物质的琼脂糖凝胶达10分钟，可以有效地提取所述凝胶中的物质。
通过从N末端缺失所述ORF的至多30％，可以改进本发明的琼脂糖酶的热稳定性。待缺失区并无具体限制，只要它至多为所述ORF的30％(例如10％、20％等)。例如，通过从N末端缺失琼脂糖酶II的29.1％(即317个氨基酸)，可以改进琼脂糖酶II的热稳定性。在钙存在下观察到特别显著的热稳定性的改进。
对于用于缺失N末端部分以改进热稳定性的方法并无具体限制。它可以通过用蛋白酶处理或者通过用基因工程技术来进行。
实施例以下实施例更详细地说明本发明，但不应解释为限制本发明的范围。
实施例1活性测定方法当纯化本发明的琼脂糖酶时，通过用Agarose LO3(Takara Shuzo)作为底物进行酶促反应，然后用高效液相色谱定量测定所得的琼脂四糖或新琼脂四糖，测定纯化的或者部分纯化的所述酶制剂的活性。以下详细描述所述程序。
制备在含有10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)(就琼脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化钙和10mM氯化钠的20mMTris-HCl缓冲液(pH7.2)(就琼脂糖酶II而言)中含有0.2％(w/v)或0.5％(w/v)浓度的琼脂糖的溶液。将作为底物的180μl该溶液与20μl酶溶液混合。让混合物于50℃反应5-30分钟，优选反应10分钟，然后在沸水中或于75℃加热1分钟以终止反应。让30μl所述反应混合物经过TSKgel α-2500柱(内径7.8mm；长度300mm；Tosoh)。用70％乙腈溶液作为洗脱液，以0.8ml/分钟的流速进行洗脱。定量测定由于酶促反应产生的以约25分钟的保留时间洗脱出的琼脂四糖或者以约24分钟的保留时间洗脱出的新琼脂四糖。一个单位(1U)定义为在10分钟内产生1μmol琼脂四糖或新琼脂四糖的酶量。
实施例2从NAB2-1-1生产琼脂糖酶制备100ml人工海水(商品名Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入浓度分别为0.3％(w/v)和0.02％(w/v)的蛋白胨(Difco)和酵母膏(Difco)。然后用3M碳酸钠将pH调至7.8。将所得的混合物转移到500ml锥形瓶中。向其中加入0.4g NuSieve GTG Agarose(Takara Shuzo)。用高压灭菌器灭菌后，将NAB2-1-1接种到所述混合物中，于37℃以120rpm培养过夜。所得的培养物用作预培养物。
如下进行主培养。在5,000ml小型发酵容器中制备3,000ml人工海水(商品名Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入浓度分别为0.3％(w/v)和0.02％(w/v)的蛋白胨(Difco)和酵母膏(Difco)。然后将pH调至7.8。向其中加入12g NuSieve GTG Agarose(Takara Shuzo)。混合物用高压灭菌器灭菌。将30ml预培养物接种到所述混合物中，于37℃以250rpm培养18小时。然后将培养物以8,000×g离心20分钟，收集约3,000ml已经除去了细胞的上清液。
以下操作于4℃或4℃以下进行。
将上清液置于透析膜(Sanko Junyaku)中，于约500g聚乙二醇中浸泡两夜，以将其浓缩约10倍。将300ml浓缩液对缓冲液I(含有10mM氯化钙和10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2))透析以便脱盐。
将透析液上样至已经用所述缓冲液平衡的填充阴离子交换树脂DEAE Toyopearl 650M(Tosoh)的柱(?2.0cm×12cm)上。柱子用约120ml缓冲液I洗涤。收集不吸附流分和洗涤流分(约400ml)，将其合并作为琼脂糖酶I级分。用10mM至1,000mM氯化钠的线性梯度(总洗脱体积400ml)进行洗脱。收集在300mM-600mM氯化钠浓度洗脱出的约160ml的流分，作为琼脂糖酶II级分。
将琼脂糖酶I级分和琼脂糖酶II级分对缓冲液II(含有10mM氯化钙、10mM氯化钠、5％甘油和1mM PMSF的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2))透析以便脱盐。
如下对琼脂糖酶II级分进行进一步纯化。将经透析的琼脂糖酶II级分上样至填充25ml QAE Toyopearl 550C(Tosoh)的柱(?2.0cm×8.0cm)上。在这种情况下，用10mM至800mM氯化钠的线性梯度(总洗脱体积250ml)进行洗脱。获得于约500mM洗脱出的约70ml的流分。将该流分对缓冲液II透析，用离心超滤膜CENTRIPREP-10(Amicon)浓缩至约1ml。用以缓冲液II平衡的填充Sephadex G-100(Pharmacia)的柱(?0.8cm×50cm)对浓缩液进行凝胶过滤。获得约20ml的琼脂糖酶II级分。再次用超滤膜将该级分浓缩至约1ml的体积。
经纯化的蛋白在含十二烷基硫酸钠(SDS)的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，表明所述蛋白被纯化至几乎均质。总活性约为150U。
如下对琼脂糖酶I级分进行进一步纯化。
让经透析的琼脂糖酶I级分(约400ml)吸附到已经用缓冲液II平衡的填充CM Toyopearl 650(Tosoh)的柱(?2.0cm×9.5cm)上。用10mM至1,000mM氯化钠的线性梯度(总洗脱体积300ml)进行洗脱。收集在至多300mM氯化钠浓度洗脱出的约90ml的琼脂糖酶I级分。将该级分对含有1.0M硫酸铵的缓冲液II透析过夜，上样至用同一缓冲液平衡的填充30ml Butyl Toyopearl 650M(Tosoh)的柱(?2.0cm×9.5cm)上。用1.0M至0M硫酸铵的梯度(总洗脱体积300ml)进行洗脱。回收300mM至0M浓度下洗脱出的琼脂糖酶I级分(约60ml)。同琼脂糖酶II一样，将所述级分对缓冲液II透析，用离心超滤膜CENTRIPREP-10(Amicon)浓缩至约1ml的体积。
经纯化的蛋白在含十二烷基硫酸钠(SDS)的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，表明所述蛋白被纯化至几乎均质。总活性约为310U。
实施例3酶的各种特性的检查[与琼脂糖酶I和琼脂糖酶II反应的产物的鉴定]用琼脂糖酶I或琼脂糖酶II的纯化酶，对20μl在含有10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)(就琼脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化钙和10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)(就琼脂糖酶II而言)中含有0.5％(w/v)浓度的琼脂糖的溶液进行消化。让消化产物经过凝胶过滤柱(Tosoh，TSKgel α-2500)，用70％乙腈作为洗脱液。结果，在约24分钟和约28分钟处观察到琼脂糖酶I的主峰。基于所观测到的标准品的保留时间，认为这些峰分别对应于新琼脂四糖和新琼脂己糖。对于使用琼脂糖酶II的消化产物，在约22分钟、约25分钟和约29分钟的保留时间处观察到主峰。基于所观测到的标准品的保留时间，认为这些峰分别对应于琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂己糖。通过对其进行薄层色谱，使用组成为氯仿∶甲醇∶乙酸＝3∶3∶1的展开剂进行两轮展层，证实了所述反应产物。三种琼脂寡糖即琼脂二糖(Rf值＝0.76)、琼脂四糖(Rf值＝0.50)和琼脂己糖(Rf值＝0.33)以及两种新琼脂寡糖即新琼脂四糖(Rf值＝0.59)和新琼脂己糖(Rf值＝0.41)用作对照。结果，用苔黑酚-硫酸，在对应于用琼脂糖酶I获得的反应产物的新琼脂寡糖的位置上，观测到显色物质。在对应于用琼脂糖酶II获得的反应产物的琼脂寡糖的位置上，观测到显色物质。这些结果表明，琼脂糖酶I是一种水解琼脂糖分子中D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖之间的β-1，4键产生新琼脂寡糖的β-琼脂糖酶，而琼脂糖酶II是一种水解琼脂糖分子中的α-1，3键产生琼脂寡糖的α-琼脂糖酶。
将琼脂糖酶I溶液和琼脂糖酶II溶液对无钙缓冲液(含有10mM氯化钠和1mM EDTA的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2))透析过夜。向其中加入在含有10mM氯化钠和1mM EDTA的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)中含有0.2％(w/v)浓度的琼脂糖的溶液。让混合物于50℃反应10分钟。通过在沸水中加热1分钟(就琼脂糖酶I而言)或于75℃加热1分钟(就琼脂糖酶II而言)终止反应。然后，测量活性。将用含钙的常规缓冲液进行反应时所观测到的活性定义为100％。结果，琼脂糖酶I和琼脂糖酶II分别表现出约100％和约60％的其活性。
酶失活受到抑制并且对于琼脂糖酶I和琼脂糖酶II而言反应容易进行的温度分别是50-65℃和45-55℃。
将所述酶溶液于48℃、50℃、55℃、60℃或65℃加热给定时间。然后，向所述经加热的溶液中加入在含有10mM氯化钠的20mMTris-HCl缓冲液(pH7.2)(就琼脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化钙和10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)(就琼脂糖酶II而言)中含有0.2％(w/v)浓度的琼脂糖的溶液。让混合物于50℃反应10分钟。通过在沸水中加热1分钟(就琼脂糖酶I而言)或于75℃加热1分钟(就琼脂糖酶II而言)终止反应。然后，测量活性。将于50℃常规反应10分钟时所观测到的活性定义为100％。结果，琼脂糖酶I在于65℃处理60分钟之后表现出其活性的约85％，琼脂糖酶II在于55℃处理10分钟后表现出其活性的约40％。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量。依照常规方法，用含有SDS的10-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶和分子量标记(Bio-Rad，肌球蛋白(MW 200,000)、β-半乳糖苷酶(MW 116,250)、磷酸化酶b(MW97,400)、牛血清白蛋白(MW 66,200)、卵清蛋白(MW 45,000)、碳酸酐酶(MW 31,000)、胰蛋白酶抑制剂(MW 21,500)、溶菌酶(MW 14,400))，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。根据迁移率测定，琼脂糖酶I和琼脂糖酶II的分子量分别为约48,000和约117,000。
依照Edman降解法，测定琼脂糖I和琼脂糖酶II的氨基末端氨基酸序列。用10-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶，对含有对应于约10pmol酶蛋白的琼脂糖酶I或琼脂糖酶II的纯化酶制剂溶液进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶上分离的酶转印到膜ProBlot(Applied Biosystems)。用蛋白测序仪G1000A(Hewlett Packard)，分析所述膜中已经吸附有所述酶的部分。结果，所测定的琼脂糖酶I的氨基末端氨基酸序列(P1；SEQID NO1)和琼脂糖酶II的氨基末端氨基酸序列(P2；SEQ ID NO2)分别为Ala-Asp-Xaa-Asp-Gly-Val-Pro-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly和Glu-Thr-Ile-Val-Leu-Gln-Ala-Glu-Ser-Phe。
用2mmol纯化的琼脂糖酶I或II，进行半胱氨酸残基的羧甲基化。用HPLC从通过用赖氨酰内肽酶消化所获得的消化产物中，分离和纯化肽片段。对于所述柱使用μBondasphare C8(Waters)，用溶液A(0.1％TFA)和溶液B(含0.1％TFA的80％乙腈)进行洗脱。通过将溶液B的比率在50分钟内以线性方式从0％提高至100％，以0.5ml/分钟的流速进行洗脱。于214nm进行检测，以便收集流分。对相应的肽流分进行氨基酸序列分析。对于琼脂糖酶I，测定部分氨基酸序列PI3(SEQ IDNO3)和PI4(SEQ ID NO4)。对于琼脂糖酶II，测定部分氨基酸序列PII5(SEQ ID NO5)、PII6(SEQ ID NO6)和PII7(SEQ ID NO7)。
实施例4琼脂寡糖的生产向2ml反应用缓冲液(含有10mM氯化钙和10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2))中加入Agarose LO3，终浓度为1.0％(w/v)。再向其中加入约1.0U琼脂糖酶II的纯化制剂。让混合物于50℃反应16小时。反应后，反应混合物通过0.22μm滤膜(Millipore)过滤。用高效液相色谱，在与实施例1中测量本发明所述酶的活性所用条件相同的条件下，分析经过滤的反应混合物，以测定所产生的琼脂寡糖。结果，在反应混合物中检测到琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂己糖。因此，证明上述酶促反应产生这些较小的琼脂寡糖。
实施例5新琼脂寡糖的生产向2ml反应用缓冲液(含有10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2))中加入Agarose LO3，终浓度为1.0％(w/v)。再向其中加入约1.0U琼脂糖酶I的纯化制剂。让混合物于65℃反应16小时。反应后，反应混合物通过0.22μm滤膜(Millipore)过滤。用高效液相色谱，在与实施例1中测量本发明所述酶的活性所用条件相同的条件下，分析经过滤的反应混合物，以测定所产生的新琼脂寡糖。结果，在反应混合物中检测到新琼脂四糖和新琼脂己糖。因此，证明上述酶促反应产生这些较小的新琼脂寡糖。
实施例6用琼脂糖酶I从琼脂糖凝胶中回收核酸用1μg DNA分子量标记-λHindIII(Takara Shuzo)在1.0％(w/v)SeaPlaque GTG琼脂糖凝胶上进行电泳。切割含有分离的大小约4.4kbp和约6.6kbp的DNA片段的凝胶，将其置于1.5ml Eppendorf管中。向其中加入1ml反应缓冲液(含50mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2))。让混合物于室温静置10分钟。然后弃去缓冲液，将凝胶留在管中。将管于67℃保温5分钟，以熔化凝胶。向其中加入1.0U纯化的琼脂糖酶I。将混合物于室温保温10分钟。将Eppendorf管置于冰上，以证实琼脂糖酶凝胶完全溶解。然后依照常规方法进行乙醇沉淀，回收所述DNA片段。同样，对DNA分子量标记-100bp分子量梯式标记(Ladder Marker)(Takara Shuzo)进行从3.0％(w/v)NuSieveGTG琼脂糖凝胶回收DNA。在这种情况下，回收了400bp和500bp的DNA片段。所述DNA回收率与Pseudoaltermonas atlantica(TakaraShuzo)来源的市售β-琼脂糖酶的回收率的比较结果示于表2中。
如果使用所述市售β-琼脂糖酶，则在加入所述酶之前，应该将温度从熔化琼脂糖凝胶所用的温度降至所述酶可以作用的温度。由于反应温度低，因此需要的反应时间长，延长所述程序所用的时间。
另一方面，如果使用本发明的琼脂糖酶I，则可以在熔化琼脂糖凝胶之后立即加入所述酶。由于反应可以在高温下进行而无需降低温度，所以所述程序仅需要短时间。
表2回收率(％)*标记 所回收的DNA 琼脂糖酶Iβ-琼脂糖酶片段的大小(市售的)λ-HindIII 4.4kbp 78 516.6kbp 86 55100bp分子量梯 400bp84 32500bp81 45所需时间**约30分钟 约3小时*DNA回收量/DNA上样量×100。
**直至乙醇沉淀所需的时间。
实施例7从NAB2-1-1制备染色体DNA制备1升人工海水(商品名Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入浓度分别为0.3％(w/v)和0.02％(w/v)的蛋白胨(Difco)和酵母膏(Difco)。然后用3M碳酸钠将pH调至7.8。向其中加入0.1％(w/v)浓度的琼脂(Nacalai Tesque)。用高压灭菌器将混合物灭菌。将10μl产琼脂糖酶的菌株NAB2-1-1的甘油储液接种到2ml所述培养基中，于37℃培养过夜。将1ml所述培养物接种到100ml同一种培养基中，于37℃培养过夜。以8,000×g离心10分钟收集细胞。将细胞悬浮于10ml缓冲液A(含有100mM NaCl和10mM EDTA(pH8.0)的100mMTris-HCl缓冲液(pH8.0))中。向其中加入0.25ml的溶菌酶溶液(20mg/ml)。让混合物于37℃保温1小时。然后向其中加入含有5.0％浓度的SDS的2.5ml缓冲液A。让所得混合物于60℃在振荡下保温20分钟。向其中加入1.5ml蛋白酶K溶液(20mg/ml)。让混合物于37℃保温过夜。然后向混合物中加入几乎等体积的苯酚，将所得的混合物于室温温和振荡约10分钟。将混合物以2,000×g离心10分钟。将上清液转移到冷乙醇中。用玻璃棒缠绕染色体DNA。向从中缠绕了染色体DNA的溶液中加入几乎等体积的苯酚，进行同样的程序，以再次缠绕染色体DNA。将染色体DNA悬浮于10μl缓冲液A中。向其中加入50μl RNA酶A溶液(10mg/ml)，让混合物于37℃保温10分钟。通过乙醇沉淀从溶液中回收染色体DNA，将其悬浮于5ml缓冲液B(含有140mM NaCl和1mM EDTA(pH7.5)的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5))中。将悬浮液对同一种缓冲液透析过夜。则获得约5.0mg染色体DNA。根据OD260nm/280nm，测定所述DNA的纯度。在每种情况下所述数值都是约1.8。用所述染色体DNA如下所述克隆琼脂糖酶I和琼脂糖酶II。
实施例8琼脂糖酶I基因的克隆依然实施例3中所述测定的琼脂糖酶I的N末端氨基酸序列P1(SEQ ID NO1)，设计混合引物1和2(SEQ ID NO8和9)，用DNA合成仪合成，并进行纯化。具体地说，SEQ ID NO8和9所示的混合引物1和2分别对应于氨基酸序列P1中第4-10号和第4-13号氨基酸的氨基酸序列。用这些引物和LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)进行所述琼脂糖酶I基因的克隆。
如下进行初次PCR。在实施例7中制备的染色体DNA用限制性酶BamHI完全消化。用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo)，将BamHI连接物连接到所述经消化的DNA的末端。将其一部分置于0.5ml PCR用试管中。向其中加入5μl 10×LA PCR缓冲液、8μl dNTP混合物、1μl混合引物1、1μl引物C1(LA PCR体外克隆试剂盒(TaKaRa Shuzo)所附的引物)、0.5μl TaKaRa LA Taq和无菌水至50μl。在溶液上铺上50μl矿物油之后，用自动基因扩增仪器热循环仪(Takara Shuzo)使所述试管进行反应。于94℃变性2分钟之后，进行30个循环的PCR。每个循环由94℃变性1分钟、引物于50℃退火2分钟和于72℃合成反应2分钟组成。
接着，用所述反应混合物作为模板进行二次PCR。除用通过初次PCR获得的1μl反应混合物作为模板以及使用混合引物2和引物C2(LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)所附的引物)组合之外，在与初次PCR所用条件相同的条件下进行PCR。在PCR之后，除去矿物油上层，用5μl反应混合物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，然后所述DNA用溴化乙锭染色，以证实扩增产物。结果，观察到约0.8kb的DNA片段。所述DNA片段被命名为βN。
将从琼脂糖凝胶上切取的扩增片段βN与载体pT7Blue连接，用来转化大肠杆菌JM109。依照双脱氧链终止法，用转化子测定扩增片段βN的所述末端区的核苷酸序列。根据所述N末端区的序列，设计引物3和4(SEQ ID NO10和11)。根据除所述N末端区之外的末端区的序列，设计引物5和6(SEQ ID NO12和13)。用DNA合成仪合成所述引物，然后纯化。运用这些引物和LA PCR体外克隆试剂盒(TakaraShuzo)，以相似的方式克隆βN上游和下游的DNA片段。在这种情况下，引物于55℃退火1分钟。
对于上游区，用引物3和4获得约0.6kb的DNA片段，将其命名为βUN。对于βN下游的区，用引物5和6获得约1.3kb的DNA片段，将其命名为βC。将βUN和βC两者与载体pT7Blue(Novagen)连接。依照双脱氧链终止法，测定核苷酸序列。分析DNA片段βN、βUN和βC的核苷酸序列，并进行序列比对。结果发现一个编码由438个氨基酸构成的蛋白的ORF。
所述ORF的核苷酸序列和由所述ORF的核苷酸序列所编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO20和22。发现在βUN中，存在一个氨基酸序列P1的核苷酸序列、一个编码氨基酸序列P1上游的20个氨基酸的核苷酸序列和更上游区中的一个SD样序列。
在实施例3中测定的N末端氨基酸序列P1对应于SEQ ID NO22中第21-33号氨基酸的序列。在实施例3中测定的部分氨基酸序列PI3(SEQ ID NO3)和PI4(SEQ ID NO4)分别与SEQ ID NO22中的第265-272号氨基酸和第367-376号氨基酸的序列匹配。
实施例9琼脂糖酶II基因的克隆根据如实施例3中所述测定的琼脂糖酶II的N末端氨基酸序列P2(SEQ ID NO2)和PII6(SEQ ID NO6)，设计混合引物7和8(SEQ IDNO14和15)。它们与相互不同的链杂交。用DNA合成仪合成所述混合引物，并进行纯化。
具体地说，SEQ ID NO14所示的混合引物7对应于氨基酸序列P2的第1-8号氨基酸，SEQ ID NO15所示的混合引物8对应于编码氨基酸序列PII6中第2-10号氨基酸的DNA的互补链。
用这些引物和LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)进行所述琼脂糖酶II基因的克隆。
如下进行初次PCR。将在实施例7中制备的10ng NAB2-1-1染色体DNA置于0.5ml PCR用试管中。向其中加入5μl 10×LA PCR缓冲液、8μl dNTP混合物、混合引物7和8各40pmol、0.5μl TaKaRa LATaq和无菌水至50μl。在溶液上铺上50μl矿物油之后，用自动基因扩增仪器热循环仪(Takara Shuzo)使所述试管进行反应。于94℃变性2分钟之后，进行30个循环的PCR。每个循环由94℃变性1分钟、引物于50℃退火2分钟和于72℃合成反应2分钟组成。除去矿物油上层，用5μl反应混合物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，然后所述DNA用溴化乙锭染色，以证实扩增产物。结果，观察到约600bp的DNA片段。所述DNA片段被命名为αN。
将从琼脂糖凝胶上切取的扩增片段αN与载体pT7Blue连接，用来转化大肠杆菌JM109。依照双脱氧链终止法，用转化子测定扩增片段αN的所述末端区的核苷酸序列。根据N末端区的序列，设计引物9和10(SEQ ID NO16和17)。根据除所述N末端区之外的末端区的序列，设计引物11和12(SEQ ID NO18和19)。用DNA合成仪合