专利名称：一株具有双重噬菌体抗性的l-苯丙氨酸生产菌及其选育方法噬菌体污染是影响氨基酸发酵生产的关键因素之一。如果在生产中受到噬菌体 的污染，会影响生产率，从而影响企业效益。其来源很多，在相对较长的发酵周期中， 无论哪个环节发生污染，都会对整个过程造成影响。多年来，企业在噬菌体在生产过程 对噬菌体的防治上积累了大量的经验，但选育抗噬菌体的生产菌株才是最有效的方法。本实验室前期开发了 一株L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR42 (CCTCC M 2010008)， 该菌株具有噬菌体BP-1(CCTCC M 2010054)抗性，但在实际生产中发现该菌种又受到了 噬菌体 BP_2(CCTCC M 2010055)的污染。利用诱变手段筛选抗噬菌体的菌株是选育抗性菌株的方法之一。由于现在所知 的诱变方法已有很多，其对机理方面的要求也不高，人们在对诱变方法的选用上已有了 很多的经验。但往往用诱变手段选育菌种具有一定的盲目性，是一件耗时耗力的工作。 在筛选抗噬菌体抗性的大肠杆菌方面，本发明提出在诱变后培养阶段利用噬菌体淘汰培 养的方法，就如何快速有效的获得目的菌株而言提供了一条新的途径。
本发明所要解决的一个技术问题是提供一株重组大肠杆菌WSH-BR165 (pAP-B03)，该菌株具有对重组大肠杆菌易感染噬菌体BP-I (CCTCC M 2010054,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2010年3月15日，地址中国武汉，武 汉大学，分类学命名为大肠杆菌噬菌体QBacteiiopMge))和BP-2的(CCTCC M 2010055，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2010年3月15日，地址中国 武汉，武汉大学，分类学命名为大肠杆菌噬菌体(^ac—opMge))双重抗性；含有 重组质粒，质粒上携带L-苯丙氨酸合成酶基因，现已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏时间2010年1月18日，地址中国武汉，武汉大学，分类学命名为大肠杆菌 {Escherichia coli)，保藏编号为 CCTCC M 2010013。所述噬菌体BP-I来源于本实验室前期开发的L-苯丙氨酸生产菌WSH_ZH06(含 重组质粒pAP_B03，CCTCC M 2010009)受到噬菌体污染的裂解液，噬菌体BP-I已 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间2010年3月15日，保藏编号为CCTCCM 2010054 ；噬菌体BP-2来源于本实验室开发的L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR42 (含重组 质粒pAP_B03，CCTCCM 2010008)受到噬菌体污染的裂解液，WSH-BR42具有噬菌体 BP-I的抗性，但不具有噬菌体BP-2的抗性，噬菌体BP-2已保藏于中国典型培养物保藏 中心，保藏时间2010年3月15日，保藏编号为CCTCC M 2010055。所述重组质粒为pAP_B03，其上携带L-苯丙氨酸合成的关键酶CM/PDT和 DS的基因PheAfbInaroF,其中pheA^基因来源于E.coli K12的突变株，aroF来源于 E.coli K12 (Enhanced L-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheAftr and aroFwt. HaiyanZhou，Xianyan Liao，Tianwen Wang, Guocheng Du，Jian Chen.Bioresource Technology)。本发明所要解决的另外一个技术问题是提供了一种紫外线诱变育种、噬菌体淘 汰培养以及分子生物学改造相结合的L-苯丙氨酸生产菌的选育方法。为解决上述技术问题，对容易受到噬菌体污染的WSH-Z06的宿主菌 (EnhancedL-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheAftr and aroFwt.Haiyan Zhou, XianyanLiao, Tianwen Wang, Guocheng Du，Jian Chen.Bioresource Technology)分另ll进 亍 紫外线诱变处理、噬菌体淘汰培养，筛选到一株具有BP-I和ΒΡ-2双重抗性的大肠杆菌 宿主菌，随后用编码L-苯丙氨酸合成酶基因的质粒(ρΑΡ-Β03)转化上述大肠杆菌宿主 菌，得到具有双重噬菌体抗性的L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR165 (ρΑΡ-Β03)。所述紫外线诱变处理，具体方法为培养WSH-Z06的宿主菌，离心、洗涤菌体后 在紫外照射10-60s进行诱变处理。所述噬菌体淘汰培养，具体方法为在紫外线诱变处理后，红灯下在培养皿中分 别吸取一定含量菌液于装有30mL LB培养基和各ImL效价为liTpfu/mL的噬菌体BP-I 和BP-2裂解液的三角瓶中培养6h，使得诱变后不具有噬菌体抗性的菌被淘汰，具有双重 噬菌体抗性的菌得到富集。所述噬菌体抗性筛选，具体方法为离心、收集、培养诱变后的菌体，挑取形 态、大小、颜色各不相同的菌落逐一涂布单层平板，然后在平板的4个象限处分别各滴 加5 μ L噬菌体BP-I和ΒΡ-2的裂解液，做好标记，培养24h后，挑取在4处滴加噬菌体 的地方均没有出现噬菌斑的菌株。所述噬菌体裂解液BP-1，取样于受噬菌体污染的WSH-Z06(pAP_B03)发酵 液，经过分离、培养后获得，具体方法为发酵液离心后的上清液经0.22μιη微孔滤 膜过滤除菌，取出一定上清液放入装有肉膏蛋白胨培养基的试管中，同时加入一定量的 WSH-Z06(pAP_B03)菌悬液，培养一段时间，待长出单个噬菌斑后，用接种针穿刺法挑 取形态、大小不一的单个空斑分别接入含有敏感菌WSH-Z06的液体培养基中，37°C振荡 培养 16-24h。所述噬菌体裂解液BP-2，取样于受噬菌体污染的WSH-BR42(pAP_B03)发酵 液，经过分离、培养后获得，具体方法为发酵液离心后的上清液经0.22 μ m微孔滤膜 过滤除菌，取出一定上清液放入装有肉膏蛋白胨培养基的试管中，同时加入一定量的 WSH-BR42 (pAP-B03)菌悬液，培养一段时间，待长出单个噬菌斑后，用接种针穿刺法 挑取形态、大小不一的单个空斑分别接入含有敏感菌WSH-Z06的液体培养基中，37°C振 荡培养16-24h。所述噬菌体抗性检测培养基，采用肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g/L，蛋白胨 10g/L，葡萄糖 10g/L，NaCl 5g/L)，pH 7.0-7.2，琼脂 2%。所述抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌，其优选培养基组成为(1)种子培养基使用LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，pH 7.0,固体培养基加2%的琼脂。(2)发酵培养基(g/L)葡萄糖25，L-酪氨酸0.4，碳酸钙12.5，七水合硫酸镁3.0，二水合氯化钙 0.015，磷酸二氢钾3.0，氯化钠1.0，硫酸铵5.0，七水合硫酸亚铁0.075，柠檬酸钠1.0， 硫胺素(thiamine · HCl) 0.075,硫酸卡那霉素0.04，微量元素溶液(TES) 1.5mL/L，pH 7.0。TES 溶液(g/L) Al2 (SO4) 3 · 18H20 2.0, CoSO4 · 7H20 0.75, CuSO4 · 5H20 2.5，H3BO30.5，MnSO4 · H2O 24，Na2MoO4 · 2H20 3.0，NiSO4 · 6H20 2.5， ZnSO4 · 7H20 15，用 IN 的 HCl 溶解。所述抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌，其发酵罐培养方法为将37°C、200rpm下培养12h的种子以10%的接种量分别接入3L发酵罐中，发 酵培养基体积为1.5L，通气量为lvvm，搅拌转速为400rpm，待DO降至20%，通过调节 搅拌转速和通气量维持DO在20%以上；温度设定在33°C，菌体浓度达到OD61tl = 3时， 升温至37°C，用28%氨水控制pH在7.0左右，使用流加700g/L的葡萄糖溶液的方式维 持培养基中残余葡萄糖浓度在5g/L左右。细胞干重(DCW)的测定方法为取一定量的菌悬液置于IOmL容量瓶中，加去 离子水定容，摇勻，用722型可见分光光度计，于610nm处比色测OD值，利用细胞干重 标准曲线算得细胞干重，若测摇瓶发酵培养中的菌体浓度则在定容前加2mL 2N的盐酸溶 解菌悬液中的碳酸钙。L-苯丙氨酸浓度的测定方法采用氨基酸常用测定方法，高效液相色谱(HPLC) 柱前 行生化方法进行测定(Rapid, accurate, sensitive, and reproducible HPLC analysis of aminoacids.Henderson, J. W., Rieker, R.D., Bidlingmeyer, B.A., Woodward, C.， Agilent Technologies, USA, 2000)。有益效果本发明将传统紫外诱变育种的优点与分子生物学改造的优点相结合，通过噬菌 体淘汰培养的方法，高效率地筛选并构建出一株具有噬菌体BP-1、BP-2抗性的L-苯丙 氨酸生产菌；与之前的L-苯丙氨酸生产菌株相比，可以抵抗两种大肠杆菌噬菌体的感 染，且细胞生长速度和L-苯丙氨酸产量不受影响，并且具有良好的遗传稳定性，提高了 L-苯丙氨酸生产企业的经济效益。
2010054。实施例二噬菌体BP-2的分离纯化菌株本实验室前期开发的L-苯丙氨酸生产菌重组大肠杆菌WSH-BR42 (pAP_B03)， 保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M 2010008。取某工厂受到噬菌体感染的重组大肠杆菌WSH-BR42 (pAP"B03)发酵液4mL， 8000rpm离心IOmin后，上清液经0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌，取出100 μ L到50 V 装有6mL上层肉膏蛋白胨培养基的试管中，同时加入WSH-BR42(pAP_B03)菌悬液 IOOuL,立即混勻，倒入已凝固的底层培养基上，铺勻，置37°C培养箱内培养16-24h。 待长出单个噬菌斑后，用接种针穿刺法挑取形态、大小不一的单个空斑分别接入含有 WSH-BR42(pAP_B03)的液体培养基中，37°C振荡培养16_24h。重复上述步骤进行噬菌 斑形态、大小的检验，直至得到纯化的噬菌体。噬菌体分离纯化培养基肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡 萄糖 10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0-7.2，上层琼脂 0.8%，下层琼脂 2%)。噬菌体BP-2已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM
2010055。实施例三紫外线诱变育种、噬菌体淘汰培养以及双抗性的筛选菌株大肠杆菌宿主菌WSH-ZHO6 (前期构建，Enhanced L-phenylalanine biosynthesis byco-expression of pheAftr and aroFwt.Haiyan Zhou, Xianyan Liao，Tianwen Wang, GuochengDu, Jian Chen.Bioresource Technology)从斜面上接一环大肠杆菌宿主菌WSH-ZH06菌种入LB种子培养基中 (25mL/250mL锥形瓶)，在37°C、200rpm的条件下培养12h后，离心收集菌体，用生 理盐水洗涤三次。取适量菌悬液于六只内置磁力搅拌子的培养皿中，放入紫外诱变箱 (紫外灯与菌液距离为30cm，紫外灯为15瓦特)，分别在紫外灯下照射10s，20s, 30s, 40s, 50s及60s。在红灯下，在每只培养皿中分别吸取ImL菌液于装有30mLLB和各 ImL效价为liTpfu/mL的两种噬菌体裂解液的三角瓶中间培养6h，而后稀释、涂布LB 平板，置于37°C培养箱中培养过夜，挑取形态、大小、颜色各不相同的菌落逐一涂布单 层平板，然后在平板的4个象限处分别各滴加5μ1噬菌体BP-I和BP-2裂解液，做好标 记，培养24h后，挑取在4处滴加噬菌体的地方均没有出现噬菌斑的菌株6株，将每株菌 分别在斜面培养基上连续传代10次，再分别检测各菌株每一代的噬菌体抗性，结果选出 噬菌体抗性遗传稳定的菌株1株，命名为WSH-BR165。
实施例四将质粒转入具有双重噬菌体抗性的大肠杆菌菌株具有噬菌体BP-1、BP-2双重抗性的大肠杆菌宿主菌WSH-BR165质粒PAP-B03为本实验室自行构建(详见参考文献Enhanced L-phenylalanine biosynthesis byco-expression of pheAftr and aroFwt.Haiyan Zhou, Xianyan Liao，Tianwen Wang, GuochengDu, Jian Chen.Bioresource Technology, 2010, 1)采用电转化的方法对大肠杆菌突变株WSH-BR165进行转化质粒pAP_B03。将 WSH-BR165的对数期培养液IOOmL先用等量的水洗涤三次，再用等量的10%甘油洗涤 三次，最后用ImL的10%甘油悬浮菌体。向电转化杯中加入50μ1的菌悬液，再加入 5μ1的质粒，向电转杯提供2.5KV的电压5ms，立刻在电转杯中加入ImL的LB培养基， 混勻后转入1.5mL的离心管里于37°C、200rpm条件下培养2h后，涂布含有硫酸卡那霉素 的LB平板，置于37°C培养箱中培养过夜。待有单菌落长出，得到具有双重噬菌体抗性 的L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR165 (pAP03)，将其接入含有硫酸卡那霉素的LB斜面上保 藏备用。WSH_BR165(pAP03)已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2010013。 实施例四在添加噬菌体BP-2裂解液的条件下，WSH-BR165 (pAP03)与 WSH-BR42 (pAP-B03)以及WSH-Z06 (pAP-B03)产L-苯丙氨酸能力的比较菌株WSH-BR165 (pAP03)、WSH-ZH06 (pAP03)、WSH-BR42 (pAP_B03)优选培养基组成为(1)种子培养基使用LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，pH 7.0,固体培
养基加2%的琼脂。(2)发酵培养基(g/L)葡萄糖25，L-酪氨酸0.4，碳酸钙12.5，七水合硫酸镁3.0，二水合氯化钙 0.015，磷酸二氢钾3.0，氯化钠1.0，硫酸铵5.0，七水合硫酸亚铁0.075，柠檬酸钠1.0， 硫胺素(thiamine · HCl) 0.075,硫酸卡那霉素0.04，微量元素溶液(TES) 1.5mL/L，pH 7.0。TES 溶液(g/L) Al2 (SO4) 3 · 18H20 2.0, CoSO4 · 7H20 0.75, CuSO4 · 5H20 2.5，H3BO30.5，MnSO4 · H2O 24，Na2MoO4 · 2H20 3.0，NiSO4 · 6H20 2.5， ZnSO4 · 7H20 15，用 IN 的 HCl 溶解。3L发酵罐中发酵培养基体积为1.5L，通气量为lvvm，搅拌转速为400rpm，待 DO降至20%，通过调节搅拌转速和通气量维持DO在20%以上；温度设定为33°C，菌 体浓度达到OD61tl = 3时，升温至37°C，用28%氨水控制pH在7.0左右，使用流加700g/ L的葡萄糖溶液的方式维持培养基中残余葡萄糖浓度在5g/L左右，发酵至L-苯丙氨酸产 量达到最大，结果见表一。表一
菌种发酵时间(h)L-苯丙氨酸(g/L)生产强度(gh_VL)WSH-BR165 (pAP03)45491.09WSH-ZH06 (pAP03)48521.08WSH-BR42 (pAP-B03)47501.06表一数据表示，经过诱变后，虽然重组大肠杆菌L-苯丙氨酸产量略微降低，但 发酵时间有所缩短，生产强度总体不变，并且具有了噬菌体BP-I和BP-2抗性。实施例五在添加噬菌体BP-I和BP-2裂解液的条件下，WSH_BR165 (pAP03) 产L-苯丙氨酸能力的验证菌株噬菌体BP-I，保藏编号为CCTCC M 2010054 ；噬菌体BP-2，保藏编号为 CCTCC M2010055 ； WSH-BR165 (pAP03)保藏编号为 CCTCC M 2010013。3L发酵罐中发酵培养基(分别添加0.5% (ν/ν)的效价为IOuiPFUAnL的噬菌体 BP-I和ΒΡ-2的裂解液)体积为1.5L。通气量为lwm，搅拌转速为400rpm，待DO降 至20%，通过调节搅拌转速和通气量维持DO在20%以上；温度设定为33°C，菌体浓度 达到OD61tl = 3时，升温至37°C，用28%氨水控制pH在7.0左右，使用流加700g/L的 葡萄糖溶液的方式维持培养基中残余葡萄糖浓度在5g/L左右，发酵48小时，L-苯丙氨 酸产量达到48g/L。


本发明对容易受到噬菌体污染的WSH-Z06的宿主菌分别进行紫外线诱变处理、噬菌体淘汰培养，筛选到一株具有BP-1和BP-2双重抗性的大肠杆菌宿主菌，随后用编码L-苯丙氨酸合成酶基因的质粒(pAP-B03)转化宿主菌，得到抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR165(pAP-B03)；本发明将传统紫外诱变育种的优点与分子生物学改造的优点相结合，通过噬菌体淘汰培养的方法，高效率地筛选并构建出一株具有噬菌体BP-1、BP-2抗性的L-苯丙氨酸生产菌。