专利名称：罗汉果愈伤组织细胞悬浮体系的培养方法罗汉果是葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属Siraitia植物罗汉果Siraitia grosvenorii (Swingle)C. Jeffery ex Lu et Ζ. Y. Zhang 的果实。罗汉果为广西桂林特有的一种珍贵药食两用植物。罗汉果甜苷(mogroside)是罗汉果中主要有效成分，具有保健和药用价值，然而由于罗汉果甜苷从罗汉果果实中提取，提取得率仅为左右，因此，寻找获得罗汉果甜苷的新方法势在必行，植物细胞培养技术生产次生代谢产物是获得罗汉果甜苷的有效途径之一。目前，国内外尚无有关罗汉果悬浮细胞培养的报道。
本发明的目的是提供一种利用罗汉果茎段诱导形成的愈伤组织建立细胞悬浮体系的培养方法。本发明目的通过如下步骤来实现1)接种和诱导罗汉果茎段愈伤组织，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2. 5%蔗糖、4. Omg/1琼脂的MS液体培养基(pH 5.8)上继代培养，选取连续继代3_5次的新鲜、松软易碎的黄白色愈伤组织；2)将步骤1)中得到的愈伤组织转接到含有MS+0. 2-1. Omg/1 6-BA+0. 02-0. IOmg/ 1 NAA, 2. 0-4. 0%蔗糖为碳源的液体培养基的无菌三角瓶中，其接种量300g/l，初始培养基 PH为5. 0-6. 5，置于120r/min振荡培养箱25°C黑暗条件下悬浮培养24h后静置，将上层培养基连同单细胞和小细胞团转移到无菌空三角瓶中继续振荡培养，3d后采用同样的方法再转移一次，7d后将悬浮细胞经40 μ m筛网过滤后接种到新鲜培养基中继续振荡培养，达到一定体积后转移到大的三角瓶中，用同样的方法继续添加培养基振荡培养，直到达到一定数量的均一稳定的细胞悬浮培养液，细胞悬浮培养温度为25士2°C，光强为20001x，光照时间为12h/d ；3)培养21d收获，蒸馏水冲洗3次，真空抽滤后称量鲜重(Fresh Cell Weight, FCW)，然后将所得细胞置于60°C烘箱中干燥至恒重后称量干重(Dry Cell Weight，DCW)。步骤2)中所述悬浮细胞生长的优选培养基为MS+1. Omg/1 6-BA+O. 02mg/l NAA， 4. 0%蔗糖为碳源，初始培养基pH为5. 5-6. 0。步骤2)中所述的继续振荡培养的继代次数为3 5次。本发明的积极效果是利用罗汉果茎段诱导形成的愈伤组织，建立了细胞悬浮培养体系，研究了 4种因素对悬浮垃圾细胞生长的影响，筛选出适宜的培养条件，提高了罗汉果悬浮细胞培养体系的产量，并为利用罗汉果悬浮细胞培养体系提取罗汉果甜苷奠定了基石出。2.0%蔗糖为碳源的液体培养基的无菌三角瓶中(接种量300g/l)，初始培养基pH为5. 0 5. 4，置于120r/min振荡培养箱25°C黑暗条件下悬浮培养24h后静置，将上层培养基连同单细胞和小细胞团转移到无菌空三角瓶中继续振荡培养，3d后采用同样的方法再转移一次， 7d后将悬浮细胞经40 μ m筛网过滤后接种到新鲜培养基中继续振荡培养，达到一定体积后转移到大的三角瓶中，用同样的方法继续添加培养基振荡培养，直到达到一定数量的均一稳定的细胞悬浮培养液。细胞悬浮培养温度为25士2°C，光强为20001x，光照时间为12h/ d；3)培养21d收获，蒸馏水冲洗3次，真空抽滤后分离细胞称量鲜重(Fresh Cell Weight, FCff)为 570.Og/1。实施例2:罗汉果愈伤组织细胞悬浮体系的培养方法，包括如下步骤本实验罗汉果健康植株的茎段为实验材料。1)接种和诱导罗汉果茎段愈伤组织，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1琼脂的1^培养基(pH 5.8)上继代培养，选取连续继代3次或4次或5 次的新鲜、松软易碎的黄白色愈伤组织；2)将步骤1)中得到的愈伤组织转接到含有MS+0. 2mg/l 6-BA+O. 06mg/l NAA,3.0%蔗糖为碳源的液体培养基的无菌三角瓶中(接种量300g/l)，初始培养基pH为5. 5 6.0，置于120r/min振荡培养箱25°C黑暗条件下悬浮培养24h后静置，将上层培养基连同单细胞和小细胞团转移到无菌空三角瓶中继续振荡培养，3d后采用同样的方法再转移一次， 7d后将悬浮细胞经40 μ m筛网过滤后接种到新鲜培养基中继续振荡培养，达到一定体积后转移到大的三角瓶中，用同样的方法继续添加培养基振荡培养，直到达到一定数量的均一稳定的细胞悬浮培养液。细胞悬浮培养温度为25士2°C，光强为20001x，光照时间为12h/ d；3)培养21d收获，蒸馏水冲洗3次，真空抽滤后分离细胞称量鲜重(Fresh Cell Weight, FCff)为 510.Og/1。实施例3 罗汉果愈伤组织细胞悬浮体系的培养方法，包括如下步骤本实验罗汉果健康植株的茎段为实验材料。1)接种和诱导罗汉果茎段愈伤组织，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1琼脂的1^培养基(pH 5.8)上继代培养，选取连续继代3次或4次或5次的新鲜、松软易碎的黄白色愈伤组织；2)将步骤1)中得到的愈伤组织转接到含有MS+0. 2mg/l 6-BA+O. 10mg/l NAA, 4.0%蔗糖为碳源的液体培养基的无菌三角瓶中(接种量300g/l)，初始培养基pH为6. 1 6. 4，置于120r/min振荡培养箱25°C黑暗条件下悬浮培养24h后静置，将上层培养基连同单细胞和小细胞团转移到无菌空三角瓶中继续振荡培养，3d后采用同样的方法再转移一次， 7d后将悬浮细胞经40 μ m筛网过滤后接种到新鲜培养基中继续振荡培养，达到一定体积后转移到大的三角瓶中，用同样的方法继续添加培养基振荡培养，直到达到一定数量的均一稳定的细胞悬浮培养液，细胞悬浮培养温度为25士2°C，光强为20001x，光照时间为Uh/d ；3)培养21d收获，蒸馏水冲洗3次，真空抽滤后分离细胞称量鲜重(Fresh Cell Weight, FCff)为 543.Og/1。实施例4 罗汉果愈伤组织细胞悬浮体系的培养方法，包括如下步骤本实验罗汉果健康植株的茎段为实验材料。1)接种和诱导罗汉果茎段愈伤组织，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1琼脂的1^培养基(pH 5.8)上继代培养，选取连续继代3次或4次或5 次的新鲜、松软易碎的黄白色愈伤组织；2)将步骤1)中得到的愈伤组织转接到含有MS+0.6mg/l 6-BA+O. 02mg/l NAA, 3.0%蔗糖为碳源的液体培养基的无菌三角瓶中(接种量300g/l)，初始培养基pH为6. 1 6. 4，置于120r/min振荡培养箱25°C黑暗条件下悬浮培养24h后静置，将上层培养基连同单细胞和小细胞团转移到无菌空三角瓶中继续振荡培养，3d后采用同样的方法再转移一次， 7d后将悬浮细胞经40 μ m筛网过滤后接种到新鲜培养基中继续振荡培养，达到一定体积后转移到大的三角瓶中，用同样的方法继续添加培养基振荡培养，直到达到一定数量的均一稳定的细胞悬浮培养液，细胞悬浮培养温度为25士2°C，光强为20001x，光照时间为12h/d ；3)培养21d收获，蒸馏水冲洗3次，真空抽滤后分离细胞称量鲜重(Fresh Cell Weight, FCff)为 493. Og/1。实施例5 罗汉果愈伤组织细胞悬浮体系的培养方法，包括如下步骤本实验罗汉果健康植株的茎段为实验材料。1)接种和诱导罗汉果茎段愈伤组织，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1琼脂的1^培养基(pH 5.8)上继代培养，选取连续继代3次或4次或5 次的新鲜、松软易碎的黄白色愈伤组织；2)将步骤1)中得到的愈伤组织转接到含有MS+0. 6mg/l 6-BA+O. 06mg/l NAA,4.0%蔗糖为碳源的液体培养基的无菌三角瓶中(接种量300g/l)，初始培养基pH为5. 0 5.4，置于120r/min振荡培养箱25°C黑暗条件下悬浮培养24h后静置，将上层培养基连同单细胞和小细胞团转移到无菌空三角瓶中继续振荡培养，3d后采用同样的方法再转移一次， 7d后将悬浮细胞经40 μ m筛网过滤后接种到新鲜培养基中继续振荡培养，达到一定体积后转移到大的三角瓶中，用同样的方法继续添加培养基振荡培养，直到达到一定数量的均一稳定的细胞悬浮培养液，细胞悬浮培养温度为25士2°C，光强为20001x，光照时间为Uh/d ；3)培养21d收获，蒸馏水冲洗3次，真空抽滤后分离细胞称量鲜重(Fresh CellWeight, FCff)为 420. Og/1。实施例6:罗汉果愈伤组织细胞悬浮体系的培养方法，包括如下步骤本实验罗汉果健康植株的茎段为实验材料。1)接种和诱导罗汉果茎段愈伤组织，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1琼脂的1^培养基(pH 5.8)上继代培养，选取连续继代3次或4次或5 次的新鲜、松软易碎的黄白色愈伤组织；2)将步骤1)中得到的愈伤组织转接到含有MS+0.6mg/l 6-BA+O. 10mg/l NAA, 2. 0%蔗糖为碳源的液体培养基的无菌三角瓶中(接种量300g/l)，初始培养基pH为5. 5 6.0，置于120r/min振荡培养箱25°C黑暗条件下悬浮培养24h后静置，将上层培养基连同单细胞和小细胞团转移到无菌空三角瓶中继续振荡培养，3d后采用同样的方法再转移一次， 7d后将悬浮细胞经40 μ m筛网过滤后接种到新鲜培养基中继续振荡培养，达到一定体积后转移到大的三角瓶中，用同样的方法继续添加培养基振荡培养，直到达到一定数量的均一稳定的细胞悬浮培养液，细胞悬浮培养温度为25士2°C，光强为20001x，光照时间为12h/d ；3)培养21d收获，蒸馏水冲洗3次，真空抽滤后分离细胞称量鲜重(Fresh Cell Weight, FCff)为 450. Og/1。实施例7 罗汉果愈伤组织细胞悬浮体系的培养方法，包括如下步骤本实验罗汉果健康植株的茎段为实验材料。1)接种和诱导罗汉果茎段愈伤组织，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1琼脂的1^培养基(pH 5.8)上继代培养，选取连续继代3次或4次或5 次的新鲜、松软易碎的黄白色愈伤组织；2)将步骤1)中得到的愈伤组织转接到含有MS+1.0mg/l 6-BA+O. 02mg/l NAA, 4. 0%蔗糖为碳源的液体培养基的无菌三角瓶中(接种量300g/l)，初始培养基pH为5. 5 6.0，置于120r/min振荡培养箱25°C黑暗条件下悬浮培养24h后静置，将上层培养基连同单细胞和小细胞团转移到无菌空三角瓶中继续振荡培养，3d后采用同样的方法再转移一次， 7d后将悬浮细胞经40 μ m筛网过滤后接种到新鲜培养基中继续振荡培养，达到一定体积后转移到大的三角瓶中，用同样的方法继续添加培养基振荡培养，直到达到一定数量的均一稳定的细胞悬浮培养液，细胞悬浮培养温度为25士2°C，光强为20001x，光照时间为Uh/d ；3)培养21d收获，蒸馏水冲洗3次，真空抽滤后分离细胞称量鲜重(Fresh Cell Weight, FCff)为 693.Og/1。实施例8 罗汉果愈伤组织细胞悬浮体系的培养方法，包括如下步骤本实验罗汉果健康植株的茎段为实验材料。1)接种和诱导罗汉果茎段愈伤组织，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1琼脂的1^培养基(pH 5.8)上继代培养，选取连续继代3次或4次或5 次的新鲜、松软易碎的黄白色愈伤组织；2)将步骤1)中得到的愈伤组织转接到含有MS+1.0mg/l 6-BA+O. 06mg/l NAA, 2.0%蔗糖为碳源的液体培养基的无菌三角瓶中(接种量300g/l)，初始培养基pH为6. 1 6. 4，置于120r/min振荡培养箱25°C黑暗条件下悬浮培养24h后静置，将上层培养基连同单细胞和小细胞团转移到无菌空三角瓶中继续振荡培养，3d后采用同样的方法再转移一次， 7d后将悬浮细胞经40 μ m筛网过滤后接种到新鲜培养基中继续振荡培养，达到一定体积后转移到大的三角瓶中，用同样的方法继续添加培养基振荡培养，直到达到一定数量的均一稳定的细胞悬浮培养液，细胞悬浮培养温度为25士2°C，光强为20001x，光照时间为Uh/d ；3)培养21d收获，蒸馏水冲洗3次，真空抽滤后分离细胞称量鲜重(Fresh Cell Weight, FCff)为 580.Og/1。实施例9 罗汉果愈伤组织细胞悬浮体系的培养方法，包括如下步骤本实验罗汉果健康植株的茎段为实验材料。1)接种和诱导罗汉果茎段愈伤组织，在添加0. 2mg/l 6-BA+O. 04mg/l NAA激素、 2.5%蔗糖、4.0!^/1琼脂的1^培养基(pH 5.8)上继代培养，选取连续继代3次或4次或5 次的新鲜、松软易碎的黄白色愈伤组织；2)将步骤1)中得到的愈伤组织转接到含有MS+1.0mg/l 6-BA+O. 10mg/l NAA, 3. 0%蔗糖为碳源的液体培养基的无菌三角瓶中(接种量300g/l)，初始培养基pH为5. 0 5. 4，置于120r/min振荡培养箱25°C黑暗条件下悬浮培养24h后静置，将上层培养基连同单细胞和小细胞团转移到无菌空三角瓶中继续振荡培养，3d后采用同样的方法再转移一次， 7d后将悬浮细胞经40μ m筛网过滤后接种到新鲜培养基中继续振荡培养，达到一定体积后转移到大的三角瓶中，用同样的方法继续添加培养基振荡培养，直到达到一定数量的均一稳定的细胞悬浮培养液，细胞悬浮培养温度为25士2°C，光强为20001x，光照时间为Uh/d ；3)培养21d收获，蒸馏水冲洗3次，真空抽滤后分离细胞称量鲜重(Fresh Cell Weight, FCff)为 390.Og/1。上述实施例中经检测，培养21d是罗汉果悬浮细胞最佳收获时间，此时罗汉果总苷和甜苷V的含量均是最大值。占细胞重量的比值分别为8. 11%,5. 77%。


本发明涉及一种罗汉果愈伤组织细胞悬浮体系的培养方法，1)接种和诱导罗汉果茎段愈伤组织，在添加NAA激素、蔗糖、琼脂的MS液体培养基上继代培养，选取愈伤组织；2)将步骤1)中得到的愈伤组织转接到无菌三角瓶中，置于振荡培养箱25℃黑暗条件下悬浮培养24h，将上层培养基连同单细胞和小细胞团转移到三角瓶中继续振荡培养，3d后采用同样的方法再转移一次，7d后将悬浮细胞经40μm筛网过滤后接种到新鲜培养基培养。达到一定体积后转移到大的三角瓶中，用同样的方法继续添加培养基振荡培养。3)培养21d收获，冲洗3次，真空抽滤后称重，烘干。本发明具有繁殖速度快、培养规模大和提供大量均匀一致植物细胞培养物的特点。