专利名称：一种缩短植物细胞悬浮培养周期的方法·细胞悬浮培养是生产植物次生代谢物的重要手段之一。但是，植物悬浮细胞生长速度缓慢、培养周期长成了细胞悬浮培养的环节多、成本高等关键问题。本发明利用RNAi原理，通过降低植物p53基因的表达，以达到缩短植物悬浮细胞培养周期、提高细胞培养密度目的。
构建植物细胞表达载体。通过比对Genbank注册的植物p53基因的核苷酸序列，选定其两个保守区各30-100个碱基对的核苷酸序列分别为正向片段I和II，并以其为依据分别设置其对应的反向序列(I’和II’ );根据两对正、反序列设计出合适的引物，在PCR扩增过程中，使正反片段分别引入限制性内切酶位点(EcoR I和Hind III)和相应的⑶-AG内含子端部序列。经过酶切、再连接、转化、克隆和鉴定后，得到了四片段的I-AC-II’ -II-CT-I’序列产物；该产物插入到PCAMBIA2300植物表达载体，导入农杆菌感受态EHA105，筛选出能转化植物的工程菌。以甘草为例获得甘草转化体。从甘草幼苗的上胚轴上诱导愈伤组织；早期愈伤组织与农杆菌工程菌共培养；随后在含抗生素的培养基中进行选择培养，筛选出抗性愈伤组织并进行继代培养；将松散的抗性愈伤组织在液体培养基振荡培养；培养物过筛后继续进行悬浮培养，获得稳定的悬浮细胞。高产悬浮细胞系的筛选。利用看护培养手段，从悬浮细胞中筛选生长速度快的单细胞系愈伤组织；将该愈伤组织在液体培养基中振荡培养；培养物过筛后继续进行悬浮培养，获得由单细胞和小细胞团组成的悬浮系；对该悬浮系的细胞生长周期、主要代谢产物含量进行等鉴定并稳定性试验，获得的生长悬浮细胞作为种子进入大规模。细胞悬浮培养基及培养条件的优化。通过培养基和培养条件的优化，获得植物细胞生长和产物积累的最适碳氮源、pH、温度、溶氧量和最佳接种量等发酵工艺参数，为进一步进行大规模细胞悬浮培养提供了依据。主要用途利用本发明方法获得的培养周期短、成本低、生产效率高的细胞，将在大规模开发和生产药用植物有效成分方面将发挥着关键作用。一种缩短植物细胞悬浮培养周期的方法，本发明属于生物技术领域。首先，选定p53基因的两个保守区分别为正向片段I、II以及对应的反向序列I’和II’；构建I-GU-II’-II-AG-I’的RNAi片段；筛选出其插在pCAMBIA2300植物表达载体的根瘤农杆菌工程菌。然后，以甘草为例，农杆菌介导法依次获得p53转化的愈伤组织及其稳定表达的悬浮细胞。再次，通过看护培养，利用悬浮细胞，筛选生长速度快、效果好的单细胞系愈伤组织以及由此形成的悬浮细胞系。最后，通过培养工艺优化，获得悬浮细胞生长和产物积累的最佳发酵工艺参数。利用本发明方法获得的培养周期短、密度大、成本低、生产效率高的细胞系，为大规模开发和生产药用植物有效成分提供优质种源。