翼首草正丁醇部位提取物及其制备方法和用途[0002]恶性肿瘤是严重危害人类生命及健康的重大疾病，其死亡率位居人类疾病死亡人数的第一位。GL0B0CAN(2008)报告指出，2008年全球新发癌症病例1270万，癌症死亡病例760万，预计2030年全球癌症新发病例将增加到2220万。目前，化疗仍然是现代肿瘤临床治疗的主要手段之一，但是化疗缺乏对正常细胞和肿瘤细胞的选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也有极大的损伤，不仅损伤心、肝、肺、肾、骨髓等重要器官的功能，而且破坏免疫系统，导致机体对肿瘤的自我保护屏障丧失。化疗的毒副作用和肿瘤的耐药性使大多数肿瘤患者的治疗难以为继，限制了化疗药物的治疗强度和使用频率。因此，为提高肿瘤内科的治疗效果，寻找安全有效、毒副作用小的抗肿瘤药物一直是研究者孜孜以求的奋斗目标。[0003]翼首草系川续断科翼首花属植物，全世界翼首花属植物约有25种，我国仅有匙叶翼首草 Pterocephalus hookeri (C.B.Clarke) Hoeck 和裂叶翼首草 Pterocephalusbretschneideri (Batal.)Pretz两种，主要分布于西藏各地、青海、四川西部和北部、云南西北部等地，以根或全草入药，为藏医常用药材，广泛应用于藏药制剂，如十二味翼首散、二十五味驴血丸、二十六味余甘子丸、九味青鹏散、石榴普安散等。藏医认为翼首草性寒、味苦，具有清热解毒、祛风湿、止痛的作用，可用于治疗瘟毒、痹证、关节炎等症。对该药的化学与药理研究方兴未艾。
[0004]本发明的目的在于提供一种翼首草的正丁醇部位提取物。[0005]本发明的另一目的在于提供上述翼首草正丁醇部位提取物的制备方法。[0006]本发明的再一目的在于提供上述翼首草正丁醇部位提取物在制备抗肿瘤药物中的用途。[0007]根据本发明的上述目的，本发明提供了一种翼首草正丁醇部位提取物，该提取物的主要成分为环烯醚萜苷。
[0008]本发明还提供上述翼首草正丁醇部位提取物的制备方法，该方法包含以下步骤:
[0009](I)取翼首草药材，在加热回流条件下进行醇提，将提取液减压回收醇，浓缩得到一级提取物；
[0010](2)将上述一级提取物加水混悬，用亲脂性有机溶剂萃取，以去除脂溶性杂质；然后再用正丁醇提取，回收溶剂后得到所述翼首草正丁醇部位提取物。
[0011]其中，上述步骤(1)中的醇提所用的提取溶剂为甲醇、乙醇、体积浓度为50%以上的甲醇水溶液或体积浓度为50%以上的乙醇水溶液。醇提所用的提取溶剂的用量为翼首草药材质量的2~10倍。醇提时，加热回流的温度为50~100°C，加热回流提取的次数为I~5次,每次加热回流0.5~2小时。
[0012]上述步骤(2)中所述的亲脂性有机溶剂为石油醚、环己烷、正己烷、苯、四氯化碳、氯仿或二氯甲烷。亲脂性有机溶剂萃取次数为I~5次，每次萃取的溶剂用量为被萃取物体积的I~5倍。
[0013]步骤(2)中以正丁醇提取时，提取次数为I~5次，每次加入正丁醇的用量为被提取物体积的I~5倍。
[0014]本发明还提供按照上述方法制备得到的翼首草正丁醇部位提取物在制备抗肿瘤药物中的用途。具体来说，即以本发明所提供的翼首草正丁醇部位提取物为有效成分，加入药学上可接受的载体，以常规的中药制剂方法，制备得到各种中药剂型，用于预防或治疗恶性肿瘤疾病。
[0015]本发明所提供的翼首草正丁醇部位提取物，其原料翼首草药材来源广泛、价格低廉，且制备该正丁醇部位提取物的方法种简单易行。本发明依据传统中医药理论，借鉴临床用药经验，采用传统藏药材翼首草，提取其正丁醇有效部位，该有效部位可以显著抑制多种肿瘤细胞的生长，诱导肝癌细胞H印3B凋亡，此结果在裸鼠体内实验也得到了印证。因此，本发明所涉及的翼首草正丁醇有效部位提取物，可用于制成治疗恶性肿瘤的药物，具有软坚散结之功效，对恶性肿瘤常见的表现如:瘀血阻滞、正气亏虚、实质性包块等具有显著的疗效，有望开发为一种疗效确切，安全方便，毒副作用小，价格低廉的抗肿瘤药物。



[0016]图1是翼首草正丁醇部位提取物中环烯醚萜苷成分的HPLC图谱；
[0017]图2显示翼首草正丁醇部位提取物对多种肿瘤细胞株生长的抑制作用:
[0018]其中，图2-a为提取物对H印3B细胞株抑制作用图，图2_b为提取物对Eca_109细胞株抑制作用图，图2-c为 提取物对H印G2细胞株抑制作用图，图2-d为提取物对A549细胞株抑制作用图；
[0019]图3显示翼首草正丁醇部位提取物对各种肿瘤细胞株的半数抑制率IC50 ；
[0020]图4显示翼首草正丁醇部位提取物对正常肝胚胎细胞BNL-CL2增殖的影响；
[0021 ] 图5显示荧光显微镜观察翼首草正丁醇部位提取物诱导体外培养的Hep3B细胞凋亡的形态特征(X 400倍)；
[0022]图6显示透射电镜观察Ifep3B细胞超微形态变化(X 8200倍)；
[0023]图7显示翼首草正丁醇部位提取物诱导细胞凋亡与PTEN/PI3K/AKT信号通路的关系；其中，I代表对照组，2代表翼首草正丁醇部位提取物组(浓度200 μ g/ml)，3代表LY294002 (PI3K抑制剂)组，4代表经LY294002处理过的提取物低浓度组，5代表经LY294002处理过的提取物中浓度组，6代表经LY294002处理过的提取物高浓度组，；
[0024]图8显示Annexin-V/PI双染检测翼首草正丁醇部位提取物对Hep3B细胞凋亡的影响；
[0025]图9显示翼首草正丁醇部位对裸鼠脾脏指数及肿瘤重量、裸鼠体重的影响；其中，图9-a为裸鼠脾脏指数图，图9-b为裸鼠体重图，图9-c为裸鼠瘤重图，图9-d为肿瘤抑制率图，每个图中的横坐标依次代表CMCNa组、提取物低浓度组、提取物中浓度组、提取物高浓度组、阳性药氟尿嘧啶组。

[0026]以下通过具体的制备实施例说明本发明从翼首草原料药中得到正丁醇部位提取物的方法，但它们并不是对本发明的限定。
[0027]实施例1:
[0028]1.1药材鉴定
[0029]匙叶翼首草Pterocephalus hookeri (C.B.Clarke)Hoeck 于 2012 年 4 月米集于中华人民共和国青海省。经上海中医药大学中药学院赵志礼教授鉴定。标本存于上海中医药大学中药学院方药实验室(标本号:YSC-20120415)。
[0030]1.2药材提取制备
[0031]翼首草药材2000g，加体积浓度为95%的乙醇7L，加热在80°C下回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压浓缩至1/5体积，加等体积的水，挥发至无醇味，依次用2倍体积石油醚、二氯甲烷萃取3次，然后用2倍体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇，回收溶剂得翼首草正丁醇部位提取物。
[0032]实施例2:
[0033]2.1药材鉴定:同实施例1 [0034]2.2药材提取制备
[0035]翼首草药材2000g，加无水乙醇7L，加热在80°C下回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压浓缩至1/5体积，加等体积的水，挥发至无醇味，依次用2倍体积环己烷、氯仿萃取3次，然后用2倍体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇，回收溶剂得翼首草正丁醇部位提取物。
[0036]实施例3
[0037]3.1药材鉴定:同实施例1
[0038]3.2药材提取制备
[0039]翼首草药材200g，加甲醇900mL，加热在80°C下回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压浓缩至1/5体积，加等体积的水，挥发至无醇味，依次用2倍体积环己烷、二氯甲烷萃取3次，然后用2倍体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇，回收溶剂得翼首草正丁醇部位提取物。
[0040]实施例4
[0041]4.1药材鉴定:同实施例1
[0042]4.2药材提取制备
[0043]翼首草药材lOOOg，加体积浓度为75%的乙醇4L，加热在50°C下回流提取2次，每次0.5h，合并提取液，减压浓缩至1/5体积，加等体积的水，挥发至无醇味，依次用I倍体积正己烷、四氯化碳萃取3次，然后用3倍体积正丁醇萃取4次，合并正丁醇，回收溶剂得翼首草正丁醇部位提取物。
[0044]实施例5
[0045]5.1药材鉴定:同实施例1
[0046]5.2药材提取制备[0047]翼首草药材1000g，加体积浓度为80%的甲醇3.5L，加热在100°C下回流提取5次，每次lh，合并提取液，减压浓缩至1/5体积，加等体积的水，挥发至无醇味，依次用5倍体积苯、二氯甲烷萃取3次，然后用5倍体积正丁醇萃取2次，合并正丁醇，回收溶剂得翼首草正丁醇部位提取物。
[0048]以下再通过试验例(以实施例1制备的提取物为例)来进一步阐述本发明所述翼首草正丁醇部位提取物的有益效果，这些试验例包括了细胞毒性实验和动物药效学实验。
[0049]实施例6:翼首草正丁醇部位提取物对多种肿瘤细胞株生长的抑制作用
[0050]6.1实验材料
[0051]6.1.1 细胞株:
[0052]肺癌A549细胞株、食管癌Eca_109细胞株、肝癌H印G2细胞株、肝癌Hep3B细胞株，均购自中科院生化细胞所，由上海中医药大学方药实验室传代保存。
[0053]6.1.2 试剂:
[0054]DMEM高糖培养液(Hyclone，美国Thermo公司，批号:SH30243.01)，胎牛血清(Gibco, Invitrogen 公司，批号:100099-141) ,0.25%膜蛋白酶(Gibco, Invitrogen 公司，批号:25200-072)
[0055]6.1.3 仪器:
[0056]电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司，型号:AR124CN) 二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher公司，型号:3111)，超净工作台(上海力申科学仪器公司有限公司，型号:HFsafe-1500),全波长酶标仪(美国基因gene公司，型号:Synergy HT),离心机(Sigma公司，型号:2-16ΡΚ) ο
[0057]6.2实验方法:
[0058](I)接种细胞:用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液和DMEM高糖培养液配成细胞悬液，以每孔3000-5000个细胞接种到96孔板，每组4_6个复孔，每孔体积100 μ I。设实验药物组、阳性对照组和空白对照组；放入37°C、5% CO2培养箱中培养；
[0059](2)加药:待细胞贴壁后，吸取原培养液，加入含不同浓度药物的新培养液(药物组合各浓度为 500 μ g/ml>250 μ g/ml、125 μ g/ml>50 μ g/ml、25 μ g/ml、12.5 μ g/ml、
6.25 μ g/ml ;阳性对照药长春新碱浓度为0.5 μ g/ml)每孔100 μ 1，继续培养48h ；
[0060](3)呈色:培养48h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液10ul，继续孵育4h，终止培养，吸培养孔上清液，每孔加入DMS0150l.! 1，震荡lOmin，使结晶物充分融解；
[0061](4)比色:选择490nm波长，在酶标检测仪上测定各孔吸光度值；
[0062](5)计算抑制率:
[0063]