专利名称：一种β诺达病毒基因组全序列及其克隆方法一种β诺达病毒基因组全序列及其克隆方法本专利申请由天津师范大学生命科学学院/细胞遗传与分子调控天津市重点实验室完成，得到国家自然科学基金(30901094)，天津市科技计划(09JCYBJC15000)，天津市教委基金(20080618)以及国家科技支撑计划(2011BAD13B07，201IBAD13Β04)的资助。技术领域本发明属于应用生物技术领域，涉及β诺达病毒检测方面的应用。更具体的说是一种β诺达病毒基因组全序列及其克隆方法。病毒性神经坏死病(Viral nervous necrosis,VNN)又称病毒性脑病和视网膜病 (Viral encephalopathy and retinopathy)，流行于除美洲和非洲外几乎世界所有地区的海水鱼类，对仔鱼和幼鱼危害很大，严重者在一周内死亡率可达100%，且近年受感染的鱼类种类和受危害程度迅速增加。病鱼表现厌食，上浮于水面，表现螺旋状或旋转游动，或腹部朝上漂浮于水面，难于下沉，病鱼腹部肿大，有的鳔肿大充血，外观无其它明显病变。组织学检查可见中枢神经组织脑细胞和视网膜细胞空泡化。该病的病原属诺达病毒科。鱼类病毒性神经坏死病是近年来严重危害海水鱼类，引起暴发性流行的重大病害之一。目前，已知受神经坏死病毒感染的鱼类达40多种。该病毒包括4种血清型，即红鳍东方飩神经坏死病毒、拟鰺神经坏死病毒、条斑星鲽神经坏死病毒、赤点石斑鱼神经坏死病毒。患病鱼常表现出游泳异常，身体失去平衡等典型神经性疾病症状，病理组织学观察可见中枢神经系统特别是脑和视网膜出现严重的坏死、空泡化。病毒可通过垂直和水平两种途径传播。诺达病毒科只有一个属。本属内的诺达病毒首次分离于日本的Nodamura村，因而得名。过去也将其称为野田村病毒。病毒的基因组由两分子的ssRNA组成，分子量为 1. IX IOfiDa和0.48 X IOf5Datl两个分子在5 ‘端都有一个帽，而;T端无多聚㈧尾。病毒在细胞浆中复制，放线菌素D不影响病毒RNA的合成。感染细胞中有3种病毒RNA，即RNAl (分子量IX I(^Da)、RNA2(分子量0. 5X106Da)和一个亚基因RNA3(分子量0. 15X IO6Da )。RNAl编码蛋白A(分子量112X IO3Da)，后者可能是病毒RNA聚合酶的成份；RNA2编码衣壳蛋白的前身即α蛋白；RNA3编码蛋白B (分子量IOX IO3Da),可能在合成正链RNA过程中起作用。用分离的RNAl感染细胞，能合成RNAl和RNA3，但不能合成RNA2。RNAl和RNA2 均是形成病毒粒子所必须的。诺达病毒在细胞中的增殖力很低，但它能在34°C的低温条件下，通过病毒RNA对细胞的转染而传代培养。此病毒于1989年发现，1990年首次报道。此后，在世界各地相继有3目8科15种海水养殖鱼类发生过此病。幼鱼期病鱼可出现螺旋式垂直游动，死亡率较仔鱼期低。组织学检查可见脑细胞和视网膜因细胞坏死和毁坏形成的空胞。电镜观察可见细胞质内球形病毒粒子，直径25 30 nm,病毒基因由两段单链RNA组成，RNAl编码非结构蛋白，RNA2编码一种主要的结构蛋白。目前，对于诺达病毒基因复制和蛋白成熟过程，科学家们已经有了较多的了解，但快速诊断技术尚不完备，常用的诊断方法例如行为体色观察、组织病理检查、RT-PCR法检测病毒衣壳蛋白基因、原位杂交法检测病毒核酸在组织中的分布、免疫学方法等。

一种β诺达病毒全基因组序列，其特征在于该病毒基因组由两条不等长RNA组成，RNAl节段全长3104个核苷酸，5，UTR和3，UTR分别由78和77个核苷酸组成，ORF区含有四49个碱基，编码病毒自身的RNA依赖的RNA聚合酶，在其编码区内部嵌套有另一重叠阅读框(位置27534980 nt)，编码非结构蛋白B2，序列为SEQ ID No. 1所示；RNA2节段长度为1433个核苷酸，5，UTR和3，UTR分别由沈和390个核苷酸组成，ORF区含有1017 个核苷酸，序列为SEQ ID No. 2所示。本发明所述β诺达病毒基因组全序列，其中β诺达病毒基因组RNAl节段编码长度为982个氨基酸，其序列如SEQ ID No. 3所示。本发明所述β诺达病毒基因组全序列，其中β诺达病毒全基因组RNAl节段嵌套的Β2蛋白长度为75个氨基酸，其序列如SEQ ID No. 4所示。本发明所述β诺达病毒基因组全序列，其中β诺达病毒基因组RNA2节段编码长度为338个氨基酸，其序列如SEQ ID No. 5所示。本发明主要完成了如下的内容
1. β诺达病毒基因组全序列的确认
本发明的方法采用长距离逆转录酶和长距离高保真聚合酶，依据RT-PCR原理扩增出一种β诺达病毒基因组两条RNA的全长cDNA，将扩增产物克隆到T载体进行测序比对分析，获得具有正确碱基序列的克隆。2. β诺达病毒基因组全序列的制备方法(具体见实施例1) 包括RNA抽提，cDNA合成，基因组扩增，扩增产物测序及比对分析 3. β诺达病毒基因组全序列的用途
β诺达病毒基因组全序列确定后，可根据该基因组的序列进行β诺达病毒的分子检测(具体见实施例2)。4. β诺达病毒基因组全序列编码氨基酸序列的用途
β诺达病毒基因组全序列编码的氨基酸序列确定后，可根据该序列制备β诺达病毒相关蛋白的抗体(具体见实施例3)。


图1扩增RNAl节段全序列的结果；Μ: DNA分子量标记DL2000 ；1 对照；2 =RNAl扩增产物；
图2扩增RNA2节段全序列的结果；Μ: DNA分子量标记DL2000 ；1 对照；2 :RNA2扩增产物。

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。特别加以说明的是，本发明使用的试剂材料均有市售；其中大肠杆菌(DH5ci )购于购自天根生化公司；牙鲆幼苗由天津海发珍品养殖中心提供。
实施例1β诺达病毒基因组全序列的制备 1. RNA抽提I；将牙鲆置于预冷的解剖盘上，用经180°C烘烤8个小时的剪刀和镊子解剖，将其脑部组织迅速转移到无RNase的1. 5mL离心管中，加入ImL Trizol于冰浴中充分勻浆，室温静置 5min,于 4°C条件下 12000rpm 离心 IOmin ；②取①上清到一支新的1.5mL离心管中，加入200 μ L氯仿振荡15s，之后静置^iin ；③将上述②中的液体于4°C下，12000rpm离心15min后取无色上清；④向上述③中上清加入500μ L异丙醇将管中液体轻轻混勻，室温静置15min，沉淀RNA ；⑤将上述④溶液于4°C，12000rpm离心lOmin，弃上清；⑥向上述⑤中沉淀加入ImL75%乙醇，轻轻洗涤。之后4°C，7500rpm离心6min，弃上清；⑦将上述⑥中沉淀晾干，加入适量的H2O溶解(65°C促溶10-15min)，然后置于-80°C保存。
2. cDNA 合成 RNA变性


本发明公开了一种β诺达病毒基因组全序列及其克隆方法，该方法采用长距离逆转录酶和长距离高保真聚合酶，依据RT-PCR原理扩增一种β诺达病毒基因组两条RNA的全长cDNA，将扩增产物克隆到T载体进行测序比对分析，获得具有正确碱基序列的克隆。本发明有利于设计病毒检测方法，了解病毒的分类、致病性及分子流行病学等，也能通过人工改造将其作为基因转移载体使用。