一种双标记重组家蚕杆状病毒及其制备方法和应用的制作方法【技术领域】[0001]本发明涉及生物学基因工程【技术领域】，具体涉及一种双标记重组家蚕杆状病毒及其制备方法和应用。[0002]杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90~180kb之间。家蚕核型多角体病毒是家蚕脓病的病原体，对于杆状病毒的研究大多数集中在苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)，而对于家蚕核型多角体病毒(BmNPV，又称家蚕杆状病毒)的研究的报道甚少，所以开展家蚕核型多角体病毒的侵染机制的研究对于防治家蚕脓病具有重要的意义。[0003]杆状病毒表面展示系统是在对病毒基因组结构和功能深刻认识的基础上发展起来的。杆状病毒表面展示系统以杆状病毒为载体，外源基因片段插入到病毒衣壳蛋白的信号肽与成熟蛋白之间，与衣壳蛋白融合表达或与特异性的锚定部位结合表达。融合蛋白经过真核细胞内质网加工后，信号肽被切除，形成N端融合蛋白，借助杆状病毒稳定地表达并展示于感染细胞或病毒粒子的表面，筛选得到表达有特异目的蛋白的杆状病毒粒子。外源蛋白或多肽也可与杆状病毒的囊膜糖蛋白融合，利用杆状病毒作为载体而在感染细胞的表面或病毒粒子的囊膜上获得有效的展示。在杆状病毒表面展示中，用于与外源蛋白发生融合的囊膜糖蛋白gp64是AcMNPV、BmNPV等I型出芽病毒特有的结构蛋白，与二硫键相连以同源二聚体、三聚体或四聚体的方式存在于囊膜内及被感染细胞或病毒粒子的表面，介导病毒和昆虫细胞的融合与侵染过程。AcMNPV中gp64基因全长约512bp，是I型跨膜糖蛋白，属于磷酸糖基化蛋白，含有2个高度疏水区，N端为带有一个内质网加工的信号肽序列，近C端是一个疏水的跨膜结构域(transmembrane domain, TM),与TM相连的是亲水性结构域，可以把病毒囊膜内的糖蛋白与细胞膜内的糖蛋白连接在一起。外源蛋白在信号肽的C端与gp64的N端发生融合，融合蛋白经过真核细胞内质网加工后，信号肽被切除，形成的N端融合蛋白可稳定地在杆状病毒表面进行`表达，形成杆状病毒“假病毒”。另外，也有将目的蛋白融合于gp64的膜锚定结构域中，即将目的基因插入到gp64基因的ORF中，这种做法虽然破坏了 gp64的完整性，但可以实现目的蛋白的表达展示。
[0004]本发明要解决的技术问题是现有技术中还没有一种模式生物可以用于研究核型多角体病毒对宿主的侵入机制及后续防治该病毒药物的研制。[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种双标记重组家蚕杆状病毒，该病毒含有杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因、增强型绿色荧光蛋白EGFP基因和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因形成的串联基因SP-EGFP-TM，以及杆状病毒衣壳蛋白VP39基因和红色荧光蛋白RFP基因形成的串联基因RFP-VP39或VP39-RFP。[0006]优选地，所述串联基因SP-EGFP-TM的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述串联基因RFP-VP39的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述VP39-RFP的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。[0007]上述双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，步骤如下:
[0008](I)依次串联杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因、增强型绿色荧光蛋白EGFP基因和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因，形成串联基因SP-EGFP-TM ;串联杆状病毒衣壳蛋白VP39基因序列和红色荧光蛋白RFP基因序列，形成串联基因RFP-VP39或VP39-RFP ；
[0009](2)将串联基因 SP-EGFP-TM 和 RFP-VP39，或 SP-EGFP-TM 和 VP39-RFP 插入到病毒表达载体的多克隆位点，构建成重组杆状病毒转座载体；
[0010](3)重组杆状病毒转座载体转化大肠杆菌感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养基上培养40~48小时，挑取白斑，培养20~24小时后抽提基因组进行PCR鉴定，鉴定正确的为双标记重组家蚕杆状病毒。
[0011]优选地，步骤(1)杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因的扩增引物为SEQ IDN0:4~5，杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因的扩增引物为SEQ ID N0:6~7，增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的扩增引物为SEQ ID N0:8、，红色荧光蛋白RFP基因的扩增引物为SEQ ID N0:l(Tll或SEQ ID NO: 12~13，杆状病毒衣壳蛋白VP39基因的扩增引物为SEQ IDNO:14~15 或 SEQ ID NO:16~17。
[0012]优选地，步骤(2)所述病毒表达载体为pFastBac-Dual。
[0013]优选地，步骤(2)所述串联基因SP-EGFP-TM插入到载体pFastBac-Dual的PplO启动子后的多克隆位点；串联基因RFP-VP39或VP39-RFP插入到载体pFastBac-Dual的PpH启动子后的多克隆位点。
[0014]优选地，串联基因SP-EGFP-TM是通过Sma I和Xho I双酶切位点插入的；串联基因RFP-VP39或VP39-RFP是通过BamH I和EcoR I双酶切位点插入的。
[0015]优选地,步骤(2)所述大肠杆菌为DHlOBac。
[0016]优选地，步骤(3)所述PCR的扩增引物如SEQ ID N0:18~19所示。
[0017]本发明所述的双标记重组家蚕杆状病毒作为家蚕核型多角体病毒模式生物的应用。
[0018]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0019]GP64是野生型家蚕杆状病毒的囊膜糖蛋白，野生型的病毒将GP64蛋白表面展示在囊膜上，本发明改造的病毒继续用GP64的信号肽(SP)和跨膜区(TM)，中间的展示蛋白将原先的GP64改成绿色荧光标记蛋白EGFP，这样就将EGFP表面展示在囊膜上。同理，红色荧光蛋白RFP被表达在核衣壳上。
[0020]病毒株Bmgp64EGFP-RFPVP39基因组与野生BmNPV基因组的区别在于两个转座子Tn7L、Tn7R之间的基因序列不同，在本发明的重组载体pFastBac-Dual-gp64-EGFP-RFP-VP39中，转座子Tn7L、Tn7R之间的基因序列与野生BmNPV的转座子Tn7L、Tn7R之间的基因序列发生了同源重组，那么，本发明的目的基因SP-EGFP-TM和RFP-VP39 (或VP39-RFP)就交换到了野生BmNPV基因组上，产生的病毒就是带有荧光蛋白标记的重组病毒。[0021]本发明的重组病毒是利用双色荧光蛋白对病毒衣壳及囊膜蛋白进行荧光标记，能够更清楚地观察到杆状病毒侵染复制的全过程，采用全球先进的显微设备(莱卡三通道激光共聚焦显微镜，电子显微镜)对病毒的入侵，表达，组装进行实时监控，更直观的理解病毒的侵染机制。可以通过该病毒研究其他展示蛋白在宿主细胞中的表达、加工展示过程情况。



[0022]图1 是重组转移质粒 pFastBac-Dual-gp64-EGFP-RFP_VP39 结构示意图。
[0023]图2是原始质粒pFastBac-Dual图谱示意图。
[0024]图3是串联基因SP-EGFP-TM的重叠及鉴定结果，其中左图M =DNA标准分子量，I:SP-EGFP重叠基因，2 =SP-EGFP-TM重叠基因；右图M:DNA标准分子量，I =SP-EGFP-TM的PCR扩增产物，2:pFastBac-Dual-SP-EGFP-TM的双酶切产物。 [0025]图4是VP39与RFP的重叠及鉴定结果，M为DNA标准分子量，其中左图1:使用引物对VP39.1扩增所得的VP39产物，2:使用引物对RFP.1扩增所得的RFP产物，3:使用引物对RFP.2产物，4:VP39.2PCR产物；中间图中1:VP39_RFP重叠基因，2:RFP_VP39重叠基因；右图中1:RFP-VP39重叠基因PCR扩增产物，2:RFP-VP39重叠基因双酶切产物。
[0026]图5是家蚕重组杆状病毒株Bmgp64EGFP-RFPVP39激光共聚焦显微图，其中红色显示为红色荧光蛋白RFP标记的杆状病毒衣壳蛋白VP39，绿色显示为增强型绿色荧光蛋白EGFP标记的杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM。

[0027]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0028]生物材料来源:pFastBaC-Dual载体、大肠杆菌TGl感受态细胞和大肠杆菌DHlOBac购自Invitrogen公司；野生家蚕杆状病毒BmNPV、含EGFP的重组载体、含有红色荧光蛋白RFP基因的质粒均由本实验室保存。
[0029]因gp64信号肽(SP)基因序列(SEQ ID NO: 20)、gp64跨膜区(TM)基因序列(SEQID N0:21)、杆状病毒衣壳蛋白VP39基因(SEQ ID N0:22)、EGFP蛋白的基因(SEQ ID NO:23)和RFP的基因(SEQ ID N0:24)均为现有已知基因序列，所以本发明使用的提供上述基因的载体如野生家蚕杆状病毒BmNPV、含EGFP的重组载体何含有红色荧光蛋白RFP基因的质粒可以更换成任何其他含有上述基因的生物材料。
[0030]实施例1家蚕重组杆状病毒株Bmgp64EGFP-RFPVP39的制备
[0031](I) gp64信号肽(SP)基因的扩增
[0032]以野生家蚕杆状病毒BmNPV的基因组为模板，分别用引物P1、P2进行PCR，扩增gp64的信号肽(SP)基因序列。PCR反应参数设为:98°C预变性5min，98°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s, 30个循环，72°C总延伸5min。
[0033]Pl:ACACCCGGGATGGTAGGCGCTATTG (SEQ ID N0:4)；
[0034]P2:CCTCGCCCTTGCTCACCGCCGCAAAGGCAGAATG (SEQ ID NO:5)。
[0035]反应体系如下: