专利名称：一种油菜csRRM2基因在改良油菜产量性状方面的应用的制作方法目前国内外利用转基因改良作物经济性状的技术与方法主要是根据已知的功能基因与表型性状的关系，采用组成型表达载体或组织专一性表达载体将目的基因导入目标植物，以期获得作物特定经济性状或抗逆性性状的改良。这一方法利用的基因都是来自天然的具有完整结构的基因序列或具有完整编码顺序的cDNA。采用天然基因的某一结构成分改良作物的经济性状目前少有报道。 我们尝试采用功能基因的某一结构域的编码顺序，利用转基因方法将其克隆到表达载体，然后导入农作物细胞，以期获得重要经济性状发生改良的转基因再生植株。通过这一方法扩大功能基因转基因的利用范围，达到常规转基因方法难以产生的在生产上可以利用的效果。
本发明的目的在于提出一种油菜CSRRM2基因及其同源基因在改良油菜产量性状方面的应用。本发明利用过表达油菜CSRRM2基因及其同源基因的载体转化油菜，以改良油菜的产量性状；实施例中，本发明将过表达油菜cSRRM2基因的载体用于转化油菜品种No. INannongyou,使得油菜品种No. I Nannongyou的产量性状发生明显改善,主要表现为增加果荚数目及种子大小。本发明还包括油菜CSRRM2基因的分离、克隆与转基因功能研究等。本发明还包括利用过表达油菜CSRRM2基因及其同源基因的载体，转化包括大豆，甜菜以及玉米，小麦，高粱等作物，用于产量性状的改良。(I)油菜csRRM2基因与蛋白结构组成 根据本申请人之前获得专利的水稻csRRM2基因(专利号2004 I 0084319. 3)，利用已发表登录的国际数据库中的EST及油菜基因组数据，设计PCR引物，从油菜品种No. INannongyou幼苗中克隆到了油菜csRRM2基因,其序列如SEQ. ID NO. I所示,编码83个氨基酸，其序列如SEQ. ID N02.所示。油菜CSRRM2基因编码的蛋白结构见图I所示。(2)过表达油菜csRRM2基因的表达载体的构建 本发明实施例中使用的油菜csRRM2基因如SEQ. ID N01.所示。采用pBIN438为表达载体，利用酶切位点沿ol和II将油菜csRRM2基因序列插入到pBIN438载体35S组成型启动子下游，得到过表达油菜cSRRM2基因的表达载体。其结构图如图2所示。其中，载体pBIN438由植物转化载体pBI121改造所得(可参见1.《西北植物学报》2006年11期“TaNHX_2基因植物表达载体的构建及在拟南芥中的功能分析”俞嘉宁原江锋杨建雄赵咏梅王喆之张志琪；2.《中国生物工程杂志》2009年02期烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒双价RNA沉默抗病载体的快速构建潘丽张永光王永录王宝琴王文秀方玉珍蒋守田张维德董金杰吕建亮谢庆阁)。(3)油菜CSRRM2基因转化实验 采用油菜品种No. I Nannongyou为转基因受体，构建过表达油菜csRRM2基因的转基因植株。将油菜品种No. I Nannongyou成熟种子消毒后接种在含MS培养基上。待幼苗子叶微张时将子叶去除，留0. 4 I. Ocm的下胚轴，在解剖镜下剥离出茎尖，保留两个叶原基。利用农杆菌侵染的方法将油菜CSRRM2基因过表达载体导入幼苗，用卡那霉素筛选阳性植株。(4)转化处理试管苗移栽及转化植株后代的分子检测
将油菜csRRM2基因转化处理的油菜品种No. I Nannongyou试管苗移栽田间，并采用PCR扩增技术检测候选的抗性植株，再用Southern Blotting技术最终鉴定(图3所示)，获 得阳性TO代植株。(5)油菜csRRM2基因的实时定量PCR (RealTimePCR)检测
油菜csRRM2基因在转基因植株中的表达量比油菜品种No. I Nannongyou植株明显升闻。见图4所不。(6)油菜csRRM2基因转基因植株产量性状的调查与统计
将4个油菜csRRM2基因转基因株系(序号为A-5，A_7，A_22，B-1)和油菜品种No. INannongyou (CK),每个株系各种植20株,行株距为50厘米x 50厘米。在成熟期统计各株系20个单株的千粒重(克)、油份(%)、株高(cm)、茎直径(mm)、单株果荚数、果荚长度(cm)、 果荚宽度(_)、单个果荚种子数、单株种子产量(g)、种子产量增产，计算平均值及SD值，统计结果如下
|A-5|A-7lA-22|B-1|CK
亏^重(克)4.3±0.2 iTT+0.2 l4±0.2 _4.3±0.1 4.0±0. I
MIjv (%)39.8±1.0 ￥7§±1.8 $9.9±1.5 _40.1±1.6 38. I±1.4
(cm)150.6±6.1 T^T2±10.6 T~56. 3±9.9 _150.7±8.1 136. 3±7.6
Ml[径(mm)18.3±0.5 TiT^±1.5 T~9.2±1.6 _18.7±2.2 17.0±2. I
1 果荚数575. 8±52. 5 ~^T8±8. 9 &1. 5±55. 3 _ 686. 0±56. 4 558. 8±62. 2
粟寨长度(cm) 6.5±0.6 677+0. 4 7! 7±0. 5 _7.0±0.3 6. 4±0. I 宽度(mm) 5.2±0.3 KT±0. 2 可 5±0. 3 _5.3±0.1 4. 9±0. 3 軍不果荚种子数 24.8±1.1 瓦71±1.4 j~8.6±1.5 _25.2±2.4 23. 5±2.3 軍备种子产量(g) 25.5±2.9 石T5±2.9 j~2.6±2.7 _24.6±2.6 18. 5±2.0 两字产量增产 |37.20%|30.00%|20.90%|31.60%|nA
油菜CSRRM2基因转基因植株明显较油菜品种No. I Nannongyou植株增大，见图5所示。
根据上述田间调查及考种数据，与对照相比，油菜CSRRM2基因转基因植株的产量性状优于
对照油菜品种No. I Nannongyou,有的株系单株增产可达37. 2%。油菜csRRM2基因转基因
增加产量的主要原因是增加果荚数目及种子大小。(7)油菜CSRRM2基因转基因植株器官及细胞明显增大
油菜csRRM2基因转基因植株较对照油菜品种No. I Nannongyou，种子，果荚，花粉大小及子叶柄细胞大小明显增大，见图6所示。csRRM2基因所表现出来的上述功能，可以进一步用来改良农作物或其他经济作物的许多重要经济性状。因为在双子叶和单子叶植物中均存在csRRM2基因，并且该基因在双子叶和单子叶植物中具有很高的保守性。因此，本发明方法对双子叶和单子叶作物均有效果，可以改良其它双子叶和单子叶作物的经济性状，如增加果实重量，提高谷类作物如小麦，玉米，高粱，大麦的籽粒千粒重，提高大豆和甜菜的产量等，也可用于改变花卉的叶型和花朵形状，提高观赏价值，以及改变植物纤维的品质和产量。


图I为油菜csRRM2基因蛋白结构。图2为过表达油菜csRRM2基因的表达载体结构。
图3为油菜csRRM2转基因Southern Blotting鉴定结果。图4为油菜csRRM2基因的实时定量PCR检测结果。图5为油菜csRRM2转基因植株的株型明显变大。图6为油菜csRRM2转基因植株的器官及细胞大小明显增大。

(I)挑取LBA4404单菌落接种至5 ml YEP(链霉素30 mg/L，含利福平100 mg/L)的培养基中，28 °C，200 rpm振荡过夜培养。(2)将2 ml过夜培养菌液加至50ml含有同样抗生素的YEP培养基中，28°C，220rpm摇菌4 h,使0D600达到0. 5左右。(3)5000 rpm离心5 min,去上清液,加入10 ml的0. 15 mol/L NaCl溶液悬浮细胞，悬浮后冰浴20 min。(4) 4。。，5000 rpm离心 5 min,去上清液,加入 Iml 冰预冷的 20 mmol/L 的 CaCl2 :悬浮细胞，分装至I. 5 ml EP管(内含15%甘油)中，每管200 p I备用。3、根癌农杆菌感受态细胞的转化
取5 u I的油菜csRRM2基因过表达载体质粒DNA加入到己制备的200 u I LBA4404感受态细胞中，冰浴30 min，加液氮迅速冷冻5 min，37°C水浴锅融化5 min，加入ImlYEP液体培养基，28°C 150 rpm轻摇2-3h，收集菌体涂布于含有卡那霉素50ml/L、利福平100mg/L和链霉素30 mg/L的YEP平板上，28°C培养2天。4、油菜转化材料的制备植物材料的处理及培养
(I)本实验用油菜子叶下胚轴为受体材料。取油菜品种No. I Nannongyou种子若干,去除破损和空瘪的种子，用水冲洗I小时，然后用75%酒精灭菌4分钟，再用无菌水冲洗3遍，再用0. 1%取(12表面灭菌15 min，用无菌水冲洗3遍，滤纸吸干水分后，置于固体MS培养基(含蔗糖30g/L)上暗培养，种子萌发后再移至光下培养，8-9天后取出无菌幼苗将子叶柄切下，小心剥掉两子叶之间小芽，即得到了做为转化材料使用的子叶柄。置于含2mg/L 6-BA和I mg/L 2,4-D的MS培养基上暗培养2天。(2)挑取鉴定结果为阳性的农杆菌单菌落，接种至含有相应抗生素的YEP培养液中，28°C，200 rpm摇床培养16个小时，使农杆菌培养至对数期，用含蔗糖30g/L的液体1/2MS培养基将其重悬至OD6tltl为0. 4-0. 5。(3)共培养将新切下的油菜子叶柄在菌液中侵染5min，用滤纸迅速吸干多余菌液，将子叶柄接种至含2mg/L 6-BA和I mg/L 2，4_D的MS培养基上，黑暗中共培养I 2天。(4)抗性植株筛选用液体1/2 MS培养基清洗子叶柄，再用滤纸吸干多余液体，将子叶柄插入附加有0. lmg/L NAA,4mg/L 6-BA, 5-8mg/L卡那霉素和500mg/L羧节青霉素的MS培养基(含蔗糖30g/L)中。14/10小时光周期，25-28°C培养。两周继代一次，共继代3次，看芽的情况可以适当减少筛选次数。(5)抗性植株移栽将筛选的绿芽接种到附加有0. 5mg/L NAA和0. lmg/L IBA的1/2 MS培养基(含蔗糖10g/L)上，当根长长至2cm以上时炼苗两天后即可移至土壤中。 5、油菜总DNA的提取
(1)在7ml离心管中加入2. 5 ml的CTAB提取缓冲液，65°C水浴锅预热；
(2)称取0.5g新鲜的油菜叶片，去除叶脉后置于预冷的研钵中(加入0. 04g PVP)，加液氮同时研磨至粉末；
(3)将冻粉迅速转至提取缓冲液中，尽快用玻璃棒混匀，65°C水浴锅保温30分钟，期间轻柔摇动4次，取出离心管自然冷却到室温；
(4)取等体积的氯仿/异戊醇(24/1)抽提两次，混合混匀，每次在室温下10000rmp离心10分钟留上清液；
(5)将上清渡转移至一洁净的离心管，加2/3体积的异丙醇.轻缓颠倒混匀，室温下放置15分钟
(6)10000 rmp离心10分钟，弃上清液
(7)用2ml 70%乙醇洗涤沉淀两次，室温下放置风干，溶于600 u I TE缓冲液中
(8)加入终浓度为50u g/ml的RNase. 37°C保温I小时;
(9)用等体积的氯仿/异戊醇(24/1)抽提两到三次，温和混匀，每次在室温下10000rmp离心10分钟；
(10)取上清液加入终浓度为02 0 4 mol/L NaCl，2倍体积的无水乙醇，放置I小时，12000 rEp离心10分钟；
(11)用70%乙醇洗涤沉淀2-3次，自然干燥后溶于30 50ul TE中备用。


本发明属于转基因技术领域，具体为油菜csRRM2基因在改良油菜产量性状方面的应用。本发明利用过表达油菜csRRM2基因及其同源基因的载体转化油菜，用以改良油菜的产量性状，其中，所述油菜csRRM2基因的序列如SEQ.IDNO.1所示。本发明采用油菜品种No.1Nannongyou为转基因受体，构建过表达油菜csRRM2基因的转基因植株。csRRM2所表现出来的这种功能可以用来改良农作物或经济作物的许多重要经济性状，如增加果实重量,提高谷类作物如小麦,玉米,高粱,大麦的籽粒千粒重,提高大豆和甜菜的产量等,也可用于改变花卉的叶型和花朵形状,提高观赏价值,以及改变植物纤维的品质和产量。