专利名称:消毒组合物及其在牙齿治疗中的应用的制作方法根管系统中的微生物和它们的副产物引起牙髓和根尖周(periapical)发炎(Kakehashi et al, 1965)。因此,认为根管系统的不完全消毒是持续性根尖周炎的主要原因(Seltzer & Bender 1967,Lin et al. 1992)。微生物感染的消除是根管治疗的主要目标之一。尽管极为努力,然而组织和培养研究证实了在根管治疗后微生物的持续存在(Nairet al.2005)。我们不能使根管系统完全消毒的原因之一是其结构的复杂性(Vertucci·1984, Wu et al. 2000)。另一个原因是,诸如细菌的微生物生存于生物膜结构中(Costertonetal. 1995, Watnick & Kolter 2000)。这使得它们对牙髓治疗过程更有耐性。由于其复杂的形态,根管系统的彻底机械清洗是不可能的。进行机械填充以使得能够用抗菌剂冲洗。目前的根管冲洗剂具有表面工作范围。由于其反应性质,最有效的消毒剂次氯酸钠不从主管(main canal)渗入侧部。一旦次氯酸钠遇到有机物质就失活(Moorer & Wesselink 1982)。洗必太(双氯苯双胍己烧)不渗入生物膜(Zaura-Arite et al.2001)。诸如IKI (IPI)、乙醇或洗必太的冲洗剂在清除根管系统中是不太有效的,因为它们缺乏组织溶解性质。在化学-机械清创之后平均每颗牙齿上持续存在4百万CFU。经由副管可以接近根尖周组织的残余细菌和其他微生物,保持慢性的炎性过程。取决于牙齿类型,多达百分之五十牙齿发生根尖分支。慢性感染和炎症是牙髓治疗失败的原因。由于检测失败的增加,随着CBCT (锥形束计算机断层成像)的引入失败率将增加(Estrela et al. 2008)。根管治疗以两种方式进行i)在牙科医生的椅子上的一次会见(就诊,session),用NaOCl作为消毒冲洗剂或ii)包括用NaOCl冲洗的两次或多次会见(就诊),同时在会见(就诊)之间将氢氧化钙(Ca (OH) 2)封入根管中以便进一步消毒。目前Ca(OH)2用作两次治疗会见(就诊,session)之间的管内涂敷(intracanaldressing)。其pH为12,Ca(OH)2是弱杀菌性的。这在一些关于细菌悬浮液(浮游细菌)的研究中有报道。对经诊断患有根尖周炎的受试者给予Ca (OH)2,以便达到额外的消毒并预防在两次治疗会见之间的管内菌群再生长。用于牙髓的抗菌剂具有一定劣势。例如,只有当氢氧化钙与微生物直接接触时是有效的(Siqueira & Lopes 1999)。而且,Ca(OH)2仅对一些菌种是杀菌性的,其刺激微生物菌群向更有耐性的菌种转化(Nakajo et al. 2006)。Ca(OH)2不能根除与牙髓治疗失败相关的幾肠球菌(E. faecalis) (Siren et al. 1997, Sundqvist et al. 1998)。Ca(OH)2 的长期应用削弱了牙质,并且Ca(OH)^MU的残余物难以去除。在我们的研究中观察到有趣的发现。使双菌种生物膜暴露至Ca(0H)2。在最初细菌百倍减少之后,在一周之后(实验结束)细菌数量恢复到十倍减少。这引起了对Ca(OH)2在生物膜上的抗菌效能的怀疑。而且,氢氧化钙组(类,group)显示存活菌落存在的生物膜的钙化(在死/活染色后用共焦激光扫描显微镜观测)。通过用棉球擦拭或用硬塑料设备刮削不能将钙化的斑块从模型中去除。这是本研究有趣的发现,因为Ca(OH)2是世界上唯一公认的管内药物。如果钙化也发生在根管中,那么这将更多地妨碍消毒。本发明的目的是提供改进的消毒或抗菌组合物,其能有助于克服目前可用的治疗的劣势
本发明人出乎意料地发现,典型地感染牙齿组织并引起其炎症的微生物易受渗透胁迫(osmotic stress)的影响,影响程度为对经感染的组织或处于受感染的风险中的组织应用高渗组合物将治愈或预防感染和/或由其引起的炎症。在不希望受到任何特定理论限制的情况下,假设是由于渗透胁迫,诸如细菌的引起炎症的微生物代谢耗尽,而导致其死亡。此外,发现了牙齿组织感染中涉及的微生物也易受酸性胁迫的影响。在不希望受到任何特定理论限制的情况下,假设酸性胁迫也有助于诸如细菌的引起炎症的微生物代谢耗尽。进一步假设,渗透胁迫和酸性胁迫的组合将比单独地应用这些胁迫因素中的一个更快速地导致微生物的死亡。因此本发明提供组合物,当局部应用时,在导致牙齿组织感染的微生物中引起渗透胁迫。本发明特别优选的实施方式中提供了组合物,当局部应用时,在导致牙齿组织感染的微生物中弓I起渗透胁迫以及酸性胁迫。此外,本发明提供了以上组合物在牙齿治疗中的应用,尤其是用于治疗或预防根尖、侧部或边缘牙周炎、齿龈炎、种植体周围炎或其他形式的口腔感染,例如在牙髓和/或牙周治疗期间,如根管治疗。而且,本发明提供了牙齿治疗的方法,尤其是治疗或预防根尖、侧部或边缘牙周炎、齿龈炎、种植体周围炎或其他形式的口腔感染的方法,例如在牙髓和/或牙周治疗期间或在植入手术期间,如根管治疗,包括引起渗透和可选地酸性胁迫的组合物的应用。而且,本发明提供了张度剂(tonicity agent)在制备用于牙齿治疗的药物中的应用,尤其是在治疗或预防根尖、侧部或边缘牙周炎、齿龈炎、种植体周围炎或其他形式的口腔感染中,例如在牙髓和/或牙周治疗期间或在植入手术期间,如根管治疗期间。图I :NaCl和Ca(OH)2对粪肠球菌和绿脓杆菌(P. aeruginosa)的减少的影响。图表显示了在暴露(小时)至NaCl和Ca(OH)2之后,以log CFU/生物膜(计)的细菌菌种CFU数量的减少。阴性对照包括平均2. OxlO8 CFU的粪肠球菌和3. 5xl08 CFU的绿脓杆菌,其数量随时间增长。图2 :用山梨酸钾 0. 05Μ、0. 5Μ、1Μ、1· 5Μ、2Μ (ρΗ7)、乙酸钠 O. 5Μ、1Μ、1· 5Μ、2Μ (ρΗ6或7)治疗2小时,生物膜的刃天青试验(Resazurinassay)的突光读数。NaOCl充当阳性对照,PBS和不治疗是阴性对照。最后的柱代表无菌对照。3小时后采集读数。提供如在前文中定义的组合物,其适合或意图用作防腐剂、抗生素、杀细菌剂、杀病菌剂或杀真菌剂的制剂。根据本发明,组合物优选适合并意图用于治疗和/或预防根尖、侧部或边缘牙周炎、齿龈炎、种植体周围炎或其他形式的口腔感染的方法中,优选用于治疗根尖、侧部或边缘牙周炎、齿龈炎或其他形式的口腔感染的方法中,最优选用于治疗根尖、侧部或边缘牙周炎的方法中。而且,优选组合物适合并意图用于牙髓和牙周治疗,尤其是根管治疗。因此,在一个实施方式中,提供了如在任何上文中定义的组合物,其包括能够引发酸性胁迫的一种或多种试剂,优选有机酸的钠盐,在牙齿治疗中用作消毒或抗菌制剂,优选在牙髓或牙周治疗中,尤其是在根管治疗中。在另一个实施方式中,提供了这样的组合物,其用于治疗和/或预防根尖、侧部或边缘牙周炎、齿龈炎、种植体周围炎或其他形式的口腔感染的方法中,更优选用于治疗和/或预防根尖、侧部或边缘牙周炎、齿龈炎或其他形式的口腔感染的方法中。在另一个实施方式中,提供了如在任何上文中定义的组合物,其包括向组合物提供高渗性的量的张度剂,在牙髓或牙周治疗或植入手术中用作消毒或抗菌制剂,优选在牙髓或牙周治疗中,尤其是在根管治疗中。在另一个实施方式中,提供了这样的组合物,其用于治疗根尖、侧部或边缘牙周炎的方法中。本发明的第二个方面涉及在受试者中的牙齿治疗的方法,优选牙髓治疗或牙周治疗,所述方法包括如在之前本文中定义的组合物的使用或应用。如可由上文推断的,优选本方法涉及治疗和/或预防根尖、侧部或边缘牙周炎;治疗和/或预防齿龈炎;治疗和/或预防种植体周围炎;治疗和/或预防口腔感染。本发明特别优选的实施方式涉及根管治疗的方法。如本领域的技术人员应理解的,本发明的治疗方法中进行的特定步骤将部分地取决于该方法的具体(exact)目标和性质(nature)。在第一个优选的实施方式中,提供了一种用于治疗和/或预防口腔感染的方法,口腔感染包括齿龈炎、种植体周围炎和牙周炎,其中该方法包括以一定量的冲洗液清洗受感染的牙齿组织或处于受感染的风险中的牙齿组织,优选整个口腔,该清洗液包括在任何上文中定义的组合物。典型地,本方法包括在治疗期间重复冲洗,优选至少两次,更优选至少三次,最优选至少4次。在特别优选的实施方式中,提供了预防性治疗,其中该方法包括冲洗处于受感染的风险中的牙齿组织,优选整个口腔,至少每月一次,更优选至少每两周一次,更优选至少每周一次,更优选至少两次,更优选至少每周四次,例如每日一次或两次。在本发明范围内确定最佳治疗方案在训练有素的医疗专业人员的技能范围内。在第二个优选的实施方式中,提供了根管治疗的方法,例如治疗根尖或侧部牙周炎,其中该方法包括以下步骤i)机械打开并扩大根管的空间,从所述根管空间中去除受感 染的牙髓(pulp);ii)通过用冲洗液冲洗根管空间,对根管空间消毒;iii)用临时性或永久性填料填充根管空间,以及iv)临时或永久地密封开口 ;其中如在本文中之前描述的组合物用作所述冲洗液和/或用作所述临时性根管填充剂(root canal filler)。在优选的实施方式中,根据本发明使用冲洗液和临时性根管填充剂。而且,如本领域的技术人员已知的,在机械打开和扩大根管空间的步骤期间,有时可以使用流体,其在本文中指的是“钻孔流体(钻孔液体,drilling fluid)”或“填充流体”。根据本发明,组合物也可以用于这种特定的目的。在钻孔/填充期间使用本发明的高渗流体,将减少生存的微生物在这样的手术期间沿着根管移动(drag )。在本方法特别优选的实施方式中,使用如上文描述的高渗液体或高渗流体之后,使用蒸馏水(低渗性)。高渗性和低渗性液体和/或流体的使用可以交替若干次。在不希望受任何特定理论的限制的情况下,应认为这样的交替使用将更进一步增强消毒的过程,因为细菌将适应高渗性和低渗性环境。适应(adaptation)花费时间和能量并且由于代谢耗尽最后将失败。本领域的普通技术人员已知用于治疗牙髓管(pulp canal)的技术,并且本发明特别地限制在这一点上。常规的技术包括使用由扭转的(twisted)或摇动的(grinded)正方形或三角形丝线制作的手动杆(手持杆),以各种量规的铰刀(reamer)或锉刀(file)和/或发动机驱动的旋转挫刀或铰刀的形式。用于将冲洗液(irrigation liquid)和/或填料引入至根管空间中的各种技术也是可用的。虽然使用手动冲洗设备可以冲洗仪器化(instrumented)的牙齿开口,但是用于将治疗液弓I入至牙髓腔和髓管中的机械自动化系统也是可用的。在此之前涉及的治疗,是本领域的技术人员已知的或者将明了的。因此,本领域的技术人员将明了如何在前文的基础上实施本发明。本发明的第三个方面涉及试剂盒,优选牙髓或牙周试剂盒,其包括第一容器、安瓿或注射器,容纳本发明的消毒剂或抗菌组合物,连同一个或多个选自由以下构成的组中的物品(项目,items):牙髓或牙周毛刷(bristle)、铰刀(reamer)和挫刀;牙髓或牙周冲洗针或头;牙髓或牙周冲洗器;容纳牙髓或牙周治疗组合物的另外的容器、安瓿和注射器,该组合物选自根管填充剂、根管封闭剂和牙齿粘固剂(cement);以及螺旋分配器(分配螺旋器,distributing spirals),例如螺旋输送器(lentulo spirals)。在本文中涉及的各种项目,是本领域的技术人员已知或将明了的。本发明的第四个方面涉及张度剂在药物制备中的应用,所述药物在牙齿治疗中用作消毒或抗菌制剂,其中所述消毒或抗菌制剂包括向药物提供高渗性的量的所述张度剂,根据已经在任何上文中定义的。下列实施例进一步示出了本发明的某些实施方式,而不以任何方式限制其范围。实施例实骀I进行这个实验以确立本发明的组合物(实验药物或“ E M,,)的效能(有效性),在根管治疗中使用6. 2M的NaCl溶液,并与氢氧化钙(CH)比较其效能,如在本文档的背景技术中已经解释的,目前氢氧化钙是对治疗的选择。因此,实验设置是在粪肠球菌和绿脓杆菌的 生物膜上将EM的杀菌效果与CH进行比较。材料和方法最近Deng et al,2009描述了在此处使用的生物膜模型。简而言之,使附着在订制的不锈钢边缘上的圆形盖玻片,悬浮在接种细菌的培养基中。在这个模型中,生物膜生长是对抗重力的活性过程。使用双菌种生物膜,因为其对抗菌剂增加的耐性(Ozok et al. 2007,Kara etal. 2007, Adriao et al. 2008)。将粪肠球菌选定为测试的生物体,因为报道了与持续性根尖周病(periapical pathosis)有关(Sundqvist et al. 1998, Siqueira & Rocas 2004,Stuart et al. 2006)。促进其以持续性损害存在于经填充的牙根管中的因子包括以下能力侵入牙质管中(Haapasalo&0rstavik 1987,Weiger et al. 2002)、耐受 Ca(OH)2 的碱性pH (Evans etal. 2002, Nakajo et al. 2006)、经受长期饥饿(starvation)随后在血清存在下恢复(Figdor et al. 2003)、没有额外的营养素的情况下在根管中长期存活(Sedgleyet al.2005)、以及在实验室设置下容易生长。而且,已知粪肠球菌有效地从培养基中积累相容性溶质以中和(抵消)增加的渗透压(Pichereau et al. 1999)。绿脓杆菌是需氧的革兰氏阴性能动杆菌(motileiOd),以其优良的产生海藻酸盐的性质而闻名。无论表面多么平滑,绿脓杆菌在30秒内附着(Vanhaecke et al. 1990)。虽然归类为需氧的,绿脓杆菌在厌氧条件下存活(Yoon et al.2002)。其存在于牙根管中与失败的牙髓治疗有关(Ranta etal.1998,Siren et al. 1997)。微生物学使粪肠球菌V583和绿脓杆菌的细胞(均为临床分离物)生长,并在血琼脂平板上保持为纯培养物。在厌氧条件(80%的N2,10%的H2和10%的CO2)下使粪肠球菌生长,同时在空气中使绿脓杆菌生长,两者均在37° C下。因为它们的形状、革兰氏染色和气氛偏爱性,用CLSM和CFU区分两个菌种是十分简单的。在生物膜生长期间,培养物和生物膜的过夜生长培养基是脑心浸出物肉汤(8!11,(^0丨(1,8&8丨118如1 5,皿)和BHI-肉汤,其包括0. 5的BHI、50mM的管(pipes)、5%的鹿糖、ImM的Ca2+。在实验阶段,向BHI-肉汤中加入氯化钠(NaCl)(Merck,达姆施塔特,德国)以提高渗透值。使用的其他药物是BHI-肉汤中的饱和Ca(OH)2(淤浆)、2%的次氯酸钠(NaOCl) (Merck,达姆施塔特,德国)、在蛋白胨水(水中的1%蛋白胨(Oxoid))中的2%硫代硫酸钠(STS ),用于中和NaOCl。磷酸盐缓冲盐(PBS,Oxoid)用于洗涤阴性对照,对于NaCl、Ca(OH)2作为中和试剂,并且用于连续稀释。
生物膜生长通过使一环(Ioopful)细菌悬浮在5mL的BHI中并在空气中在37° C下培养过夜获得每一种微生物的新鲜培养物。通过600nm的光学密度测量估算CFU的数量,并且使读数与之前进行的细菌数量相关。在包含I. 5mL的BHI-肉汤的24-孔多孔板(GreinerBio-one, Frickenhausen,德国)的孔中接种含有大约2xl09个粪肠球菌的100 μ L和含有大约2χ107个绿脓杆菌的100 μ L0使安装在订制的不锈钢边缘中的直径为15mm的圆形盖玻片(MMG,盖玻片)悬浮在BHI-肉汤中。生物膜在盖玻片上生长,能够用共焦激光扫描显微镜(CLSM ;Leica SP2-0BS)监测生物膜的生长。使生物膜稳固地附着在玻璃片上,在不破坏生物膜的情况下允许处理盖玻片。在暴露在药物中之前,使生物膜在盖玻片上生长96h。在96-h生长之后,生物膜中的生物量增加,同时或多或少地建立了活细胞的量(Wilsonet al. 1996)。每日更新肉汤。在37° C下于空气中接种细菌,并使生物膜生长。在48h之后,借助于CLSM证实生物膜的生长。根据生产商的使用说明,在用Syto 9和碘化丙啶(PI)(LIVE/DEAD BacLight )·染色之后,用CLSM观测带有附着的生物膜的三个盖玻片。完整的活细胞染成荧光绿,而带有破损的质膜的死亡细胞染成荧光红。之后临床证实了生物膜的生长。实验在96h之后,将带有附着的生物膜的盖玻片浸没在NaCl-肉汤或Ca(OH)2-肉汤中持续4h、24h、48h、72h和168h。阴性对照保存在BHI-肉汤中。当适用的情况下,每日更新孵育流体。在2%的NaOCl中浸没10分钟充当阳性对照。在实验之后,从边缘上去除盖玻片,并将盖玻片浸没在大量中和试剂中对于NaCl组、Ca(OH)2组和阴性对照在PBS中10分钟,对于阳性对照在STS中30分钟。使用无菌棉签收获细菌细胞,并通过在I. 5mL的试管(Eppendorf, Standard Micro Test Tube 3810)中激烈地上下移动棉签50次使其再次悬浮于ImL的PBS中。连续稀释悬浮液,并将其放置在血琼脂平板上,用于总的活性数量测定(CFU)。当在空气中生长时,粪肠球菌和绿脓杆菌的CFU形态类似于彼此,但是当在缺氧下孵育时,与粪肠球菌相比,绿脓杆菌的CFU具有明显不同的形态。菌落非常小。因此,在37° C下厌氧地孵育板48h。测定了粪肠球菌(大的白色菌落)和绿脓杆菌(小的黑色菌落)两者的CFU。然后在空气中孵育板另外24h,以证明绿脓杆菌(大的黄绿色菌落)的存在或不存在。每一组由三个样品组成,并且每一次实验进行三次。共焦激光扫描显微镜(CLSM)分析为了成像,使用Leica DM-IRB倒置显微镜/SP2-A0BS共焦系统。用40x/NA I. 25HCX PLAPO油镜(oil objective)获得图像(512 X 512像素)。最终像素尺寸是O. 776 μ m。将针孔尺寸设置为lAiry,导致大约O. 5 μ m的Z分辨率。获得具有O. 3 μ m步长的图像栈(image stack)。用488nm激发,并分别对SYT0-9用500_550nm检测以及对PI用600-690nm检测,同时进行Syto_9和碘化丙啶(PI)的激发/检测。使用图片倍增管的增益和补偿(offset),将图像调节至系统的全(8位元)动态范围。用Leica软件产生2张图像(绿色和红色)的叠加。统计分析用对数转换CFU数量。通过单向方差分析(ANOVA)分析数据,以将实验组与阴性对照进行比较。显著性水平设置为a=0. 05。用统计包SPSS版本12 (SPSS Inc.芝加哥,IL,USA)进行分析。结果微生物学与对照相比,以log CFU减少每生物膜给出结果(图I)。对照包括8. l±0.61og(CFU)微生物每生物膜,其随时间逐渐增加。对于粪肠球菌和绿脓杆菌两者在72h之后和在168h之后在NaCl组中的CFU的平均log减少分别为6和8,并且与对照相比,是统计上显著的。在168h,对照生物膜包含平均I. 5x109CFU的绿脓杆菌,在168h之后不能检测到NaCl。粪肠球菌减少至平均40CFU。减少对于两个菌种是非常显著的(P〈0. 001),并且显示随时间的显著线性趋势。Ca(OH)2显著减少绿脓杆菌,(P=O. 02),然而,随着增加的应用时间,减少没有增 力口。Ca(OH)Jf粪肠球菌的减少是不显著的(P=O. 09)。在72h之后对于两个菌种检测到log2减少,但是在168h之后,细菌恢复增长直至平均log I减少。在10分钟暴露之后NaOCl组显示100%死亡。在实验阶段之后,用视觉观察暴露至NaCl的盖玻片,显示没有生物膜蚀斑(biofilm plaque)的迹象。在Ca(OH)2组中,出乎意料地观测到蚀斑的f丐化。在24h之后,所有样品显示生物膜钙化。在实验期间蚀斑的厚度增加。钙化的蚀斑稳固地附着在盖玻片上并且通过用棉签擦拭不能完全去除。共焦激光扫描显微镜(CLSM)对照生物膜显示活细胞和死细胞的质量嵌入非晶质量(amorphousmass)中。NaCl影响存活的细菌细胞的生长模式。用视觉观测以及在CLSM图像上,没有非晶生物质是可见的。因为NaCl组的盖玻片几乎不包含细菌,我们以更高的放大率检测盖玻片以寻找留下的细胞。Ca(OH)2影响生物膜的生长模式。细菌细胞形成集落(cluster)。在相同的样品的剖视图中这是清楚可见的。讨论在该生物膜模型中NaCl对细菌载量的减少显著高于Ca(OH)2 (图I)。通过吸收或合成不干扰其代谢的小离子和分子恢复胞内溶质的浓度,微生物中和由于胞外的高渗值导致的水活度(water activity)的降低(Csonkal989, Guttierez et al. 1995, Record etal. 1998)。具有低水活度的环境是否是致命的,也部分地取决于微生物适应这些改变的能力,并且取决于它们可达(范围)之内相容性溶质的可用性。低的高渗浓度的NaCl足以在低相容性的溶质的培养基中杀死细菌(Lee et al. 1972, Faklam et al. 1973, Pichereau etal. 1999, Bautista et al. 2008)。很有可能牙根管系统的未清除区域堆积营养素,给予微生物抵消环境变化的机会。在本研究中,通过在加入NaCl或Ca(OH)2的BHI-肉汤中使生物膜生长模拟未清除的根管。提供营养素也会防止饥饿导致的细菌死亡。储存以及合成相容性溶质是需能过程。一旦相容性溶质的储备或能源耗尽,细菌进入稳定期,随后细菌最终死亡(Csonka & Hanson 1991 )。渗透现象仅依赖于溶质的浓度。溶质对溶剂的吸引持续直至已经达到特定的平衡。因此,可以预期主根管的侧部的一些效果O值得注意的是,在暴露至NaCl之后,盖玻片上的粘液的增长(生物膜)已经消失,因此,用视觉观察,盖玻片比阴性对照和氢氧化钙组“更洁净”。用CLSM图像证实了非晶质的去除。显然,NaCl对生物膜基质的结构有一些影响。此外对于生物膜增长必要的胞外聚合糖类的形成可能已经被NaCl的存在所干扰。众所周知,生理盐的摄入有助于清除鼻塞或鼻窦。检索了文献,探寻解释。预先使用反渗透膜,回收废水用于产生洁净的水。该产业的主要挑战是膜的清洁,废水中的大量有机碎屑堵塞(污垢,foule) 了膜。使用单独的冲洗剂不能去除膜上堵塞物质。膜的清洁涉及物理和化学清洁;大块堵塞物的物理去除之后化学消毒(Ang et al.2006)。据发现,将堵塞的膜暴露至NaCl溶液中致使堵塞层的破坏和去除(Lee &Elimelech 2007)。在本研究中,没有提到术语生物膜,而是着力于堵塞的污染层。作者在其实验中使用海藻酸盐模拟堵塞物。本研究中发现的结果不能推断至根管系统中的情形,但是本研究可以对NaCl的清洁效果给予启示。Ca(OH)2是世界范围内最常用的管内药物。Bystrijm和同事(1985)首先测试了在根管中Ca(OH)2的抗菌性能。细菌数量减少。在1991年Sjdgren和合作者证实了这 些发现。在受感染的根管中应用Ca(OH)2+周之后,没有重新获得或培养出细菌,暗示了Ca(OH)2使根管无可培养的细菌。然而,应谨记根管的临床采样是由纸尖技术(paper pointtechnique)完成的。现今普遍承认这个技术是有许多缺点的,主要是因为纸尖不可能到达整个根管壁、侧管以及在化学机械清除过程存活的微生物可以占据的位置。该纸尖采样技术给出以下良好的指示可以从根管去除的那些不是仍然残存的那些(Sathorn etal.2007a)。而且,不可能培养或检测饥饿阶段的微生物。基于目前最好的可用的证据,当通过培养技术评估时,氢氧化钙从人类根管中消除细菌方面具有有限的效能(Peters etal. 2002, Waltimo et al. 2005, Sathorn et al. 2007b)。氢氧化钙对浮游细菌具有抗菌效能(Stuart et al. 1991, Georgopoulou et al. 1993, Ferreira et al. 2007),然而,微生物位于生物膜结构中的根管系统中(Chavez de Paz 2007a)。关于Ca (OH) 2对生物膜的影响的研究显示,在生物膜中粪肠球菌对Ca(OH)2是有耐性的(Abdullah et al. 2005, Chavez etal. 2007b)。Ca(OH)Jt微生物的作用的精确模式还没有充分阐明(Siqueira&Lopes 1999)。临床成果研究比较了用Ca(OH)2的药物的一次性治疗(single-visit treatment)与多次性治疗(multi-visits treatment),显示在组间的治愈中没有显著差异(Weigeret al. 2000,Peters et al. 2002, Sathorn et al. 2005, Molander et al.2007)。除了可疑的抗菌效果之外,使用Ca(OH)2有更多缺点。生物膜的钙化是Ca (OH)2的不希望的副作用并且严重妨碍彻底消毒。CLSM图像显示活性细菌聚集体嵌入至钙化的基质中。已显示粪肠球菌的生物膜在牙质上的I丐化(Kishen et al.2006)。氢氧化钙是弱杀菌性的(Nakajo et al. 2006),可能引起牙髓菌群向更有耐性的菌种转化。当Ca2+可用时,一些细菌菌种产生更多胞外多糖(Lattner et al. 2003,Sarkisova et al. 2005)。在本研究的实验期间,当ImM的Ca2+加入到肉汤中,同时在肉汤中没有钙时,CLSM图像显示在盖玻片上形成活性粪肠球菌聚集体,粪肠球菌没有附着。这些研究结果可以使得使用Ca(OH)2作为无害的内部-访问空间修复物(inter-visitspace-maintainer)可疑,但是这需要进一步研究。结论在这个模型中,粪肠球菌和绿脓杆菌产生了可再现的和稳定的双菌种生物膜。高渗盐溶液能够在生物膜中杀死受感染的根管的菌群的典型微生物,因此适宜于用作根管消毒剂。在这个模型中氢氧化钙是无效的。实骀 2弱酸具有低于5的pKa。只有当酸的质子化、不带电的形式扩散至细胞中时,可以引发弱酸胁迫。因此,药物的pH值必须低于细胞的pH值。相比于在较高的pH值下,在低于5. 5的低pH值下需要具有较低的酸浓度,为了相同的效能,必须提高浓度。但是在pH5. 7下,牙质和釉质发生脱盐(脱矿质)。证明肉汤溶液中6. 2M的NaCl在双菌种生物膜上是杀菌性的。在暴露一周之后达到IO8减少和IO7减少,导致一个菌种的根除(实验I)。应认为,较高浓度的吸湿性盐将是更强杀菌性的,导致所有菌种(包括粪肠球菌)更快和更可靠的根除。通过对细菌施加另一种附加的胁迫因子,将增加效能。这致使EM以较高的摩尔浓度发展,并且EM的发展刺激微生物内额外的弱酸胁迫,或两者。在初步研究中使用的相同的生物膜模型中,将根据效能筛选在各种优选的实施方 式中提到的已经确定的化合物。材料和方法在悬浮于细菌接种液中的盖玻片上培养粪肠球菌和绿脓杆菌的双菌种生物膜。培养生物膜24h。在4h、24h、48h期间将附着有生物膜的盖玻片浸没在实验化合物中。2%的次氯酸钠和BHI-肉汤充当阳性和阴性对照。在用生理盐水(PBS)冲洗之后,从盖玻片上收获细菌细胞并将其再次悬浮于PBS中,连续稀释,置于血琼脂平板上,并在37° C下厌氧地孵育48h和在空气中24h。通过测定菌落形成单位(CFU)评估杀菌效率。测试了碘化钠、氯化镁和甘露醇(高渗透值)和乳酸钠、乙酸钠、山梨酸钠和甲酸钠(渗透和弱酸胁迫的结合)。实验 3本研究的目的是研究牙质对EM的作用模式是否有抑制性影响。似乎冲洗溶液和局部消毒剂在牙髓中的抗菌效能在体内比在体外更差。对于在体内性能较低的原因有几个,但是显然牙质和存在于坏死的根管中的其他物质使消毒剂失活是一个因素,其对从根管系统中完全根除微生物的公认困难做出贡献。当向试管中加入微生物和抗菌剂时,在体内研究中牙质碎屑具有缓冲能力。在该体外研究中粪肠球菌的过夜培养暴露在含有和不含附加的牙质碎屑的药物中。在孵育24h之后,进行连续十倍稀释并在血琼脂平板上培养。对菌落计数。这致使证实了 EM的不同实施方式的活性以及EM的不同实施方式的最佳缓冲。实验4:在粪肠球菌生物膜上筛选将用作根管消毒剂的化合物的刃天青代谢试验。在非外科根管治疗之后,在如峡部(isthmuses)的远解剖部位仍然可以检测到在生物膜上成群的微生物。生物膜是一个宽泛的定义,其为通常在固液界面积累并装入在高度水合的胞外聚合物质(EPS)的基质中的微生物聚集体。微生物细胞存在于并包围在EPS的自产生基质(self-producedmatrix)中,因此,其不易受如,例如抗生素的抗菌作用的影响。本研究的目的是选择具有其最有效的浓度和pH的最有效的化合物,其抑制粪肠球菌的单菌种生物膜的代谢。选择了几种化合物,其饱和溶液比氯化钠具有更高的摩尔浓度或其结合高溶解度和弱酸胁迫作用。为了证实抗生物膜的作用,在生物膜模型中筛选了这些化合物。在生物膜研究活力测试中,通常应用菌落形成单位(CFU)计数。这种方法是费力的、消耗时间的,并且不适合高通量筛选。此外,生物膜在平板接种之前必须有效地从表面去除和分散,而该过程的效率通常是值得怀疑的。之前已经建议了更简单的方法(例如,荧光活/死细胞染色和代谢活性指示剂),因为它们可以是高通量的并且避免生物膜脱离/分散的步骤。刃天青是常用的代谢活性指示剂中的一种。其为无毒的、水溶性染料(蓝色和非荧光性的),其可以由代谢活性细菌还原成水溶性试卤灵(resorufin)(粉红色和高度荧光性的)。其已经用于评估浮游细菌的活力,对胁迫和细菌污染的适应性。最近,还开发了其在微量滴定板中生物膜定量的潜能,并且从测试的六次试验,建议其作为CFU计数的最佳替换。其也成功用于在几种临床相关(不经口的)病菌的单菌种生物膜上评估消毒效能。
材料和方法在本研究中使用了临床粪肠球菌株E2 (由Dr CM. Sedgley馈赠)(22)。在37° C下,在血琼脂上厌氧地常规培养菌株。如之前描述的(17),生物膜在改良的半组合生物膜培养基(BM) (modified semidefined biofilmmedium)中生长。培养基的 pH 为 7. O。生物膜在活性附着卡尔加里(Calgary)生物膜模型中生长。该模型由标准96-孔微量滴定板和适合该孔(NuncTM, Roskilde, Denmark)的带有相同数量的聚苯乙烯柱(栓、钉,peg)的盖(23,24)构成。选择在平底96-孔微量滴定板中避免潜在的细菌沉降,而对消毒治疗试验保持96-孔的高通量优势。将粪肠球菌的过夜培养物稀释至加有O. 2%蔗糖的BM培养基中的大约I. 2xl08个细胞/mL。将200 μ L的细胞悬浮液分配至无菌的96-孔板中。然后用包含96个柱的无菌盖覆盖板。在孵育8小时后,将柱置于新鲜BM (含有O. 2%蔗糖)中。在孵育另外16小时后,将带有附着的生物膜的柱转移至含有待测化合物的96-孔板中。处理生物膜15min、l或2小时,在这之后,通过将生物膜柱浸没在中和剂(用1%硫代硫酸钠缓冲的蛋白胨水)中持续5分钟停止处理(18)。使治疗对照组也经受中和剂孵育,在这之后,在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤生物膜三次。随后,将柱浸没在含有O. 2%蔗糖的BM培养基中的O. 016mg/mL刃天青中并在37° C孵育。使用485nm激发和580nm发射波长的突光设置,在室温下,在突光计(SpectramaxM2;Molecular Device, Sunnyvale, CA)中记录每一个孔的突光强度(FI)。在10分钟和3小时采集读数。对于一次实验,需要I个和半个96-孔板以测试具有pH 6或7的各种浓度的化合物。对照组为保存在BMS中的生物膜、保存在PBS中的生物膜,阴性对照,而用2%次氯酸钠处理的生物膜作为阳性对照组。孔的其余部分用于无菌对照。基于它们的高溶解度、无毒性和弱酸性质,选择测试的化合物。在本试验中,测试了甲酸钠、乙酸钠、乳酸钠和山梨酸钾。也包括氯化钠从而仅基于渗透胁迫使其效能与具有渗透和弱酸胁迫的化合物相比较。在一系列级联实验中,顺序地删除证明为不令人满意的化合物或浓度。关于治疗效能的评估
刃天青代谢试验。如最近已经由Jiang et al. 2011建立的,刃天青可以用作粪肠球菌的代谢活性指示剂。当在治疗之后评估生物膜的代谢时,在37° C下在加入刃天青储备溶液的BMS中孵育生物膜,以获得最终浓度为O. 0016%。在10分钟(基线)或3小时(恰好在峰读数之前)之后,采集FI读数。进行四次该实验并重复两次。对于所有FI读数,包括O. 0016%的刃天青与无菌BMS混合的背景对照组以记录背景FI变化,随后从每一个孔的FI中减去(扣除)。在治疗之后,将治疗效能计算为FI值相对于对照组中的值的百分数减少。在图2中示出了结果。参考文献 Abdullah M,Ng YL,Gulabivala K,Moles DR,Spratt DA(2005)Susceptibiltiesof twoEnterococcus faecalis phenotypes to root canal medications. Journal of·Endodontics 31,30-6.· AdriaoA, Vieira MiFernandes IiBarbosa M,Sol MiTenreiro RP,Chambel I,Barata B,Zilhao I,Shama G,Perni S, Jordan SJ, Andrew PW,Falciro ML (2008)Markedintra-strain variation in response of Listeria monocytogenes dairy isolates toacid or salt strcssand the effect of acid or salt adaptation on adherence toabiotic surfaces. InternationalJournal of Food Microbiology 31,142—50.· Ang WS, Lee S,Elimelech M(2006)Chemieal and physical aspects ofcleaning oforganic-fouled reverse osmosis membranes. 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1.组合物,包括赋予所述组合物高渗性的量的一种或多种张度剂,在牙齿治疗中用作消毒或抗菌制剂,所述组合物包括选自有机酸和/或其盐的组中的张度剂。
2.根据权利要求I所述的组合物,其中,所述张度剂选自由有机酸盐构成的组,优先选自由有机酸的钠盐、钾盐和镁盐构成的组。
3.根据权利要求I或2所述的组合物,包括赋予所述制剂高渗性的量的所述有机酸和/或有机酸盐。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中,所
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