专利名称：一种利用假丝酵母发酵生产甘油的方法甘油是ー种重要的轻化工原料，广泛应用于化妆品、牙膏、烟草、香精、水性油墨、印染纺织、涂料、合成树脂、皮革、造纸、制药、食 品和国防等各个领域的1700多种产品。在我国，由于受合成洗涤剂的冲击，肥皂行业日渐萎缩，甘油产量大幅下降。因此，利用耐高渗透压酵母发酵生产甘油的产业化前景看好。耐高渗透压酵母ぬ/7みゐglycerinogenes发酵生产甘油具有高产量、高得率和高回收率等优点，在我国得到了较好的エ业化应用。但是，耐高渗透压酵母生产甘油的方法主要集中在传统的分批发酵法。为了提高甘油生产能力，降低生产成本，国内外ー些研究者对反复分批发酵エ艺、连续发酵エ艺和固定化发酵エ艺生产甘油进行了深入研究，但结果都并不十分理想。因此，本发明在前期研究的基础上，对Candida glycerinogenes反复分批发酵法生产甘油进行详细研究。本发明提出了一种新的方法，Candida Wァ在低磷合成培养基、低磷复合培养基和补充微量元素的低磷复合培养基中进行反复分批发酵，酵母细胞不经洗涤可分别回用12次、7次和13次，甘油平均产量(或平均得率)增高超过15. 0%，甘油平均产率增高达到37. 0%以上,而副产物产生较少。与传统分批发酵相比,glycerinogenes反复分批发酵具有发酵周期短、不需反复培养种子、节省原料成本以及节约能源动カ消耗等优点，实现了甘油高产量、高得率和高产率的相对统ー。本发明提供了ー种利用假丝酵母发酵生产甘油的方法，本专利假丝酵母为出发菌株，对发酵菌体在不同发酵培养基中的的回用次数进行了研究。
I. ー种利用假丝酵母发酵生产甘油的方法，其特征在于发酵吋，假丝酵母在低磷合成培养基、低磷复合培养基和补充微量元素的低磷复合培养基中进行反复分批发酵，酵母细胞不经洗涤可分别回用不同次数。2.步骤I所述的方法，其特征在于种子培养从刚转接培养好的新鮮斜面上挑取ー环菌株，接入500 mL摇瓶中(种子培养基装液量50 ml),于往复式摇床上32°C振荡培养20 h (振幅12 cm，振动频率为每分钟115次)。种子培养基(g*L ):葡萄糖110，尿素2，玉米浆9，自然pH值。3.步骤I所述的方法，其特征在于酵母细胞回用前的分批发酵按5%的接种量将种子液接入装有100 mL适磷发酵培养基的1000 mL摇瓶中进行分批发酵，发酵条件同种子培养。4.步骤I所述的的方法，其特征在于反复分批发酵当回用前适磷发酵培养基中的分批发酵结束时，将发酵液在2500 r-min下无菌离心10 min后倒出上清液，菌体不经洗涤全部转接入对应的低磷发酵培养基中，再按种子培养条件于摇床上发酵。当第一次细胞回用分批发酵结束￠8 h)时，按上述回用方法接人另一新鲜低磷发酵培养基中，继续发酵(56 h);然后，依此类推。5.步骤I所述的方法，其特征在合成发酵培养基(g*L ):葡萄糖210 230，尿素2，KH2PO4 0. 4(适磷)或 0. I (低磷)，MgSO4*7H20 0. 5，CaCl2 0. 1，MnCl4 0. I,初始 pH。6.步骤I所述的方法，其特征在复合发酵培养基(g*L ):葡萄糖210 230，尿素2，玉米浆12 (适磷)或2. 5 (低磷)，初始pH。7.步骤I所述的方法，其特征在补充微量元素的复合发酵培养基(g*L ):葡萄糖210 230，尿素2，玉米浆12 (适磷)或2. 5 (低磷)，MnCl4 0. 1，MgSO4 2，初始pH。8.步骤I所述的方法,其特征在于在低磷合成培养基、低磷复合培养基和补充微量元素的低磷复合培养基中进行反复分批发酵，酵母细胞不经洗涤可分别回用12次、7次和13次本专利所用的菌株为江南大学发酵甘油研究设计中心提供。·下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。 实施例I 本实施例说明在低磷合成培养基中c. glycerinogenes反复分批发酵的结果见表I。由表I可知，甘油的产量、得率和产率从第I个回用周期开始增加，并稳定在较高的水平；与细胞回用前的分批发酵结果相比，当回用周期达到12次时，整个反复分批发酵过程中甘油的平均产量、平均得率分别为141.3 g 和0.605 g-g^1，均提高了 16.7 %，而平均产率为2.37 g L h。增加了 40.6 %。但是，当细胞回用至第13次时,菌体开始出现衰退现象，到第15次时逐渐凝聚成黄色土样小菌团，甘油合成能力减弱，最后两次回用甘油产量仅增加了 9. 1%和7. 2%，而乙醇、有机酸等代谢副产物则显著增加。因此，当利用低磷合成培养基进行反复分批发酵时，C. glycerinogenes细胞回用周期确定为12次为宜。实施例2 本实施例说明以适磷和低磷复合培养基分别代替适磷和低磷合成培养基进行反复分批发酵，在整个发酵过程中细胞生物量的变化相当平稳，葡萄糖消耗与甘油生成的规律并未发生变化。由表2可知，利用复合培养基进行反复分批发酵，当细胞回用到第7次时，整个反复分批发酵过程中甘油的平均产量、平均得率和平均产率分别为147. 7 g L-1,0. 602g g_1和2. 45 g L-1 h—1，较之细胞回用前的分批发酵结果分别提高了 15. 0%、15. 3%和37.2%。当细胞回用至第8个周期时，菌体开始衰退，到第10个周期时凝聚成黄色土样小菌团，甘油合成能力减弱，回用10次时甘油产量基本不变。而且，从细胞回用至第9次后，副产物乙醇、有机酸等的生成也明显增加。因此，当利用低磷复合培养基进行反复分批发酵时,C. glycerinogenes细胞以回用7次为好。实施例3
本实施例说明补充微量元素的低磷复合发酵培养基中的反复分批发酵，与低磷合成培养基相比，G细胞在低磷复合培养基中的回用次数少。初步分析认为，
用于反复分批发酵的低磷合成培养基仅限制了磷源的用量，而低磷复合培养基由于玉米浆用量的限制从而同时限制了磷源和微量元素，因而菌体生长和甘油生产能力受到影响。为了证实这种推测一方面当酵母细胞在低磷复合培养基中回用至第9次出现衰退迹象时，再将其转入补充了微量元素的低磷复合培养基中，继续回用了 3次，结果发现菌体生长与各项指标都得到恢复，说明补充微量元素对维持酵母细胞良好的生长和产量性状具有一定作用。另一方面，酵母细胞在适磷复合培养基中发酵完毕后，将其全部转接人补充了微量元素的低磷复合培养基中进行反复分批发酵(见表3)。由表3可知，与细胞回用前的分批发酵结果相比，当细胞回用到第13次时，整个反复分批发酵过程中甘油的平均产量、平均得率和平均产率分别为149. 2g L-1、0. 602 g g—1和2. 55 g L—1 h—1，依次提高了 19. 5%、19. 4%和39. 9%。这进一步证明在低磷复合发酵培养基中补充微量元素，可以延长酵母细胞反复分批发酵的次数。因此，当利用补充微量元素的低磷复合培养基进行反复分批发酵时，C. glycerinogenes细胞的回用周期确定为13次。表I低磷和成培养基中反复分批发酵结果


本发明提供了一种利用假丝酵母发酵生产甘油的方法，本专利假丝酵母为出发菌株，对发酵菌体在不同发酵培养基中的回用次数进行了研究。