专利名称：皮肤胶原产生促进剂的制作方法近年来，已经进行关于皮肤机制的研究，并且结果已经证实皮肤的干燥感和皮肤粗糙的宏观原因，除由于新陈代谢随老龄化衰减所引起的作用之外，复杂地涉及日光(紫外线)、干燥和氧化等的作用。已经发现由此类因素产生的这些作用显著地降低作为真皮中主要基质成分的胶原的量。当保持由胶原维持的皮肤的张力或弹性的机制被紫外线等作用而破坏时，皮肤的皱纹或松弛增多。胶原分子可以保持水分，所以它有助于保持皮肤湿润。因此，当胶原被外部因素破坏时，皮肤变得干燥和粗糙。综上所述，期望安全的并通过促进作为真皮层的主要成分之一的胶原的生物合成可以防止皮肤上的皱纹和皮肤松弛的皮肤胶原产生促进剂。已知乳中含有的碱性蛋白质级分或通过使用蛋白酶分解所述碱性蛋白质级分而获得的分解的碱性蛋白质级分(参见专利文献I)、乳铁蛋白或通过使用蛋白酶分解乳铁蛋白而获得的分解的乳铁蛋白(参见专利文献2)、乳过氧化物酶或通过使用蛋白酶分解乳过氧化物酶而获得的分解的乳过氧化物酶(参见专利文献3)和血管生成素或通过使用蛋白酶分解血管生成素而获得的分解的血管生成素(参见专利文献4)，作为对皮肤胶原产生显示促进作用的物质。技术文献`专利文献专利文献I JP-A-2003-144095专利文献2:JP-A-2004_331564专利文献3 JP-A-2OCM-33I565专利文献4 JP-A-2004_33156
发明要解决的问题本发明的目的是提供一种新颖的皮肤胶原产生促进剂，其可以防止皮肤的干燥感、皮肤粗糙、皮肤的皱纹和松弛，可被用作没有任何安全问题的食物原料，并促进胶原的生物合成。本发明另外的目的是提供包括皮肤胶原产生促进剂的饮食品或化妆品。用于解决问题的方案为了达到上述目的，本发明的发明人通过使用广泛包含于食物原料中的物质对促进皮肤胶原产生的作用进行了锐意的研究。结果，本发明人发现对皮肤胶原产生显示促进作用的乳蛋白质级分和/或乳蛋白质级分的分解物。该发现导致本发明的完成。具体地，本发明包括以下:(I) 一种皮肤胶原产生促进剂，其包括具有以下(a)至(C)特性的乳蛋白质级分作为有效成分:(a)为乳来源，(b)含有分子量为6000至150，000道尔顿的蛋白质，所述分子量通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定，和(c)在构成氨基酸组成中，碱性氨基酸的含量为12至14重量％，并且碱性氨基酸/酸性氨基酸之比为0.5至0.7。(2) 一种皮肤胶原产生促进剂，其包括具有以下(a)至(C)特性的乳蛋白质级分的分解物作为有效成分:(a)为乳来源，(b)含有分子量为 6000至150，000道尔顿的蛋白质，所述分子量通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定，和(c)在构成氨基酸组成中，碱性氨基酸的含量为12至14重量％，并且碱性氨基酸/酸性氨基酸之比为0.5至0.7。(3) 一种促进皮肤胶原产生用饮食品，其包括根据(I)所述的乳蛋白质级分或根据(2)所述的乳蛋白质级分的分解物。(4) 一种促进皮肤胶原产生用化妆品，其包括根据⑴所述的乳蛋白质级分或根据(2)所述的乳蛋白质级分的分解物。(5) 一种促进皮肤胶原产生的方法，其包括以每个成人10μ g/天以上的量口服具有以下(a)至(C)特性的乳蛋白质级分，或涂布基于组合物总量所述乳蛋白质级分的含量在0.001至2重量％的所述组合物:(a)为乳来源，(b)含有分子量为6000至150，000道尔顿的蛋白质，所述分子量通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定，和(c)在构成氨基酸组成中，碱性氨基酸的含量为12至14重量％，并且碱性氨基酸/酸性氨基酸之比为0.5至0.7。(6) 一种促进皮肤胶原产生的方法，其包括以每个成人10μ g/天以上的量口服具有以下(a)至(C)特性的乳蛋白质级分的分解物，或涂布基于组合物总量所述分解物含量在0.001至2重量％的组合物:(a)为乳来源，(b)含有分子量为6000至150，000道尔顿的蛋白质，所述分子量通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定，和(c)在构成氨基酸组成中，碱性氨基酸的含量为12至14重量％，并且碱性氨基酸/酸性氨基酸之比为0.5至0.7。发明的效果根据本发明的皮肤胶原产生促进剂通过口服或涂布而促进皮肤中胶原的生物合成，并且可因此对防止皮肤的干燥感、皮肤粗糙、皱纹和皮肤弹性下降等有用。 (c)在构成氨基酸组成中，碱性氨基酸的含量为12至14重量％，并且碱性氨基酸/酸性氨基酸之比为0.5至0.7。可以通过将乳原料例如脱脂乳或乳清等施加至阳离子交换树脂，用去离子水洗涤阳离子交换树脂，并通过使用0.2M氯化钠洗脱粘附在阳离子交换树脂上的乳蛋白质来获得所述乳蛋白质级分。注意，可以使用钾盐、铵盐、磷酸盐、醋酸盐或碳酸盐等作为盐代替氯化钠。可以通过适当调整洗涤液的离子强度至不超过0.05和洗脱液的离子强度至0.15至0.25来获得根据本发明的乳蛋白质级分。也可以通过回收洗脱级分，利用反渗透(RO)膜或电渗析(ED)等对其脱盐和浓缩，并任选地干燥所得产物来获得所述乳蛋白质级分。反渗透(RO)膜的实例包括 Desal-3 (由 Desalination 制造)、HR_95 (由 Dow Danmark 制造)和NTR_729HF(由Nitto Denko Corporation制造)等。电渗析(ED)装置的实例包括由Yuasa-1onics Inc.和 Nippon Rensui C0., Ltd.制造的电渗析装置。作为获得乳来源的蛋白质级分的方法，已知有以下方法:使乳或乳来源的原料与阳离子交换剂接触后，用PH超过5且离子强度超过0.5的洗脱液洗脱吸附于所述阳离子交换剂上的碱性蛋白质级分，从而获得所述级分的方法(JP-A-5-202098);使用海藻酸凝胶而获得所述级分的方法(JP-A-61-246198);使用多孔无机颗粒从乳清中获得所述级分的方法(JP-A-1-86839);或使用硫酸酯化合物从乳中获得所述级分的方法(JP-A-63-255300)等。通过这样的方法获得的蛋白质级分可以用于根据本发明的皮肤胶原产生促进剂。由此回收的乳蛋白质级分可以在通过冷冻干燥等粉末化后使用。在本发明中使用并对皮肤胶原产生发挥促进作用的乳蛋白质级分相对于构成氨基酸组成包含12至14重量％的碱性氨基酸，并具有0.5至0.7的碱性氨基酸/酸性氨基酸之比。如果碱性氨基酸的含量或碱性氨基酸/酸性氨基酸之比在上述范围之外，则可能损害本发明的有利效果。在本发明中使用的乳蛋白质级分为具有6000至150，000道尔顿分子量的各种蛋白质的混合物，并具有在6至11宽范围内的等电点。所述乳蛋白质级分的分解物具有与乳蛋白质级分相同的氨基酸组成。例如，可以通过用蛋白酶例如胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶等水解通过上述方法获得的乳蛋白质级分，并任选地用蛋白酶例如胰酶等进一步水解，来获得具有4000以下平均分子量的分解物。乳蛋白质级分的分解物可以在通过冷冻干燥等粉末化后使用。用于生产作为根据本发明的皮肤胶原产生促进剂的有效成分的乳蛋白质级分的乳或乳来源的原料，可以使用乳例如牛乳、人乳、山羊乳或绵羊(ewe)乳等。可以使用这些乳而没有附加处理，或者可以使用这些乳的复原乳(reconstituted milk)、脱脂乳或乳清坐寸ο根据本发明的皮肤胶原产生促进剂通过口服或涂布而发挥对皮肤胶原产生的促进作用。在口服本发明的皮肤胶原产生促进剂的情况中，可以原样(没有附加处理)口服乳蛋白质级分或乳清蛋白质级分的分解物(即，有效成分)。当然，所述级分和分解物可以在根据常规方法制成粉末剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或饮用剂等后使用。在本发明中，根据常规方法通过使用赋形剂例如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉或无机盐等制成口服制剂例如粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂。除上述赋形剂之外，可以将粘结剂、崩解剂、表面活性剂、滑润剂、流动性促进剂、着色剂或香料等用于制剂。更具体地，粘结剂的实例包括例如淀粉、糊精、阿拉伯胶粉(powdered acacia)、明胶、轻丙基淀粉、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、结晶纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮。崩解剂的实例包括淀粉、羟丙基淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠和结晶纤维素等。表面活性剂的实例包括大豆卵磷脂和鹿糖脂肪酸酯(sucrose fatty acid ester)等。滑润剂的实例包括滑石、蜡、蔗糖脂肪酸酯和氢化植物油等。流动性促进剂的实例包括硅酸酐、干燥的氢氧化铝和硅酸镁等。可以将没有附加处理或者制剂化后的所述乳蛋白质级分或其分解物掺入到营养补充剂或饮食品等中。另外，当乳蛋白质级分或其分解物与例如通常被认为对胶原产生具有良好作用的维生素C的成分组合掺入时，可期待对皮肤胶原产生更进一步的促进作用。因为乳蛋白质级分或其分解物对热相对稳定，所以含有乳蛋白质级分或其分解物的材料可以在通常条件下加热杀菌。在涂布根据本发明的皮肤胶原产生促进剂的情况中，根据使用目的可以将皮肤胶原产生促进剂掺入到通常使用的已知成分中，由此制备例如液剂、固形剂和半固形剂等各种剂型。优选的组合物的实例包括软膏剂、凝胶、面霜(cream)、喷雾剂、贴剂、化妆水(lotion)和粉末剂等。例如，根据本发明的皮肤胶原产生促进剂可与碳氢化合物例如矿脂、高级脂肪酸低烷基酯例如十八烷醇或十四烷酸异丙酯、动物油脂例如羊毛脂、多元醇例如甘油、表面活性剂例如脂肪酸甘油酯或聚乙二醇单硬脂酸酯、无机盐、蜡、树脂、水和根据需要的防腐剂例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丁酯混合，由此生产促进皮肤胶原产生用化妆品或药品。根据本发明的皮肤胶原产生促进剂的口服的有效量根据剂型、施用方法、使用目的和施用皮肤胶原产生促进剂的患者的年龄、体重和病状而适当确定，并且这不是不变的。然而，使用大鼠的动物试验结果表明，为了对皮肤胶原产生发挥促进作用必须以每Ikg的大鼠体重IOyg以上的量摄取乳蛋白质级分或乳蛋白质级分的分解物。所以，根据外推法，当以每个成人IOyg/天以上的量摄取乳蛋白质级分或乳蛋白质级分的分解物时，可期望该效果。因此，乳蛋白质级分或乳蛋白质级分的分解物可掺入到饮食品中或者可作为药物施用从而确保上述的量。注意，可任选地一天施用若干次乳蛋白质级分或乳蛋白质级分的分解物。根据本发明的皮肤胶原产生促进剂的涂布的有效量根据剂型变化，但是乳蛋白质级分或乳蛋白质级分的分解物的掺入量基于所涂布的组合物的总量可以为0.001至2重量％。注意，当所述组合物在使用期间被稀释为入浴剂(bath powder)时,可进一步增加乳蛋白质级分或乳蛋白质级分的分解物的量。以下通过参考例、实施例和试验例来进一步详细描述本发明，但以下实施例仅仅列举出本发明的一些实施方式，且本发明将不受这些实施例的任何限制。参考例I按照以下方法(参见JP-A-2003-144095)制备对皮肤胶原产生显示促进作用的乳蛋白质级分。用去离子水充分洗涤具有直径IOcm并填充有0.5L(升)阳离子交换树脂(Sulfonated Chitopearl ;由 Fuji Spinning C0., Ltd.制造)的柱。以流速 100ml/min 使50L未杀菌的脱脂乳通过该柱后，用去离子水充分洗涤该柱。使2.5L含有0.95M氯化钠的0.05M磷酸缓冲液(pH7.0)通过该柱，从而使吸附于树脂上的蛋白质洗脱。使用反渗透(RO)膜将该洗脱液脱盐和浓缩，并冷冻干燥从而获得粉状的乳蛋白质级分。重复上述操作两次从而获得104g的蛋白质级分。该蛋白质级分具有7.0至8.5的等电点。该蛋白质级分中碱性氨基酸的含量为17.8%。实施例1用去尚子水充分洗漆具有直径IOcm并填充有0.5L阳尚子交换树脂(SulfonatedChitopearl ;由 Fuji Spinning C0., Ltd.制造)的柱。以流速 100ml/min 使 50L 未杀菌的脱脂乳通过该柱后，用去离子水充分洗涤该柱。使2.5L含有0.15M氯化钠的0.05M磷酸缓冲液(PH7.0)通过该柱，从而使吸附于树脂上的蛋白质洗脱。使用反渗透(RO)膜将该洗脱液脱盐和浓缩，并冷冻干燥从而获得粉状的乳蛋白质级分。进行10次上述操作从而获得24.2g的乳蛋白质级分。该乳蛋白质级分具有6000至150，000道尔顿的分子量和6.0至
11.0的等电点。该乳蛋白质级分中碱性氨基酸的含量相对于构成氨基酸为12至14%。该乳蛋白质级分具有0.5至0.7的碱性氨基酸/酸性氨基酸之比。由此获得的乳蛋白质级分可不附加处理用作根据本发明的皮肤胶原产生促进剂。实施例2
用去离子水充分洗漆具有直径IOcm并填充有0.5L阳离子交换树脂(SulfonatedChitopearl ;由 Fuji Spinning C0., Ltd.制造)的柱。以流速 100ml/min 使 50L 未杀菌的脱脂乳通过该柱后，用含有0.05M氯化钠的0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.0)充分洗涤该柱。使
2.5L含有0.25M氯化钠的0.05M磷酸缓冲液(pH:7.0)通过该柱，从而使吸附于树脂上的蛋白质洗脱。使用反渗透(RO)膜将该洗脱液脱盐和浓缩，并冷冻干燥从而获得粉状的乳蛋白质级分。进行5次上述操作从而获得12.Sg的乳蛋白质级分。该乳蛋白质级分具有6000至150，000道尔顿的分子量和6.0至11.0的等电点。该乳蛋白质级分中碱性氨基酸的含量相对于构成氨基酸为12至14%。该乳蛋白质级分具有0.5至0.7的碱性氨基酸/酸性氨基酸之比。由此获得的乳蛋白质级分可不附加处理用作根据本发明的皮肤胶原产生促进剂。实施例3将24.2g实施例1中获得的乳蛋白质级分溶解于IOL蒸馏水中。以2%的浓度添加胃蛋白酶(由Kanto Kagaku C0., Ltd.制造)后，将该乳蛋白质级分在37°C下边搅拌边水解I小时。用氢氧化钠溶液中和该混合物至PH6.8后，添加1%胰酶(由Sigma制造)至该混合物。然后该混合物在37°C下反应2小时。反应完成后，通过在80°C下加热该混合物10分钟使蛋白酶失活从而获得23.1g乳蛋白质级分的分解物。由此获得的分解物可不附加处理用作根据本发明的皮肤胶原产生促进剂。实施例4将12.8g实施例2中获得的乳蛋白质级分溶解于8L蒸馏水中。以2%的浓度添加胰蛋白酶(由Kanto Kagaku C0., Ltd.制造)后，将该乳蛋白质级分在37°C下边搅拌边水解I小时。用氢氧化钠溶液中和该混合物至pH6.6后,添加1%胰酶(由Sigma制造)至该混合物，然后在37°C下反应2小时。反应完成后，通过在80°C下加热该混合物10分钟使蛋白酶失活从而获得11.7g乳蛋白质级分的分解物。由此获得的分解物可不附加处理用作根据本发明的皮肤胶原产生促进剂。试验例I通过使用大鼠的动物试验来测定参考例I中获得的乳蛋白质级分、实施例1中获得的乳蛋白质级分和实施例3中获得的分解物的对皮肤胶原产生的促进作用。将7周龄的Wistar雄性大鼠分成下列7个组(n=6):生理盐水施用组(A组)、以每Ikg体重10 μ g的量施用参考例I中获得的乳蛋白质级分的组(B组)、以每Ikg体重100 μ g的量施用参考例I中获得的乳蛋白质级分的组(C组)、以每Ikg体重10 μ g的量施用实施例1中获得的乳蛋白质级分的组(D组)、以每Ikg体重100 μ g的量施用实施例1中获得的乳蛋白质级分的组(E组)、以每Ikg体重10 μ g的量施用实施例3中获得的分解物的组(F组)和以每Ikg体重IOOyg的量施用实施例3中获得的分解物的组(G组)。每只大鼠饲养10周，期间通过使用探头(sonde)每天施用所述乳蛋白质级分或分解物一次。通过按照Nimni等人的方法(参见Arch.Biochem.Biophys.，292页，1967)处理每个大鼠的真皮并测量可溶性级分中轻脯氨酸的含量来测定皮肤中胶原的量。羟脯氨酸为仅含于胶原中的特殊氨基酸，并构成胶原的全部氨基酸的10%。因此,可以估算胶原的量(参见Ryuji Asano等人，BioIndustry, 12页，2001)。结果在表I中示出。表I


本发明提出提供用于促进皮肤胶原的生物合成的新颖皮肤胶原产生促进剂的课题，所述皮肤胶原产生促进剂能够防止皮肤干燥、皮肤粗糙、皱纹和下垂，并也可用作没有任何安全性问题的食物原料。本发明还提出提供含有皮肤胶原产生促进剂的饮食品和化妆品的课题。所述皮肤胶原产生促进剂使用具有以下(a)至(c)特性的乳蛋白质级分作为有效成分。(a)乳蛋白质级分为乳来源。(b)通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)获得的级分包含6,000至150,000道尔顿分子量范围的蛋白质。(c)在构成氨基酸组成中，碱性氨基酸的含量为12至14重量%，并且碱性氨基酸/酸性氨基酸之比在0.5至0.7的范围内。