专利名称：5-(3,4-亚甲二氧基苯基)-2e,4e戊二稀酸正丙胺酰胺在制备治疗神经疾病产品中的应用的制作方法神经疾病是包括影响神经系统的疾病或障碍的医学病症。神经疾病可能是伴有疾病或障碍的神经系统的病理学损伤，或者为了提高认知能力改善学习和记忆力的神经学功能的改善。随着人口日渐老化,老年痴呆症(Alzheimerdisease,又称阿尔茨海默病，以下简称AD)已成为一个严重危害人类健康的社会问题。此病的可怕在于其牵连广泛，因为除了 病患者本身会严重丧失记忆力和认知能力外，也会为亲朋好友带来沉重的精神和经济负担。据美国公共健康机构报告，1991年美国用于AD患者的费用达1131亿美元，平均每例AD的直接费用为每年4. 7万美元，如果计入间接费用，每例可消耗17. 4万美元。我国至今尚无此方面的研究报告，但目前有600多万患者，每人每年耗资3000元估算，每年至少需要付出几十亿元的费用。有资料显示，65岁以上患病率5%，80岁以上高达20%，故此，随老龄人口的不断增长，AD患者的群体会不断扩大。因此，西方社会有专家预言本世纪中后叶危害人类健康的第一杀手将是老年痴呆症。但是到目前，医学、科学界仍然未能找出确切病因和行之有效的治疗及预防方法，因此被列入疑难杂症。三核苷酸的扩增型神经退行性疾病，神经退行性三核苷酸重复障碍缓慢进行，其特征为在运动、感觉或认知系统中神经元是选择性和对称性损失。症状往往是共济失调、痴呆或运动功能障碍。最著名的三核苷酸重复障碍是亨廷顿氏舞蹈病，其它是脊髓和延髓性肌萎缩、常染色体显性脊髓小脑共济失调病。HD的治疗致力于减少症状、预防并发症和为患者提供支持和帮助。目前有几种可利用的治疗舞蹈病的化合物，但治疗存在高风险因素。抑郁症是情感性精神障碍的主要类型，以显著而持久的心境低落为主要特征。1996年，世界卫生组织(WHO)公布的一项关于“全球疾病负担”的调查显示，1990年抑郁症已成为世界第四大疾患，占全部疾病总负担的3. 7% ;并预测到2020年将仅次于缺血性心脏病成为第二大疾患，占全部疾病总负担的5. 7%。抑郁症将是21世纪人类最严重的疾病之一。现有的抗抑郁西药主要是三环类(TCAs)，选择性5-HT重摄取抑制剂(SSRIs)，单胺氧化酶抑制剂(MAOIs)，它们均存在着不同程度的毒副作用，且价格昂贵。此外，目前仍有约1/3的抑郁患者对临床使用的这些抗抑郁药效果欠佳。因而从传统中药中研发新的抗抑郁药具有重要的理论和实际意义。痴呆是由于大创伤性脑损伤或疾病面超出正常衰老可能预计的认知功能的进行性衰退。特别受影响的方面可能是记忆、注意力、语言和问题解决。尤其在疾病的后期，受影响的人可能对时间、方位和人无判断力。研究表明，神经元细胞生成的回复于获取痕量记忆的能力有关。精神分裂症是一种以基本个性改变，思维、情感和行为的分裂、精神活动与环境不协调为主要特征的精神疾患，是人类面临的最为严重的疾病之一。在全世界范围内终生患病率接近1% (种族、地域、文化等差异不显著)。精神分裂症不仅给患者本人造成终身的痛苦，而且给社会和家庭造成长期沉重的负担，精神分裂症约占全球疾病总负担的2. 8%，占用大量的医疗卫生资源。精神分裂症的主要疗法基于神经松弛剂，诸如氯丙嗪、氟哌啶醇、奥氮平、氯氮平、甲硫哒嗪及其它。然而安定治疗通常不会减轻精神分裂症的所有症状。而且，抗精神病药治疗可能据偶严重的副作用，诸如迟发型运动障碍。基于本发明的技术难题是治疗、改善和/或预防由神经变性或损害或不充分的神经发生引起的神经学和/或神经病学疾病的手段和方法。通过权力要求书和下文中描述的实施方案解决所述技术难题。
本发明首次公开5- (3,4-亚甲二氧基苯基)-2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺用于在制备治疗神经疾病产品中的应用。·其中的神经疾病是选自阿尔茨海默氏病、抑郁症、神经退行性三核苷酸重复障碍、神经退行性溶酶体贮积症、痴呆、精神分裂症和周围神经病变的至少一种疾病。本发明的5- (3，4-亚甲二氧基苯基)-2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺是一种药物活性成分，按照常规的制剂工艺，可以以5- (3，4-亚甲二氧基苯基)-2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺为主活性组份，加入常规的赋性剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂药物辅料，制成任何一种适合于临床上使用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒齐U、口服液体制剂、注射剂等。由于本发明首次公开了 5- (3，4-亚甲二氧基苯基)-2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺治疗抑郁症的药用作用，因此，将5- (3，4-亚甲二氧基苯基)-2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺单独或与其他活性组份或辅料配合制成药剂，只要是该药剂用于治疗神经疾病，均属于本发明的保护范围。本发明的5- (3，4-亚甲二氧基苯基)-2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺在制成任何一种剂型时，均具有治疗神经疾病的作用。任何药剂，如果其组份中含有5- (3,4-亚甲二氧基苯基)-2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺或仅以5- (3，4-亚甲二氧基苯基)-2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺单独成分制备成药，在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有治疗神经疾病的作用，也属于本发明的保护范围之内。5-(3，4-亚甲二氧基苯基)_2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺合成(I)称取胡椒碱6. 08g,加20% KOH乙醇溶液150ml，回流6小时，冷却，抽滤析出结晶的溶液，滤饼为胡椒酸的钾盐。滤饼上加210ml水.稍微加热溶解，过滤除去不溶物质；母液加入盐酸并搅拌，使胡椒酸全部沉淀；抽滤、冷冻干燥得4. 13g胡椒酸。产率为116. 70%。(2)称取I. 20g胡椒酸于干燥的圆底烧瓶中，加入150ml干燥的二氯甲烷和4ml氯化亚砜,加热回流反应I小时，减压蒸懼除去溶剂和多余的氯化亚砜，加入150mL含有4ml正丙胺的二氯甲烷溶液，剧烈搅拌反应30分钟(冰浴)，用水反复洗涤二氯甲烷溶液，水层无色后，减压蒸馏除去二氯甲烷，残留物经过硅胶柱层析和重结晶，得到产物I. 21g，产率为65. 3%。OO^aO — OO 气XX胡椒碱胡椒酸胡椒酰氯 O
(3)
+ h2n^^ — JU
正丙胺5-(3, 4 -亚甲二氧基苯基)-2E，4E戊二稀酸IH丙胺酰胺1Hnmr(Cdci3JOOmHz) δ 0. 97 (3Η, t, J = 8. OHz, CH2-CH3)，I. 55 (2H, m, CH2-CH3)， 3. 33 (2H, m, -NH-CH2-CH2)，5. 95 (1H, d, J = 16. OHz，-CH = CH-CO)，5. 97 (2H, s, -O-CH2-O)，6. 74-6. 97 (5H, m, olefinic and Ar-H)，7. 33-7. 37 (1H, m, CH = CH-CO)。

将胡椒碱衍生物及胡椒碱衍生物的氢化催化产物溶于少量定量DMSO中，分别配制成 Iml 酶反应总体系中终浓度为 MAO-A (O、25、50、100、200、400 μ M)，MAO-B (O、10、20、30、40,50 μ Μ)。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。标准曲线为取lmg/ml的BSA标准液5、10、15、20、25 μ 1，样品测定为MAO酶样取10 μ 1，各管分别加入生理盐水补足体积至1ml，加入4ml考马斯亮蓝G250溶液，混匀，使用紫外分光光度计在波长595nm处测定OD值。MAO 催化底物 kynuramine dihydrobromide 生成产物 4-hydroxyquimoline (4_HQ),故使用4-HQ标准溶液制作酶反应产物的标准曲线。分别取O. 4mg/ml的4-HQ标准溶液1、2、3、4、5 μ I加PBS补足体积至lml。另分别吸取PBS缓冲液O. 905ml、MAO-B或MAO-A抑制剂10 μ I、系列浓度的胡椒碱及其衍生物的DMSO溶液10 μ I和MAO酶液25 μ 1，混匀后37°C水浴10分钟使胡椒碱及其衍生物充分作用于MAO酶液。各浓度的测定管加入50 μ I底物溶液。对照管先加入O. Iml高氯酸破坏酶活后加入50 μ I底物溶液。各管37°C水浴30分钟后，除对照管，均加入5M高氯酸O. Iml，混匀后8000rpm离心10分钟，取O. 5ml上清液加入2. 5ml NaOH溶液中，混匀。在激发波长为315nm，发射波长为380nm下测 定其荧光值。以系列浓度的4-HQ为横坐标，荧光值为纵坐标，求得线性回归方程，依据4-HQ标准曲线计算测定管及对照管酶活，以Ug 4-HQ/min/mg protein表示酶活。 2. 3.抑制 MAO-A 和 ΜΑ0-Β 活性的 IC5tl 计算酶活结果用平均值土S. D.表示。与对照组(未在体外给予5-(3，4_亚甲二氧基苯基)-2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺对MAO酶活进行干预)比较，不同浓度的胡椒碱或其衍生物选择性的对MAO-A或MAO-B亚型有不同的抑制作用，且化合物的log浓度与抑制率呈线性相关，通过线性回归方程，计算5- (3,4-亚甲二氧基苯基)-2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺对MAO-A和MAO-B活性抑制率为50%时的浓度，即为IC5(I。MAO抑制率计算公式抑制率(％ )=(对照组MAO活性-给药组MAO活性)/对照组MAO活性IC50计算公式抑制率(%) = a*log 浓度 +b (R2 至少 0. 99)3.结果与讨论我们采取了体外抑制MAO酶反应的活性筛选方法，在分子和细胞水平上反映其对整体动物的疗效，筛选结果表明5-(3，4-亚甲二氧基苯基)-2E，4E戊二稀酸正丙酰胺对MAO-A的体外抑制IC5tl为366. 00 μ Μ，对ΜΑ0-Β的体外抑制IC5tl为4. 49 μ Μ。胡椒碱对ΜΑ0-Α的体外抑制IC50为40. 36 μ Μ，对MAO-B的体外抑制IC50为26. 02 μ M5-(3，4-亚甲二氧基苯基)_2Ε，4Ε戊二稀酸正丙酰胺为正丙胺取代胡椒碱分子中的哌啶基团得到的含氮化合物。该化合物对MAO-B的选择性抑制作用好于胡椒碱。因此，小分子胺类取代胡椒碱的哌啶基团后抗抑郁活性的作用靶点更明确，可以提高其对MAO-B的抑制作用，但削弱了胡椒碱抑制MAO-A的作用，。与胡椒碱比较，当衍生物分子失去胡椒碱的哌啶基团时，化合物对MAO-A的抑制作用减小甚至丧失，因此推测胡椒碱分子中的哌啶基团是抑制MAO-A的活性基团。实施例2 :5-(3，4_亚甲二氧基苯基)_2Ε，4Ε戊二稀酸正丙胺酰胺抗抑郁活性研究I.材料
I. I动物SPF级昆明种小鼠(18_22g) 120只，均为雄性。I. 2药品与试剂胡椒碱(北京医药采购供应站)，纯度为98%。DMEM/F12 (I I)培养基(Hyclone公司)；噻唑蓝(Merck公司)；地昔帕明(购于Sigma公司)；皮质酮(Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；PBS(北京Solarbio公司)；二甲基亚砜(北京化学试剂公司，批号为060730) ;二氯亚砜(北京化学试剂公司)；硫酸(北京化学试剂公司)；盐酸(北京化学试剂公司)；胰蛋白酶(北京TrypsinAmresCO0458分装)；青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司)。氢氧化钾(北京化学试剂公司)；碳酸氢钠(北京化学试剂公司)；I. 3仪器与材料MC0215AC型CO2培养箱(SANYO) ；3K15型冷冻离心机(Sigma公司);MM29602G酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)。SH-SY5Y细胞株由军事医学科学院动物中心提供。2.方法
2.1小鼠行为学实验2.1.1小鼠悬尾实验将小鼠随机分为空白组、阳性药组(地昔帕明20mg*kg_l)、胡椒碱组(10，20mg *kg-l)、正丙胺组(10,20mg *kg-l)。各组动物按各组给药剂量每日灌胃给药I次,连续给药7d。末次给药30min后，将小鼠尾部距末端约2cm处用夹子固定，使小鼠倒挂在悬尾箱内，其头部离箱底约5cm。小鼠悬挂2min后,立刻开始观察,观察持续4min,累计此4min内小鼠的不动(小鼠在空中停止挣扎，或仅有细小的肢体运动)时间。2. I. 2小鼠强迫游泳实验将小鼠随机分为空白组、阳性药组(地昔帕明20mg*kg_l)、胡椒碱组(10，20mg *kg-l)、正丙胺组(10,20mg *kg-l)。各组动物按各组给药剂量每日灌胃给药I次,连续给药7d。各组末次给药30min后，将小鼠放入高20cm，直径14cm的圆柱形玻璃缸中，每缸I只,缸中水深IOcm,水温(25± I) V。小鼠游泳2min后,立即开始观察,观察持续4min,累计此4min内的不动(小鼠在水中停止挣扎，或动物呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动)时间。2.2皮质酮损伤SH-SY5Y细胞模型的建立用含10%胎牛血清，青霉素100IU .HiL-I，链霉素100IU ·ιΛ_1的DMEM培养基，在37°C,5% C02饱和湿度的孵箱中培养，待进入对数生长期的SH-SY5Y细胞达到70% 80%融合，用O. 25 %胰蛋白酶消化约2min，镜下观察细胞呈圆形，细胞部分悬起，立即加入与胰酶等体积的DMEM完全培养基终止消化，用吸管吹打细胞至培养瓶壁上细胞全部吹打下来，用吸管转移入15mL尖头离心管，IOOOr · min-1离心3min，弃去上清液，DMEM培养基重悬细胞，以I : 3的比例传代。用细胞计数器调节SH-SY5Y的细胞浓度约I X 104个/mL，每孔80 μ L接种于96孔板，继续培养。48h后，每孔加入10 μ L皮质酮400 μ mo I -L-I损伤(除空白对照组和DMSO对照组)，每个实验组均设4个复孔。传代后的SH-SY5Y细胞培养2_3d后，经O. 25%胰酶消化后转移至15ml离心管中离心后弃上清，DMEM培养基重悬细胞，用细胞计数器调节细胞浓度约I X 104个/ml，每孔80 μ L接种于96孔板，每孔加入10 μ L皮质酮损伤，继续培养，加入已配的胡椒碱及衍生物各药液10 μ L，每个实验组均设4个复孔。24h后终止培养，每孔加入终质量浓度为5mg/ml的MTT20 μ L，37 °C、5 % C02温箱中继续培养4h，待蓝紫色的结晶形成后，吸弃上清，每孔加入DMS0150y L，摇床振摇lOmin，充分溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶标仪测定570nm波长处吸光度值。数据以均值土标准差表示并测算细胞存活率。3 结果3.1胡椒碱和5-(3，4-亚甲二氧基苯基)_2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺对小鼠悬尾和游泳不动时间的影响给药一周后，可明显缩短小鼠在应激环境中的不动时间，延长悬尾的时间，明显缓解其绝望行为状态，提示胡椒碱及其衍生物正丙胺具有良好的抗抑郁作用。胡椒碱组中的高剂量组(20mg ^kg-I)作用最差，显示出倒置的量效关系曲线。正丙胺组中的高剂量组(20mg *kg-l)作用要好于低剂量组(IOmg kg-l),可见正丙胺的量效曲线为正向的。同时，实验表明，正丙胺衍生物的抗抑郁作用要好于胡椒碱。表I胡椒碱及5-(3，4_亚甲二氧基苯基)_2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺对小鼠悬尾·不动时间的影响(x±s，n = 10)


本发明涉及5-(3，4-亚甲二氧基苯基)-2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺在制备治疗和/或预防需要神经保护作用和/或神经再生的神经元疾病的药用组合物方面的用途。5-(3，4-亚甲二氧基苯基)-2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺对于治疗各种原因引起的抑郁症具有较好的治疗作用，5-(3，4-亚甲二氧基苯基)-2E，4E戊二稀酸正丙胺酰胺在药理学抑郁模型有显著的抗抑郁活性。对谷氨酸损伤的SH-SY5Y细胞有较好的保护作用，并且对单胺氧化酶B(MAO-B)有选择性抑制作用。