专利名称：凝血因子vii 的糖基型的制作方法与凝血级联反应有关的蛋白包括,例如凝血因子VII,凝血因子VIII,凝血因子IX，凝血因子X，以及蛋白C，它们经证实都可以作为有效治疗剂用于治疗各种病症。因此，对包含这些蛋白并预先确定了临床效力的单一形式可药用配制剂的需求不断增长。由于使用人血浆作为药用产物的来源有诸多不利，优选在重组系统中制备这些蛋白。但凝血蛋白都有多种多样的翻译和翻译后修饰，包括，例如glu残基的天冬酰胺连接的(N-连接的)糖基化；0_连接的糖基化；以及Y-羧基化。当使用异源细胞作为宿主来大量制备所述蛋白时，这些修饰可能存在质或量的差异。特别是，在异源细胞中的制备通常导致糖基型(glycoform)的不同排列，即相同的多肽具有不同的共价连接的寡糖结构。在不同的系统中，治疗性蛋白的寡糖结构的变化至少与致免疫性和体内清除的改变有关。因此，本领域需要能提供凝血蛋白制剂的组合物和方法，尤其是包含重组人凝血因子VII，修饰的凝血因子VII，或凝血因子VII相关多肽的制剂，且所述制剂具有预先确定的糖基型模式。发明简述本发明涉及包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂，它们表现出预先确定的糖基型模式。本文中，凝血因子VII或凝血因子VII相关制剂是指已经从合成它们的细胞中分离出来的多种凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽，包括变体和化学修饰形式，以及经蛋白裂解活化的形式(如凝血因子Vila)。糖基型是指制剂中具有多样化结构、并与凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽共价连接的寡糖链的分布。本发明一个方面提供了包含多种凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂，其中所述多肽包含天冬酰胺连接的寡糖链并且具有以下一或多种特征(i)约94-100%的寡糖链包含至少一个唾液酸部分；(ii)约0-7%的寡糖链为电中性；(iii)约16%以下(如约6-16% )的寡糖链包含至少一个末端半乳糖残基；(iv)约25%以下(如约6-9% )的寡糖链包含至少一个末端N-乙酰半乳糖胺残基；或(V)约30%以下(如约11-23% )的寡糖链包含至少一个末端半乳糖残基或N-乙酰半乳糖胺残基。在一些实施方案中，除了(i)-(v)的一或多项以外寡糖链中的所有唾液酸残基与半乳糖经由α2->3键连接；至少部分唾液酸残基除了包含N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)以外，还包含N-乙醇酰神经氨酸(Neu5Gc);和/或寡糖链包含岩藻糖残基，它通过α 1_>6键与核心N-乙酰葡糖胺连接。在一个实施方案中，本发明包括一种含野生型凝血因子VIIa的制剂，其中约94-100%的寡糖链具有至少一个唾液酸残基，且所有的唾液酸残基都经由α 2->3键与半乳糖连接。在另一个实施方案中，本发明包括一种含野生型凝血因子VIIa的制剂，其中约94-100%的寡糖链具有至少一个唾液酸残基，且至少一部分唾液酸残基为N-乙醇酰神经氨酸。在另一实施方案中，本发明包括一种含野生型凝血因子VIIa的制剂，其中约94-100%的寡糖链具有至少一个唾液酸残基，且至少部分所述链包含N-乙酰半乳糖胺。本发明的制剂因此不包含已从人血浆中分离出来但未在体外经糖苷酶处理而被修饰的野生型凝血因子VII或凝血因子Vila。本发明另一方面提供了包含多种凝血因 子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制齐U，其中所述多肽包含天冬酰胺连接的寡糖链且其中至少约2%的寡糖链包含至少一个与天线式(antennary)N-乙酰葡糖胺残基(即，与Man残基经由β 1_>2，4或6键连接的N-乙酰葡糖胺残基)经由α 1->3键连接的岩藻糖。优选至少约5%的寡糖链包含至少一个上述天线式岩藻糖残基；更优选至少约10%或20% ;最优选至少约40%。本发明的制剂可包含一或多种下述物质未经修饰的野生型凝血因子VII ;经过化学修饰和/或酶修饰的野生型凝血因子VII ;以及在相对于野生型凝血因子VII的氨基酸序列中包含一或多个改变的凝血因子VII变体。本发明的制剂可以衍生自，由其内源性凝血因子VII基因表达凝血因子VII的人类细胞，或经编程而由重组基因表达凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽的细胞。本发明另一方面提供了包含凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽的制剂，所述凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽表现出一或多种改进的功能特性，包括，但不限于，保存稳定性、生物可利用度和/或半寿期都提高。本发明另一方面包括对凝血因子VII和凝血因子VII相关多肽的糖基型模式进行测定和/或最优化的方法，包括以下步骤(a)在第一组预定的培养条件下培养能表达凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽的细胞；(b)从上述培养中回收凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽，以便获得包含所述多肽的制剂；和(C)分析与所述多肽相连的寡糖的结构，以便确定该制剂的糖基型模式。本发明还可包括将步骤(a)的培养条件变为第二组预定培养条件；以及重复所述步骤，直至获得所需的糖基型模式。备选地，所述方法还可包括对制剂进行化学处理或酶处理，以改变寡糖的结构；并重复所述步骤，直至获得所需糖基型模式。所述方法还可以进一步包括以下步骤对具有预定的糖基型模式的制剂进行至少一种检测生物活性或其它功能(如药代动力学特性谱或稳定性)的试验，并将特定的糖基型模式与特定的生物活性或功能特性联系起来。本发明另一方面提供了制备包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂的方法，所述凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽具有预定的N-连接的糖基化模式。在一些实施方案中，所述方法通过培养能表达所述多肽的细胞来进行，其中与凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽连接的至少约94%的天冬酰胺-连接型寡糖包含至少一个唾液酸残基，例如，1、2、3、或4个唾液酸残基。在一些实施方案中，所述方法通过培养能表达所述多肽的细胞来进行，其中至少约5%的寡糖链包含至少一个与天线式N-乙酰葡糖胺残基以α1_>3键相连的岩藻糖。在一些实施方案中，凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽，不管是何种来源，都接受酶处理，以便获得所需糖基型模式。本发明另一方面提供了包含本发明制剂的药用配制剂以及预防和/或治疗那些应答凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽而出现的综合征的方法。所述方法包括，在增强或抑制凝血效应的条件下，对需要治疗的患者给药所述药用配制剂。在一组实施方案中，在希望增强凝血的情况下，给药凝血因子VII制剂，所述情况如血友病Α，血友病B，凝血因子XI缺陷，凝血因子VII缺陷，血小板减少症，或von Willebrand病；伴有凝血因子抑制剂存在的综合征；外科手术或抗凝血治疗之前、期间、或之后；或受创后。在另一组实施方案中，给药凝血因子VII相关多肽的制剂(即 相对于野生型凝血因子VII具有降低的或改变的生物活性的制剂)以便减少凝血，这类情况例如，接受血管成形术的患者，或罹患以下疾病的患者深部静脉血栓症，肺栓塞，休克，弥漫性血管内凝血(DIC)，与革兰氏阴性内毒素血症相关的肺部和肾脏纤维蛋白沉积，或心肌梗塞。根据本发明，还可以在需要改变(如降低)经由组织因子(TF)介导的途径进行的细胞内信号传递的情况中给药凝血因子VII相关多肽的制剂，以便治疗，例如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，系统性炎症应答综合征(SIRS)，溶血性尿毒综合征(HUS)，多发性器官功能衰竭(MOF)，以及血小板减少性紫癜(TTP)。本申请涉及下述各项。I.含有多种凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂，其中所述多肽包含天冬酰胺-连接的寡糖链，并且其中94-99%的寡糖链包含至少一个唾液酸部分。2.含有多种凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂，其中所述多肽包含天冬酰胺-连接的寡糖链，并且其中约1-7%的寡糖链为电中性。3.含有多种凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂，其中所述多肽包含天冬酰胺-连接的寡糖链，并且其中约6-16%的寡糖链包含至少一个末端半乳糖残基。4.含有多种凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂，其中所述多肽包含天冬酰胺-连接的寡糖链，并且其中约6-9%的寡糖链包含至少一个末端N-乙酰半乳糖胺残基。5.含有多种凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂，其中所述多肽包含天冬酰胺-连接的寡糖链，并且其中约11-23%的寡糖链包含至少一个末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基。6.含有多种凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂，其中所述多肽包含天冬酰胺-连接的寡糖链，并且其中约2%的寡糖链包含至少一个以α 1->3构型与天线式N-乙酰葡糖胺连接的岩藻糖部分。7.项1-6任一项的制剂，其中所述寡糖链中的唾液酸残基以α 2_>3键与半乳糖连接。8.项1-7任一项的制剂，其中所述唾液酸残基包含N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N-乙醇酰神经氨酸(Neu5Gc)。9.项1-8任一项的制剂，其中所述寡糖包含以α 1->6键与核心N-乙酰葡糖胺连接的岩藻糖。10.项1-9任一项的制剂，其中约95-98%的寡糖链包含至少一个唾液酸残基。11.项1-10任一项的制剂，其中约96-97%的寡糖链包含至少一个唾液酸残基。12.项1-11任一项的制剂，其中约2-4%的寡糖链为电中性。13.项1-12任一项的制剂，其中约8-12%的寡糖链包含至少一个末端半乳糖残基。14.项1-13任一项的制剂，其 中约7-8%的寡糖链包含至少一个末端N-乙酰半乳糖胺残基。15.项1-14任一项的制剂，其中约12-18%的寡糖链包含至少一个末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基。16.项1-15任一项的制剂，其中至少约5%的寡糖链包含至少一个以α 1_>3键与天线式N-乙酰葡糖胺连接的岩藻糖部分。17.项1-16任一项的制剂，其中至少约10%的寡糖链包含至少一个以α 1->3键与天线式N-乙酰葡糖胺连接的岩藻糖部分。18.项1-17任一项的制剂，其中至少约20%的寡糖链包含至少一个以α 1->3键与天线式N-乙酰葡糖胺连接的岩藻糖部分。19.项1-18任一项的制剂，其中至少约40%的寡糖链包含至少一个以α 1->3键与天线式N-乙酰葡糖胺连接的岩藻糖部分。20.项1-19任一项的制剂，其中所述多肽具有野生型凝血因子VII的氨基酸序列。21.项1-20任一项的制剂，其中所述多肽是野生型凝血因子Vila。22.项1-19任一项的制剂，其中所述凝血因子VII多肽选自S52A_凝血因子VII，S60A-凝血因子VII，在残基290和291之间被蛋白裂解的凝血因子VII，在残基315和316之间被蛋白裂解的凝血因子VII ;以及氧化型凝血因子VII。23.项1-19任一项的制剂，其中所述凝血因子VII相关多肽选自R152E_凝血因子VII，S344A-凝血因子VII，FFR-凝血因子VII，以及缺乏Gla结构域的凝血因子Vila。24.包含多种凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂，其中所述多肽包含天冬酰胺-连接的寡糖链，并且其中(i)约94-100%的寡糖链包含至少一个唾液酸部分，且(ii)约6-9%的寡糖链包含至少一个末端N-乙酰半乳糖胺残基。25.项24的制剂，其中所述凝血因子VII多肽具有野生型凝血因子VII的序列。26.包含多种凝血因子VIIa多肽的制剂，所述多肽具有野生型凝血因子VII的序列，并且所述多肽包含天冬酰胺-连接的寡糖链，其中约94-99%的寡糖链包含至少一个唾液酸残基。27.包含多种凝血因子VIIa多肽的制剂，所述多肽具有野生型凝血因子VII的序列，并且所述多肽包含天冬酰胺-连接的寡糖链，其中至少约2%的寡糖链包含至少一个以α 1->3键与天线式N-乙酰葡糖胺连接的岩藻糖部分。28.项1-27任一项的制剂，其中所述多肽产生于选自真菌细胞、昆虫细胞或脊椎动物细胞的宿主细胞。29.项28的制剂，其中所述细胞是哺乳动物的细胞。30.项29的制剂，其中所述哺乳动物细胞来自仓鼠。31.项30的制剂，其中所述仓鼠细胞选自CHO细胞或BHK细胞。32.项29的制剂，其中所述哺乳动物细胞来自人类。33.项32的制剂，其中所述人类细胞是HEK细胞。34.项1-33任一项的制剂，其中所述制剂具有参照制剂的至少约110%的生物可利用度，其中参照制剂中约93%或更少的寡糖链包含至少一个唾液酸部分。35.项34的制剂，其中所述制剂具有参照制剂的至少约120%的生物可利用度。36.项35的制剂，其中所述制剂具有参照制剂的至少约130%的生物可利用度。37.项36的制剂，其中所述制剂具有参 照制剂的至少约140%的生物可利用度。38.测定凝血因子VII和凝血因子VII相关多肽的糖基型模式的方法，该方法包括(a)在第一组预定的培养条件下培养能表达凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽的细胞；(b)从上述培养中回收凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽，以获得包含这些多肽的制剂；和(C)分析与这些多肽连接的寡糖的结构,从而确定所述制剂的糖基型模式。39.项38的方法，还包括(dl)改变步骤(a)的培养条件，得到第二组预定的培养条件；(el)重复步骤(b)-(dl)，直至获得所需的糖基型模式。40.项38的方法，还包括(d2)对所述制剂进行化学处理或酶处理，以改变寡糖的结构；和(e2)重复步骤(b)_(d2)，直至获得所需糖基型模式。41.制备含有凝血因子VII多肽或凝血因子VII-相关多肽的制剂的方法，所述多肽具有预定的N-连接型糖基化模式，所述方法包括培养能表达所述多肽的细胞，所用的培养条件使所述多肽上至少约94%的天冬酰胺-连接型寡糖包含至少一个唾液酸残基。42. 一种药用配制剂，其包含项1-37任一项的制剂和一种可药用载体或添加剂。43.治疗凝血因子VII-应答性综合征的方法，所述方法包括，在使出血减少和/或使凝血增加的条件下，对需要相应治疗的患者给药项42所述的药用配制剂，其中所述配制剂包含凝血因子VII多肽。44.项43的方法，其中所述综合征选自血友病A，血友病B，凝血因子XI缺陷，凝血因子VII缺陷，血小板减少症，von Wi 11 ebrand病，凝血因子抑制剂的存在，外科手术，创伤或抗凝治疗。45.预防不希望发生的出血的方法，所述方法包括，在使出血减少和/或使凝血增加的条件下，对需要相应治疗的患者给药项42所述的药用配制剂，其中所述配制剂包含凝血因子VII多肽。46.预防不希望发生的凝血的方法，所述方法包括，在能有效抑制凝血的条件下，对需要相应治疗的患者给药项42所述的药用配制剂，其中所述配制剂包含凝血因子VII相关多肽。47.预防组织因子介导的反应的方法，所述方法包括，在能有效抑制凝血的条件下，对需要相应治疗的患者给药项42所述的药用配制剂，其中所述配制剂包含凝血因子VII相关多肽。48.项46的方法，其中所述不希望发生的凝血与选自下组的疾病有关血管成形术，深部静脉血栓，肺栓塞，休克，弥散性血管内凝血(DIC)，与革兰氏阴性内毒素血症有关的肺或肾内纤维蛋白沉积，或心肌梗塞。49.项47的方法，其中所述组织因子介导的反应与选自SIRS，ARDS, MOF, HUS，或TTP的疾病有关。50.项1-37任一项所述的包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂的用途，用于制备治疗凝血因子VII应答性综 合征的药物。51.项50的用途，其中所述综合征选自血友病A，血友病B，凝血因子XI缺陷，凝血因子VII缺陷，血小板减少症，von Wi 11 ebrand病，凝血因子抑制剂的存在，外科手术，创伤或抗凝治疗。52.项1-37任一项所述的包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂的用途，用于制备预防不希望发生的出血的药物。53.项1-37任一项所述的包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂的用途，用于制备预防不希望发生的凝血的药物。54.项53的用途，其中所述不希望发生的凝血与选自下组的疾病有关血管成形术，深部静脉血栓，肺栓塞，休克，弥散性血管内凝血(DIC)，与革兰氏阴性内毒素血症有关的肺或肾内纤维蛋白沉积，或心肌梗死。55.项1-37任一项所述的包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂的用途，用于制备预防组织因子介导的反应的药物。56.项55的用途，其中所述组织因子介导的反应与选自SIRS，ARDS, MOF, HUS，或TTP的疾病有关。发明详述本发明者发现，具有预定的糖基型模式的凝固蛋白的制剂表现出改进的功能特性。相应地，本发明涉及提供这些蛋白制剂的方法和组合物。具体地，本发明涉及包含凝血因子VII多肽和凝血因子VII相关多肽的制剂，所述制剂具有预定的特异性天冬酰胺-连接型(N-连接型)寡糖模式。本发明的制剂表现出改变的特性，包括，但不限于，改进的药代动力学特性和改进的临床效力。本发明还包括含有这些制剂的药用配制剂，以及应用这些配制剂进行的治疗方法。凝血因子VII多肽和凝血因子VIl相关多肽本发明涉及凝血因子VII多肽，如具有美国专利4，784，950中公开的氨基酸序列的那些(野生型凝血因子VII)。本文中，“凝血因子VII”或“凝血因子VII多肽”包括野生型凝血因子VII，以及生物学活性与野生型凝血因子VII相比实质上相同或有改进的凝血因子VII变体。术语“凝血因子VII”旨在包括凝血因子VII多肽的未切割形式(酶原形式)，以及经过蛋白裂解性加工产生了各自的生物活性形式的那些多肽，它们可称为凝血因子Vila。通常，凝血因子VII在残基152和153之间切割而产生凝血因子Vila。本文中，“凝血因子VII相关多肽”包括多肽和变体，其中凝血因子VIIa的生物学活性与野生型凝血因子VIIa相比得到实质上的修饰或已减弱。这些多肽包括，但不限于，经过化学修饰的凝血因子VII或凝血因子Vila，以及引入了特异性氨基酸序列改变从而修饰或破坏了该多肽的生物活性的凝血因子VII变体。凝血过程中，凝血因子VIIa的生物学活性源于其以下能力⑴与组织因子(TF)结合，和(ii)催化凝血因子IX或凝血因子X的蛋白裂解性切割，从而产生活化的凝血因子IX或X (分别为凝血因子IXa或Xa)。为了本发明的目的，凝血因子VIIa的生物学活性可以通过利用凝血因子VII-缺陷型血浆和凝血酶致活酶测量制剂促进凝血的能力来定量，如美国专利5，997，864所述。在该试验中，将生物学活性表示为凝血时间相对于对照样品的减少，并将其与含有I单位/ml凝血因子VII活性的人血清标准品进行比较而转换为“凝血因子VII单位”。定量凝血因子VIIa的生物学活性的另一种方法是(i)测量凝血因子VIIa在含有包埋于脂质膜中的TF的系统中产生凝血因子Xa的能力以及产生凝血因子X的能力(Persson 等，J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997) ；(ii)测量凝血因子 X 在含水系统中的水解(参见下文实施例5) ； (iii)测量其与TF的物理结合，使用基于表面胞质团共振(surface plasmonresonance)的仪器(Persson, FEBS Letts. 413:359-363，1997) ； (iv)测量合成底物的水解(参见下文实施例4);和(V)测量TF-非依赖性体外系统中凝血酶的产生。具有与野生型凝血因子VIIa相比实质上相同或有改进的生物学活性的凝血因子VII变体包括在上述凝血试验、蛋白裂解试验和/或 TF结合试验中测得，比活性为相同细胞类型产生的野生型凝血因子VIIa的至少约25%，优选至少约50%，更优选至少约75%，最优选至少约90%的那些。具有与野生型凝血因子VIIa相比实质上减弱的生物学活性的凝血因子VII变体包括在上述凝血试验、蛋白裂解试验和/或TF结合试验中测得，比活性为相同细胞类型产生的野生型凝血因子VIIa的至少约25%，优选至少约10%，更优选至少约5%，最优选至少约1%的那些。具有与野生型凝血因子VII相比有实质修饰的生物学活性的凝血因子VII变体包括，但不限于，具有TF-非依赖性凝血因子X的蛋白裂解活性的凝血因子VII变体，以及结合TF但不裂解凝血因子X的那些。凝血因子VII的变体，无论是具有与野生型凝血因子VII实质上相同或更好的生物活性，还是具有与野生型凝血因子VII相比有实质修饰的或减弱的生物活性，这样的变体可包括，但不限于具有因插入、缺失、或取代一或多个氨基酸而不同于野生型凝血因子VII的氨基酸序列的多肽。具有与野生型凝血因子VII相比实质上相同的生物学活性的凝血因子 VII 变体包括S52A-FVIIa, S60A_FVIIa(lino 等，Arch. Biochem.Biophys. 352:182-192，1998);具有增强的蛋白裂解稳定性的FVIIa变体，其公开在美国专利5，580, 560中；已经在残基290和291之间或残基315和316之间被蛋白裂解的那些凝血因子 Vila(Mollerup 等，Biotechnol. Bioeng. 48:501-505，1995);以及氧化型凝血因子 Vila(Kornfelt 等，Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54，1999)。具有与野生型凝血因子VII相比实质上减弱或有修饰的生物学活性的凝血因子VII变体包括R152E-FVIIa (Wildgoose 等，Biochem29 : 3413-3420, 1990) , S344A-FVIIa (Kazama等，J. Biol. Chem. 270:66-72，1995)，FFR-FVIIa (Holst 等，Eur. J. Vase. Endovasc.Surg. 15:515-520，1998)，以及缺乏 Gla 结构域的凝血因子 Vila (Nicolaisen 等，FEBSLetts. 317:245-249, 1993)。化学修饰的凝血因子VII多肽以及序列变体的非限制性实例参见，例如，美国专利5，997，864。 天冬酰胺-连接型糖基化本发明提供了凝血因子VII多肽或凝血因子VII-相关多肽的制剂，它包含特定谱的凝血因子VII糖基型，即具有预定的天冬酰胺-连接型(N-型)寡糖链的凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽。本文中，N-连接型糖基化的“模式”或糖基型“模式”，“分布”，或“谱”，是指给定的凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽群体内具 体的寡糖结构。这类模式的非限制性实例包括寡糖链的以下相关部分(i)具有至少一个唾液酸残基；(ii)缺乏任何唾液酸残基(即，为电中性)具有至少一个末端半乳糖残基；(iv)具有至少一个末端N乙酰半乳糖胺残基；(V)具有至少一个“未加帽”的天线(antenna)，S卩，具有至少一个末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基；或(vi)具有至少一个以α 1->3键与天线式N-乙酰葡糖胺残基连接的岩藻糖。本文中，寡糖链是指与单个天冬酰胺残基共价连接的整个寡糖结构。凝血因子VII通常在Asn 145和Asn 322发生糖基化。人体中原位产生的凝血因子VII上的N-连接型寡糖链可以是双-，三，或四天线式，每一天线中，Neu5Ac ( α 2->3或a 2_>6)Gal ( β 1_>4)GlcNAc 与 Man 残基以(β1_>2，4，或 6)连接，所述 Man 残基与 Man ( β 1_>4) GlcNAc ( β 1_>4)GlcNAc-Asn以(α 1->3或6)连接。(Neu5Ac表示N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，Gal表示半乳糖，GlcNAc表示N-乙酰葡糖胺，Man表示甘露糖)。寡糖链还可包含岩藻糖残基，其可与GlcNAc以α 1_>6连接。当凝血因子VII在人体中原位产生时，一些寡糖链缺失核心的岩藻糖残基；所有链缺乏天线式岩藻糖残基；且所有链都几乎被彻底唾液酸化，即，每一天线的末端糖是与半乳糖经α 2->3或α 2_>6键连接的N-乙酰神经氨酸。但是，在其它情况下产生时，凝血因子VII可能包含以下寡糖链，它们在一或多个天线上具有不同末端结构，如缺乏唾液酸残基；包含N-乙醇酰神经氨酸(Neu5Gc)残基；包含末端N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基以替代半乳糖；等等。如果是在有牛血清时培养的BHK细胞中产生，凝血因子VII具有以下寡糖模式—87-93%的寡糖链包含至少一个单个的唾液酸残基；—7-13%为中性(无任何唾液酸)；—9-16%包含至少一个末端半乳糖残基；-19-29%包含至少一个末端N-乙酰半乳糖胺残基；和—30-39%包含至少一个未加帽的天线，S卩，包含至少一个末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基。本发明人制备了包含预定的特异性寡糖模式的凝血因子VII制剂，其寡糖模式不同于已经描述的那些。本发明涉及含有凝血因子VII多肽或凝血因子VII-相关多肽的制齐U，所述多肽具有一或多种下述糖基型模式(i)约94-100%的寡糖链包含至少一个唾液酸残基，如约94-99%，约95-98%，或约96-97%。在不同的实施方案中，至少约94%，95%，96%，或97%的寡糖链包含至少一个唾液酸残基。(ii)6%或更少的寡糖链为中性，如约I. 5-6%或约2-4%。(iii)约16%以下，优选约10%以下的寡糖链包含至少一个末端半乳糖，如约6-10% 或约 8-9% ；(iv)约25%以下，优选约10%以下的寡糖链包含至少一个末端GalNAc残基，如约69% 或约 7-8% ；(V)约30%以下，优选约25%以下的寡糖链包含至少一个未加帽的天线，如约11-23%或约 12-18% ;和(vi)至少约2 %，优选至少约5 更优选至少约10 %或20 最优选至少约40%的寡糖链包含至少一个与天线式N-乙酰葡糖胺残基以al->3连接的岩藻糖(即，以β 1->2，4，或6键与Man残基连接的N-乙 酰葡糖胺残基)。可以理解，上述(i)-(vi)的每一项代表了包含在本发明中的一种不同的糖基型模式，即，本发明的制剂可以用上述(i)-(vi)中的仅一项来描述。也可以根据具体的糖基型模式，用上述(i)-(vi)的不止一项来描述本发明的制剂。此外，本发明的制剂可以用上述(i)-(vi)中的一或多项结合一或多个其它结构特征来描述。例如，本发明包括含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂，所述多肽中的唾液酸残基(Neu5Ac或Neu5Gc)与半乳糖仅以α 2_>3构型连接。本发明还包括含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的制剂，所述多肽包含以α 1->6键与核心的N-乙酰葡糖胺连接和/或以α 1->3键与天线式N-乙酰葡糖胺连接的岩藻糖。在一系列实施方案中，本发明的制剂包含下述凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽，其中99%以上的寡糖链包含至少一个唾液酸残基且(a)所述唾液酸残基仅以α2_>3构型连接和/或(b)具有与核心N-乙酰葡糖胺连接的岩藻糖残基和/或(C)可检测的数量的天线止于N-乙酰半乳糖胺。在一个实施方案中，本发明涉及含有野生型凝血因子VIIa的制剂，所述因子中，99%以上的寡糖链包含至少一个唾液酸残基且该唾液酸残基与半乳糖仅以α 2->3构型连接。在另一实施方案中，本发明涉及包含野生型凝血因子VIIa的制剂，所述因子中，99%以上的寡糖链包含至少一个唾液酸残基且至少部分寡糖链包含N-乙酰半乳糖胺。本发明不涉及从人血浆中分离出来并且未通过用糖苷酶处理而回体(ex vivo)修饰的野生型凝血因子VII或野生型凝血因子Vila。在一个实施方案中，凝血因子Vila制剂包含下述寡糖链，其有单个岩藻糖以α 1->3构型与N-乙酰葡糖胺连接。在另一实施方案中，凝血因子VIIa制剂包含下述寡糖链，其具有以α 1->3构型与双天线寡糖的每一天线N-乙酰葡糖胺残基连接的岩藻糖残基(唾液酸Lewis X结构)。在另一实施方案中,凝血因子VIIa制剂包含下述寡糖链(i)具有与核心N-乙酰葡糖胺连接的岩藻糖，和(ii)具有以al->3构型与一个天线式N-乙酰葡糖胺连接的单个岩藻糖。在另一实施方案中，凝血因子VIIa包含以下寡糖链(i)具有与核心N-乙酰葡糖胺连接的岩藻糖，和(ii)具有以α 1->3构型与双天线寡糖的每一天线式N-乙酰葡糖胺连接的岩藻糖残基。在实施本发明时，N-连接的寡糖的模式可以用本领域任何已知方法确定，如高效液相层析(HPLC);毛细电泳(CE);核磁共振(NMR);利用诸如高速粒子(fast-atom)轰击或电喷射等离子化技术，或基质辅助激光解析(MALDI)进行的质谱分析(MS);气相色谱(GC);以及用外切糖苷酶进行处理并结合阴离子交换(AIE)-HPLC，大小排阻层析(SEC),或 MS0 参见，例如 Weber 等，Anal. Bio-chem. 225:135 (1995) ; Klausen 等，J. Chromatog. 718 :195 (1995) ; Morris 等， in Mass Spectrometry of BiologicalMaterials, McEwen 等编,Marcel Dekkerj (1990)，pp 137167; Conboy 等，Biol. Mass Spectrom.21:397，1992;HellerqvistjMeth. EnzymoL 193:554 (1990);Sutton 等，Anal.Biohcem. 318:34(1994) ;Harvey 等，Organic Mass Spectrometry 29:752(1994)。在用上述任一种方法(或能分辨具有不同结构的寡糖链的其它任何方法)分辨出凝血因子VII-衍生的寡糖链之后，可将分辨出的种类分配到上述(i)-(v)中。将上述(i)-(v)中每一种的相对含量计算为，被分配到该组的寡糖总量相对于样品中寡糖链总含量的比率。
例如，利用AIE-HPLC进行分辨时，可从BHK产生的重组凝血因子VII制剂中分辨出13个或更多个N-连接型寡糖峰，例如，参见Klausen等，Mol. Biotechnol. 9:195, 1998。其中5个峰(在Klausen等人的文章中命名为1_5)不包含唾液酸，有8个峰(6，7，和10-15)包含唾液酸。可以理解，在具体的分析中，包含唾液酸的链和缺乏唾液酸的链的数量和分布取决于(a)所要表达的多肽；(b)细胞类型和培养条件；以及(C)所采用的分析方法，而且所得到的模式也会因此有所不同。任何情况下，一旦将含有唾液酸的寡糖与不含唾液酸的寡糖分辨清楚，就可以用常规数据分析程序来计算每一峰以下的面积；总的峰面积；以及具体的峰占总峰面积的百分比。如此一来，对于给定的制剂而言，含唾液酸的峰的总面积/总的峰面积X 100就是本发明制剂的％唾液酸化值(即，具有至少一个唾液酸残基的寡糖链的比例)。用类似的方法可以计算不具有唾液酸或至少有一个半乳糖或N-乙酰葡糖胺的链的百分比。制备具有预定的N连接型寡糖模式的凝血因子VII制剂的方法具有预定的N-连接型寡糖模式的凝血因子VII、凝血因子VII变体、或凝血因子VII相关多肽的制剂，可以用表达凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽的任何合适的宿主细胞来产生。宿主细胞在一些实施方案中，宿主细胞是表达内源性凝血因子VII基因的人类细胞。在这些细胞中，所述内源基因可以是完整的或者可以被原位修饰，或者凝血因子VII基因以外的一种序列可以被原位修饰，使该内源性凝血因子VII基因的表达被改变。可以使用任何能表达内源性凝血因子VII基因的人类细胞。在其它实施方案中，异源宿主细胞经过改造后能由重组基因表达人凝血因子VII。所述宿主细胞可以是脊椎动物、昆虫或真菌的细胞。优选所述细胞是能表达哺乳动物的N-连接型糖基化；O-连接型糖基化；和Y-羧基化的所有形式的哺乳动物细胞。参见，例如美国专利4，784，950。优选的哺乳动物细胞系包括CH0(ATCC CCL 61)，C0S-1 (ATCCCRL 1650)，幼年仓鼠肾细胞(BHK)和 HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham 等，J. Gen.Virol. 36:59-72, 1977)细胞系。优选的 BHK 细胞系是 tk—tsl3BHK 细胞系(Waechter和 Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110，1982)，后文称 BHK 570 细胞。BHK570细胞系可从美国典型培养物保藏中心，12301Parklawn Dr.，Rockville, MD 20852获得，其ATCC保藏号为CRL 10314。tk_tsl3BHK细胞系也可以选用ATCC CRL 1632。还可使用其它多种细胞系，包括大鼠H印1(大鼠肝细胞癌；ATCC CRL 1600)，大鼠H印11(大鼠肝细胞癌；ATCC CRL1548), TCMK (ATCC CCL 139)，人肺(ATCC HB 8065), NCTC1469 (ATCCCCL 9. I)和 DUKX 细胞(CH0 细胞系)(Urlaub 和 Chasin, Proc. Natl. Acad.Sci.USA 77:4216-4220,1980)。(DUKX 细胞也称为 CXBll 细胞)，和 DG44(CH0 细胞系)(Cell, 33:405，1983，和 SomaticCelland MolecularGenetics 12:555，1986)。也可以使用3T3细胞，Namalwa细胞，骨髓瘤以及骨髓瘤与其它细胞的融合体。在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞是已经适应了在没有血清的条件下生长、并已经经过改造能表达凝血因子VII的BHK 21细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以是表达糖基化酶(糖基转移酶和/或糖苷酶)的突变细胞或重组细胞，但其表达的量或质量不同于天然表达这些酶的细胞类型。所述细胞也可以被改造为表达其它异源肽或蛋白，包括，如截短型凝血因子VII。在一个实施方案中，宿主细胞是下 述CHO细胞，其经过改造可以共表达所需凝血因子VII多肽(即，凝血因子VII或凝血因子-VII相关多肽)和另一种异源肽或多肽，如修饰酶或凝血因子VII片段。方法本发明涉及制剂制备方法，所述制剂包含上述(i)-(Vi)的任一种糖基型模式，在进一步的实施方案中，本发明涉及使凝血因子VII和凝血因子VII相关多肽的糖基型分布最优化的方法。这些方法包括以下步骤(a)在第一组预定的培养条件下培养能表达凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽的细胞；(b)从上述培养中回收凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽，以获得包含这些多肽的制剂；和(C)分析与这些多肽连接的寡糖的结构，从而确定糖基型模式。所述方法还包括(dl)改变步骤(a)的培养条件，得到第二组预定的培养条件；(el)重复步骤(b)-(dl)，直至获得所需的糖基型模式。或者,所述方法还包括(d2)对所述制剂进行化学处理和/或酶处理，以改变寡糖的结构；和(e2)重复步骤(b)_(d2)，直至获得所需糖基型模式。这些方法可能还包括，使具有预定糖基型模式的制剂接受至少一种有关生物活性(包括，如凝血活性，使凝血因子X裂解的活性，或TF结合的活性)或其它功能(如动力学谱或稳定性)的检验，并将具体的糖基型模式与具体的生物活性或功能特性相关联，从而鉴定出所需糖基型模式。步骤(dl)中可能被改变的培养条件包括，但不限于细胞来源，如来自不同于起始物种的另一物种；或突变细胞或重组细胞，它们在糖基化机制中的一或多种糖基转移酶或糖苷酶或其它成分中具有改变(参见，Grabenhorst等，GlycoconjugateJ. 16:81, 1999 ; Bragonzi 等，Biochem. Biophys. Acta 1474: 273, 2000 ; Weikert, NatureBiotechnol. 17:1116, 1999);多肽的表达水平；代谢条件，如葡萄糖或谷氨酰胺浓度；有或无血清；维生素K的浓度；蛋白水解物，激素，痕量金属，盐以及诸如温度、溶氧量和pH等参数。步骤(d2)中可能用于改变制剂的寡糖模式的酶处理包括，但不限于，依次用一或多种唾液酸酶(神经氨酸酶)，半乳糖苷酶，岩藻糖苷酶；半乳糖基转移酶，岩藻糖基转移酶，和/或唾液酸转移酶，在能使具有特定末端结构的寡糖链的分布发生所需改变的条件下，进行处理。糖基转移酶可以购自Calbiochem (La Jolla，CA)，糖苷酶可以购自Glyko, Inc. , (Novato, CA)。在一系列实施方案中，表达凝血因子VII或相关多肽的宿主细胞在特定的培养条件下培养，所述条件能使所述细胞分泌具有所需寡糖结构的所需模式的糖基化凝血因子VII多肽，如上述(i)-(vi)任一项所述。这样的培养条件包括，但不限于，血清减量或完全缺乏。优选宿主细胞经过适应后能在无血清的条件下生长，并且是在生长期和生产期都缺乏血清的条件下培养。对这类适应过程的描述参见Scharfenberg等，Animal Cell TechnologyDevelopments towards the 21St Century,E.C. Beuvery 等(编)，Kluwer AcademicPublishers, pp. 619-623, 1995 (BHK和CHO细胞)；Cruz, BiotechnoLTech. 11:117-120，1997(昆虫细胞)；Keen, Cytotechnol. 17:203-211，1995(骨髓瘤细胞)；Berg等，Biotechniques 14:972-978，1993 (人类肾293细胞)。在一优选实施方案中，细胞培养基不含蛋白或分离自动物组织或动物细胞培养的任何成分。参见，例如以下实施例I。一般情况下，除了常规成分以外，适于制备凝血 因子VII的培养基包含O. l-50mg/L维生素K，这是凝血因子VII中的谷氨酰胺残基发生Y-羧基化所必需的。在另一系列的实施方案中，本发明的糖基型是通过对凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽的制剂中的N-连接型寡糖进行酶修饰和/或化学修饰而制备的。凝血因子VII制剂本文中，“凝血因子VII制剂”是指多种凝血因子VII多肽，凝血因子VIIa多肽，或凝血因子VII相关多肽，包括变体和化学修饰形式，它们已经从合成它们的细胞中被分离出来。将多肽从它们的细胞来源中分离可以用本领域已知的任何方法实现，包括，但不限于，从贴壁细胞培养物上取出包含所需产物的细胞培养基；离心或过滤以便除去未贴壁的细胞；等等。任选地，凝血因子VII多肽可以被进一步纯化。纯化可以用本领域任何已知方法实现，包括，但不限于，在诸如抗-凝血因子VII抗体柱上进行亲和层析(参见，例如Wakabayashi 等，J. Biol. Chem. 261:11097, 1986;和 Thim 等，Biochem. 27:7785, 1988)；疏水相互作用层析；离子交换层析；大小排阻层析；电泳(如制备型等电聚焦(IEF))，差异溶解(如硫酸铵沉淀)，或提取等等。一般性描述参见，Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NewYork, 1982 ；和 Protein Purification, J. -C. Janson 和 LarsRyden, editors, VCHPubIishers, New York, 1989。纯化后，制剂中可能含有总重量的约10%以下、更优选约5%以下、最优选约I %以下的、来源于宿主细胞的非-凝血因子VII蛋白。凝血因子VII和凝血因子VII相关多肽可通过蛋白裂解性切割来活化，其使用凝血因子XIIa或其它具有胰蛋白酶-样特异性的蛋白酶，如凝血因子IXa，激肽释放酶，凝血因子Xa,和凝血酶。参见，例如Osterud等，Biochem. 11:2853(1972) ; Thomas,美国专利4，456，591 ;和 Hedner 等，J. Clin. Invest. 71:1836 (1983)。或者，凝血因子 VII 可以因通过离子交换层析柱，如MonoQ (Pharmacia)等而被活化。所得活化的凝血因子VII然后可以如下配制并给药。凝血因子VII制剂的功能特性本发明具有预定的寡糖模式的凝血因子VII多肽和凝血因子VII相关多肽的制齐U，具有相对于参照制剂改进的功能特性。所述改进的功能特性可包括，但不限于a)物理特性，如保存稳定性；b)药代动力学特性，如生物可利用度和半寿期；和(3)在人体中的致免疫性。参照制剂是指与将要用于比较的本发明制剂包含相同的多肽、但具有不同的天冬酰胺-连接型糖基化模式的制剂(如野生型凝血因子VII或具体变体或化学修饰形式)。例如，参照制剂通常包含一或多种以下糖基型模式(i)约93%以下(如约92%以下或约90%以下)的寡糖链包含至少一个唾液酸残基；(ii)至少约6% (如至少约7. 5%或至少约10%)的寡糖链不含任何唾液酸(即，为中性)至少约10% (如至少约12. 5%或至少约15% )的寡糖链包含至少一个末端半乳糖残基；(iv)至少约15% (如至少约20%至少约25% )的寡糖链包含至少一个N-乙酰半乳糖胺残基；(V)至少约25% (如至少约30%或至少约35%)的寡糖链包含至少一个未加帽的天线(即，包含至少一个末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基)；或(vi)基本上不可 能检测到的(如约O. 2%以下)的天线式岩藻糖残基。凝血因子VII制剂的保存稳定性可以通过测定如下特性来评估(a)制剂在25°C以干粉形式保存时，损失20%的生物活性所需的时间；和/或(b)使制剂中凝血因子VIIa聚集物的比例加倍所需的时间。在一些实施方案中，在25°C以干粉形式保存时，本发明的制剂损失20%的生物活性所需的时间，比参照制剂发生同样现象所需的时间增加至少约30%，优选至少约60%，更优选至少约100%。生物活性可以用以下任一种试验来测定凝血试验、蛋白裂解试验、TF-结合试验，或TF-非依赖性凝血酶生成的试验。在一些实施方案中，在25°C以干粉形式保存时，本发明的制剂使聚集物加倍所需的时间比参照制剂增加至少约30%，优选至少约60%，更优选至少约100%。聚集物的含量可通过在 Protein Pak 300SW 柱(7. 5x 300mm) (Waters, 80013)上进行凝胶渗透 HPLC 而确定，方法如下将层析柱用洗脱液A(0. 2M硫酸铵,5%异丙醇,用磷酸将pH调至2. 5,然后用三乙胺将pH调至7. O)平衡，然后加载25 μ g样品。用洗脱液A以O. 5ml/min的流速洗脱30min，检测215nm的吸光值。聚集物的含量用凝血因子VII聚集物的峰面积/所有凝血因子VII (单体和聚集物)的峰的总面积来计算。“生物可利用度”是指在凝血因子VII或凝血因子VII相关制剂给药后的预定时间点可检测到的给药剂量的比例。通常，生物可利用度如下检测对动物给药约25-250 μ g/kg该制剂；在给药后的预定时间点获得血浆样品；和用凝血试验(或任何生物试验)、免疫分析或等效的试验中的一或多种试验测定样品中凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽的含量。数据通常用[凝血因子VII]对时间的图来表示，生物可利用度则表示为曲线下的面积(AUC)。待测制剂的相对生物可利用度是指，待测制剂与参照制剂的AUC之比。在一些实施方案中，本发明的制剂具有参照制剂的生物可利用度的至少约110%，优选至少约120%，更优选至少约130%，最优选至少约140%。生物可利用度可以在任何哺乳动物物种中测定，优选狗，用于计算AUC的预定时间点从IOmin渐增至8h。“半寿期”是指凝血因子VII多肽或凝血因子VII相关多肽的血浆浓度从一个具体值减少至它的一半所需的时间。半寿期可以用测定生物可利用度的方法来测定。在一些实施方案中，本发明制剂比参照制剂的半寿期增加至少约O. 25h，优选至少约O. 5h，更优选至少约Ih,最优选至少约2h。制剂的“致免疫性”是指该制剂给药至人体后，激发有害的体液和/或细胞免疫的能力。目前不清楚凝血因子VIIa多肽和凝血因子VIIa相关多肽能否在人体内激发可检测的免疫应答。但是在任何亚人群中，可能存在对具体给药蛋白敏感的个体。致免疫性可以如下检测用本领域已知的常规方法定量敏感个体中抗-凝血因子VII抗体和/或凝血因子VII-应答型T-细胞的存在。在一些实施方案中，本发明制剂对敏感个体的致免疫性为参照制剂对敏感个体的致免疫性的至少约10%，优选至少约25%，更优选至少约40%，最优选至少约50%。药用组合物和应用方法本发明制剂可用于治疗任何凝血因子VII- 应答性综合征，如出血疾病，包括但不限于，因凝血因子缺乏所致的疾病(如血友病A和B或凝血因子XI或VII缺陷)；血小板减少症或von Will ebrand病,或因凝血因子抑制剂所致疾病，或因任何原因所致过量出血。所述制剂还可以配合手术或其它创伤来给药，或给药至接受抗凝治疗的患者。包含本发明凝血因子VII相关多肽的制剂相对于野生型凝血因子VII的生物活性实质上减弱，它们可用作抗凝剂，用于例如正在接受血管形成术或其它有可能增加血栓或血管阻塞危险的手术的患者(如在再狭窄中发生的那样)。其它可以开出抗凝剂处方的临床指征包括，但不限于，深部静脉血栓，肺栓塞，休克，弥散性血管内凝血(DIC)，与革兰氏阴性内毒素血症有关的肺或肾内纤维蛋白沉积，或心肌梗塞；急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，系统性炎症应答综合征(SIRS)，溶血性尿毒综合征(HUS)，MOF，和TTP。包含本发明凝血因子VII和凝血因子VII相关制剂的药用组合物，主要用于非胃肠道给药，从而进行预防性和/或治疗性处理。优选所述药用组合物通过非胃肠道途径给药，即，静脉给药，皮下给药或肌肉内给药。它们可以通过连续或脉动型(pulsatile)输注方式给药。药用组合物或配制剂包含本发明的制剂，其组合了，优选溶于，可药用载体，优选含水载体或稀释剂。有多种含水载体可以使用，如水，缓冲水，O. 4%的盐水，O. 3%的甘油等等。本发明的制剂也可以配制成用于运送或靶向损伤部位的脂质体制剂。脂质体制剂的一般性描述可参见美国专利4，837，028,4, 501, 728，和4，975，282。所述组合物可以通过常规的已知灭菌技术灭菌。所得含水溶液可以包装备用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干制剂可以在给药前与无菌水溶液混合。所述组合物可以包含可药用的辅助物质或添加剂，包括但不限于，pH调节剂和缓冲剂和/或渗透压调节剂，如乙酸钠，乳酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙等。这些配制剂中凝血因子VII或凝血因子VII相关多肽的浓度可以有很大差异(gp，从O. 5%重量以下，通常为或至少约1%重量至15或20%重量)，主要依据与所选的具体给药方式相应的流体体积、粘度等来选择。因此，用于静脉输注的典型药用组合物可包含250ml无菌Ringer溶液和IOmg所述制剂。可以进行非胃肠道给药的组合物的真实制备方法为本领域已知或很明显，更详细的描述可参见 Remington’ s Pharmaceutical Sciences, 18th ed. , Mack PublishingCompany, Easton, PA(1990)。包含本发明制剂的组合物可以为了预防性和/或治疗性处理的目的而给药。在治疗性处理中，组合物是给予如上所述的已经患病的受试者，给药量足以治愈、缓解或部分控制所述疾病及其并发症。足以完成这些目的的量就是“治疗有效量”。每种目的的有效量取决于疾病或损伤的严重性以及受试者的体重和总体状态。但一般情况下，有效量通常为约O. 05mg 一约500mg制剂/日/70kg受试者，更常用的是约I. Omg 一约200mg制剂/日。可以理解的是，能用常规试验确定合适的剂量，方法是构建关于值的矩阵，并测试该矩阵中的不同点。本发明制剂的局部运送，例如，局部应用，可以，例如通过喷射、灌注、双气囊导管(double balloon catheters)、支架、掺入脉管移植物或支架、用于包被气囊导管的水凝胶、或其它成熟的方法来进行。在任一种情况中，所述药用组合物应该提供足以有效治疗受试者的制剂量。本发明的药用组合物还可以包含其它生物活 性制剂，如非-凝血因子VII-相关的凝血剂或抗凝剂。以下实施例旨在举例说明本发明，并非限制。实施例I :制备并分析具有改变的糖基型模式的凝血■因子VII制剂用以下实验制备具有改变的糖基型模式的凝血因子VII制剂。I.制备用编码凝血因子VII的质粒转化的BHK细胞系经过适应，能在没有血清的情况下在悬浮培养中生长。将所述细胞在旋转培养(spinnerculture)中连续传代,随着细胞数的增加，体积因加入新培养基而逐渐增大。最后，将6L育种(seed)培养物接种至含有大孔Cytopore I载体(Pharmacia)的100-升制备型反应器中，悬浮细胞因此被固定在所述载体上。将培养物维持在36°C、pH6. 7-6. 9和50%的DO中。随着细胞数的增加，制备型反应器中的体积因加入新培养基而逐渐增大。当细胞密度达到约2X IO6细胞/ml时，开始进入生产期，每24小时更换培养基终止搅拌，使含有细胞的载体沉降，然后收获80%的培养上清，代之以新的培养基。所收获的培养上清经过滤除去未被捕获的细胞和细胞残渣，然后转移以备进一步加工。在生产期，细胞达到3-6X IO6细胞/ml，滴度为2_7mg凝血因子VII/升。II.对重组凝血因子VII的糖基型樽式的分析比较以下制剂的寡糖模式(a)第I部分中所述的重组凝血因子VII制剂(n=7)；以及两种参照制剂；(b)在有牛血清的情况下于BHK细胞中产生的重组凝血因子VII制剂(n=10);和(c)从人血浆纯化得到的凝血因子VII制剂。所述多肽经过化学切割(肼解作用，使用GlycoPreplOOO设备，OxfordGlycoSciences)或酶切割(N-糖苷酶 F,如来自 Boehringer Mannheim)而释放N-连接型寡糖。将所释放的寡糖用2-氨基苯甲酰胺进行标记(使用单个标记试剂盒，K-404, Oxford Glyco-Sciences或Glyko)。被标记的寡糖在配有保护柱(4x50mm, Dionex, P/N 43054)的 CarboPac PAlOO 柱(4x250mm, Dionex, P/N43055)上通过阴离子交换HPLC进行分析。该柱用150mM氢氧化钠平衡，用0-150mM乙酸钠的梯度、150mM氢氧化钠来洗脱。寡糖用荧光来检测，激发波长为330nm，发射波长为420nm。各种凝血因子VII的寡糖结构(Klausen等，1998)的相对含量用阴离子交换HPLC分析中糖峰的相对峰面积来计算。根据每种寡糖的结构元素，将其如下分配(i)包含至少一个唾液酸的链；( )缺乏任何唾液酸(S卩，中性)的链；(iii)含有至少一个半乳糖残基的链；(iv)含有至少一个末端N-乙酰半乳糖胺残基的链；和(V)含有至少一个未加帽的天线(即，至少一个末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基)的链。最后，分配至每一组的寡糖链的相对含量的总和用总寡糖链的百分比来计算。测定值的标准差为O. 08% (一天内的差异)；0.7% (不同天之间的差异)；和0.5% (1-100 μ g间隔)。所得糖基型模式见下表


本发明涉及凝血因子VII的糖基型。本发明涉及包含凝血因子VII和其它凝血因子的制剂，所述因子具有改变的天冬酰胺-连接型糖基化模式。