专利名称：纯化维生素k依赖性蛋白如凝血因子ix的方法血友病是一类损害人体控制血液凝固或血凝能力的遗传失调。在其一种形式血友病B中，凝血因子IX (简称为FIX)缺乏，血友病B在每25000名男性中出现约I例。因子IX (或Christmas因子)是凝血系统的一种丝氨酸蛋白酶。它是维生素K依赖性血浆蛋白，通过在Ca2+离子、磷脂和因子VIIIa的存在下将因子X转化为其活性形式而参与血凝的。FIX蛋白是具有多功能性质的血凝必要因子。因子IX (FIX)是包含461个氨基酸的单链糖蛋白。它主要在肝脏中合成并分泌 在血浆中。因子IX分子由多个分开的功能域构成，包括信号肽、前肽、Gla域、两个类表皮生长因子(EGF)域、激活肽和催化的类胰蛋白酶域(丝氨酸蛋白酶域)(前肽在分泌产生成熟的415aa FIX分子之前裂解)。该蛋白进一步加工成其活性形式，由通过二硫键连接的轻链和重链构成的异质二聚体。FIX缺乏可以用FIX血源浓缩物或用重组生成的FIX治疗。用FIX浓缩物治疗已导致血友病患者的正常生活。历史上已用源自人血血浆的FIX治疗血友病B。在正常条件下FIX分子在血浆中以其自然状态循环，而通过在流血阶段凝血酶引起的复杂过程它被激活。血源FIX制品以不同纯度出现在市场上，这些纯度依赖于所施用的纯化方法。用于纯化FIX的方法通常是用于纯化的不同层析步骤(主要是离子交换和亲和步骤)和用于产品浓缩/脱盐的超滤步骤的组合。Harrison 等人(S. Harrison 等人,Sem Hematol 35 (Suppl 2) : 4-10 (1998))描述了 CHO细胞中产生的重组FIX(BenefiX )的制备方法。细胞通过微滤收获，随后在超滤/渗滤步骤中浓缩，其中缓冲液交换成Tris缓冲液以提供稠缓冲液用于负载到第一色谱柱上。4个独立的层析步骤用于纯化rFIX，第一个是阴离子交换步骤(Q琼脂糖凝胶FF)，以假亲和模式进行。该柱用pH为8. O的IOmM氯化钙洗脱。氯化钙诱导FIX分子的构象变化，而这引起它脱离柱。Q琼脂糖凝胶步骤后是在Matrex celIufine硫酸盐柱上纯化,该柱是用于亲和纯化具有肝素结合域的蛋白的肝素类似物。由于带负电的硫酸根基团，它也相当于阳离子交换树脂。Cellufine纯化步骤除去低水平的HCP。Cellufine洗脱液负载到是磷酸钙合成形式的陶瓷羟基磷灰石(Ceramic-Hydroxyapatite)柱上。它用于分离具有不同电荷的蛋白，并提供除去较低比活形式的rFIX的可能性。通过将磷酸盐浓度增加到最终浓度O. 5M的分级洗脱来洗脱该柱。Benefix 制备方法的最后纯化步骤是螯合物-EMD-Cu (II)。蛋白与被树脂截留的固定化金属相互作用。在该纯化步骤中结合的rFIX被作为置换剂的咪唑洗脱，并且痕量的污染物被除去，之后是病毒过滤步骤(Viresolve-70)，最后是超滤/渗滤步骤，其中rFIX被浓缩并且缓冲液交换成制剂缓冲液。上述rFIX制备方法是连续的，已分析65批，发现比活为276±23IU/mg。Gla含量为11.4±0. Imol Gla/mol rFIX，杂质总量通过RP-HPLC和HCP-ELISA测定分别为O . 01±0. 01% 和 O. 03 ± O. 01%。Lindsay 等人(J Chrom A 1026:149-157 (2004))描述了从转基因猪奶中提纯rFIX的方法。在该纯化方案中肝素琼脂糖凝胶FF用作第一步骤，之后是阴离子交换步骤。因子IX的肝素结合域位于分子的C-末端。该区域缺少PTM，因此肝素层析步骤允许整个种群的rFIX分离出。洗脱液的比活为30-35IU/mg，这表明大部分无活性。活性rFIX亚群在AIEX柱的梯度洗脱过程中与无活性的亚群分离。Kaufman 等人(JBC 261:9622-9628 (1986))描述了 rFIX在 CHO 细胞中的表达和该蛋白的纯化。在施加到具有构象特异性抗体(抗FIX = Ca(II)抗体)的免疫亲和柱之前，含rFIX的细胞培养基通过超滤浓缩，并从包含3mM CaCl2、O. 05M Tris-HCl和O. 5M NaCl的缓冲液中渗析。该柱随后用IOmM EDTA、0. 05M Tris-HCl和O. 15M NaCl洗脱。施加到该柱之前原料中存在3mM CaCl2导致活性与非活性FIX物质分离。非活性物质不能结合到柱上，而活性FIX被EDTA洗脱出柱。W0-A-2009/007451公开了使用混合模式或多峰树脂纯化FVIII的方法。该纯化方法基于使FVIII蛋白与含配体(包括疏水部分和带负电部分)的多峰或混合模式的树脂接触，并用洗脱缓冲液洗脱所述FVIII蛋白，所述洗脱缓冲液包含至少1.5M盐和至少40%(w/v)乙二醇、丙二醇或其混合物，以及钙离子。EP-A-1707634公开了通过各种方法分离重组生成的蛋白的方法，例如免疫亲和层析、亲和层析、蛋白沉淀、缓冲液交换、离子交换层析、疏水相互作用层析、混合模式的疏水/离子交换层析介质、螯合层析、碳水化合物亲和如外源凝集素或肝素亲和层析、尺寸排阻层析、电泳、渗析、不同沉淀剂如聚乙二醇、硫酸铵、乙醇、羟基磷灰石吸附、滤膜吸附、偶合磁性颗粒的配体等。但是，它认为没有特定的层析纯化步骤。W0-A-2005-082483公开了从液体中的一种或多种杂质纯化抗体的方法，该方法包括使所述液体与包括载体(该载体上固定化有多峰配体以将抗体吸附到树脂上)的第一色谱树脂接触，其中每一多峰配体包含至少一种阳离子交换基团和至少一种芳环或杂芳环体系。加入洗脱剂以使抗体从树脂上释放，并且洗出液与第二色谱树脂接触。W0-A-2005/121163公开了从蛋白溶液中分离一种或多种蛋白的方法。该方法包括如下步骤提供包含一种或多种特定蛋白且具有预设PH和预设离子强度或电导率的蛋白溶液，将该蛋白溶液施加到包括具有被多孔材料包围的至少一个高密无孔芯的颗粒的吸附柱上，该吸附剂的颗粒密度为至少I. 5g/ml，平均体积颗粒直径为至多150μπι。在从吸附剂上洗脱蛋白之前任选洗涤柱。W0-A-2009/156430A1公开了使用混合模式或多峰树脂纯化FVIII的方法。该纯化方法基于使具有高离子强度的溶液中的FVIII蛋白与含配体(包括疏水部分和带负电部分)的多峰或混合模式的树脂接触，并用包含至少一种PH为6-8时带正电的氨基酸的洗脱缓冲液洗脱所述FVIII蛋白。为改进含FIX的产品，采用针对FIX分子的特异性亲和层析，这有效地除去污染物至高水平的FIX纯度。常用免疫亲和层析的缺点是它相对昂贵，并使用动物源的单克隆抗体作为亲和配体。二十世纪八十年代中期存在一些与血源FIX产品有关的病毒传播。即使该问题通过实施特异性病毒减少步骤得以解决，但这是重组FIX产品(rFIX)的发展起点。二十世纪九十年代，第一种rFIX产品市场化，并且迄今也是唯一一种。
本发明的一个目的是提供一种通过它避免现有技术中维生素K依赖性蛋白，尤其 是FIX的纯化方法的缺陷的方法。从现有技术中已知传统离子交换色谱树脂(例如SP-、CM-、Q-或DEAE琼脂糖凝胶FF离子交换色谱树脂)的一个缺点是蛋白结合到树脂上仅可以在相对低的盐浓度(电导率)和pH内进行，通常在O. 01-0. 15M盐(NaCl等)浓度范围内。最佳的PH范围依赖于是否使用阳离子交换剂或阴离子交换剂以及待结合到树脂上的目标产品的等电点。一般而言，目标产品结合到离子交换树脂上的PH范围通常为比目标产品的等电点大致高或低I个pH。在某些应用中，需要能够采用相对温和的纯化条件，离子交换层析步骤在稍许增加的离子强度和正常范围外的PH下针对蛋白实施，也直接(没有进一步的稀释)针对层析树脂施加，而这不能用于常规的离子交换层析。多峰(或混合模式)色谱是用于纯化蛋白的工具，例如描述在制造商数据表 GEHealthcare(I1-0035-45AA)Capto Adhere、制造商数据表 GEHealthcare (28-9078-88AA)Capto MMC 和 W0-A-2009/024620 “A process for theisolation and purification of a target protein, free of prion proteins，，中。不足之处在于洗脱往往包括相对严苛的条件如中性pH以下或以上的pH，或这种pH还组合有其它洗脱参数如乙二醇以及如W0-A-2009/007451中描述的。增加的离子强度可明显有利于蛋白溶液的蛋白稳定性，尤其是在粗蛋白的制备中如收获重组蛋白或在血源产品(潜在的蛋白酶存在于溶液中，这可以不利地影响目标蛋白)中。由于蛋白酶往往在生理条件下(如在大多数细胞体系中的情况)作用最佳，即pH大致为7和大约O. 15M的盐浓度，因此可以有利的是改变这些条件以使蛋白酶的影响最小。这种改变通常可以通过添加盐和/或改变PH来进行。这些参数对于常规离子交换色谱步骤的性能都是关键的，因此往往不可能实现。由此本发明的另一目的是提供其中该问题已解决并使得在包含潜在蛋白水解因子如蛋白酶(使目标蛋白劣化)的粗蛋白样品中添加盐和/或改变PH成为可能的方法。该方法应还能尽可能少地需要其它措施来处理蛋白溶液并能使目标蛋白结合到色谱树脂上。这提供了从粗样品中浓缩和纯化目标蛋白或下游利用例如其它层析步骤如亲和层析进一步纯化的优化步骤。这种需要特别重要，因为要阻止或至少减少目标蛋白在纯化过程中降解。这使得可以在洗脱目标蛋白之前除去蛋白酶和其它污染物，这些物质可能存在于粗的收获物中。本发明的另一目的是提供一种尤其从重组FIX的细胞培养基收获物中纯化维生素K依赖性蛋白如FIX的方法。根据本发明，该目的通过在采用层析的纯化序列中纯化维生素K依赖性蛋白如FIX的方法来完成，其中-使用多峰树脂进行至少一种层析；-维生素K依赖性蛋白如FIX结合到多峰树脂上；以及-以含精氨酸的缓冲液在pH为6-9下从多峰树脂上洗脱维生素K依赖性蛋白如FIX。已知7种血浆糖蛋白的生物合成依赖维生素K。它们是凝血酶原(因子II)、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C、蛋白S和蛋白Z。Gla域是所有这些维生素K依赖性蛋白的共同结构特征，并且直接在Gla域后，每种蛋白(除了凝血酶原)都具有一种或多种类EGF域。维生素K依赖性蛋白需要Ca2+离子以表达其生理功能，并且钙结合位包括至少Gla域和类EGF域。钙结合使得这些蛋白能够结合到磷脂/细胞膜上，由此表达它们的全生物活性。 本发明使用多峰树脂作为捕集纯化步骤提供了将盐浓度和pH调节到使蛋白溶液中的活性蛋白酶在目标蛋白结合到多峰色谱步骤过程中的风险最小的值的可能性。本发明方法的优点是在目标蛋白结合到多峰树脂上(例如用作重组过程的捕集步骤)之后在洗脱目标蛋白之前还施用洗涤步骤的可能性。这通过使用多峰树脂来实现，在洗脱目标蛋白之前通过选择合适的洗涤缓冲液洗涤树脂以除去蛋白酶和粘附到多峰树脂上的其它污染物。合适的洗涤缓冲液优选包含盐或氨基酸或缓冲组分，或在适合仍抑制蛋白酶在洗涤除去步骤过程中的活性的PH下的其混合物。本发明的方法使得在具有独特洗脱性质(即以尽可能小的体积)的温和洗脱环境中洗脱结合到多峰树脂上的目标蛋白成为可能。这通过使用增加的PH或增加的盐浓度或添加氨基酸或其组合来实现。本发明的方法提供诸如抑制团聚体、保持天然分子结构和为进一步的下游处理提供小体积之类的优点。本发明还有助于在不加入人或动物源的稳定添加剂和不使用整体工艺(基于单克隆抗体的免疫亲和树脂)的纯化方法。使用多峰树脂尤其作为捕集步骤相比常规离子交换剂还有助于更高的结合能力，这样的结果是从柱上获得更浓的产物洗出液，这对产物稳定性是有利的。根据本发明的一种实施方案，多峰层析可以在色谱柱中进行。这可以视为第一捕集步骤。本发明的方法还可以间歇进行。在本发明的一种实施方案中，多峰树脂上的层析与在具有酵母源亲和配体的树脂上的层析组合，维生素K依赖性蛋白如FIX蛋白洗脱后的纯度>90%。在本发明的另一其它实施方案中，多峰树脂步骤和酵母源亲和配体层析步骤与其它层析纯化步骤组合，以在最终的维生素K依赖性产品如FIX蛋白中获得大于99%的纯度。因此物质组合物也是本发明的主题，该物质组合物包含可根据本发明方法(不加入或使用任何人或动物添加剂如白蛋白或基于单克隆抗体的免疫亲和配体)获得的经纯化的维生素K依赖性蛋白如FIX。在本发明的另一实施方案中，多峰树脂包含结合到基质上的部分，该部分能够与混合物中的维生素K依赖性蛋白通过离子相互作用和其它类型的相互作用如氢键、疏水和亲硫相互作用而相互作用。在本发明的另一实施方案中，亲和配体是针对维生素K依赖性蛋白如FIX的酵母源Fab片段。在本发明的另一实施方案中，进行多峰树脂步骤以从粗蛋白溶液中捕集维生素K依赖性蛋白如FIX，处理后所得多峰层析树脂洗出液在酵母源的亲和配体层析步骤，并且在从所述亲和层析步骤洗脱维生素K依赖性蛋白如FIX之后，相关蛋白和DNA的纯度大于90%。在本发明的另一其它实施方案中，特征在于如果进行多峰树脂步骤以从粗蛋白溶液中捕集维生素K依赖性蛋白如FIX，处理后所得多峰层析树脂洗出液在选自尺寸排阻、阴离子交换、阳离子交换、疏水相互作用和固定化金属亲和层析和酵母源的亲和配体的其它层析步骤中进一步处理，最终产品的纯度大于99%。在本发明的另一实施方案中，包含维生素K依赖性蛋白如FIX的混合物以溶液存在。 在本发明的另一实施方案中，维生素K依赖性蛋白如FIX在包括可以使产品劣化的潜在蛋白酶的粗蛋白溶液中。可以有利的是向多峰树脂施加洗涤缓冲液，以洗除污染物(蛋白酶、DNA等)并在其释放前截留维生素K依赖性蛋白如FIX。在本发明的另一实施方案中，在洗脱维生素K依赖性蛋白如FIX之前用pH为6-9的洗涤缓冲液洗涤多峰树脂。在本发明的另一实施方案中，用精氨酸作为洗脱剂进行洗脱。根据本发明，洗脱剂可以与增加的盐浓度组合，其中盐选自Hofmeister系列。根据本发明，洗脱可以用精氨酸单独或与增加的盐浓度组合或仅增加盐浓度来进行，所有这些在pH范围为6-9，优选pH为7. O下进行。根据本发明，有关包括在Hofmei ster系列的盐(例如钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钙盐、钡盐、乙酸盐、磷酸盐和硫酸盐)中优选NaCl和KCl。根据本发明，精氨酸的浓度尤其为约O. IM至约2M，根据Hofmeister系列的盐为O. IM至4M ;精氨酸尤其为约O. 4M至约I. 5M，根据Hofmeister系列的盐为O. 6M至2M ;或精氨酸为约O. 3M至约O. 7M，根据Hofmeister系列的盐为O. 8M至I. 2M。根据本发明的另一实施方案，维生素K依赖性蛋白如FIX在pH为6-9，优选pH为7. O下结合到多峰树脂上。在本发明的另一实施方案中，使用pH尤其为约6至约9包含优选选自下列物质的至少之一的缓冲物质柠檬酸钠、组氨酸、2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基)-乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、Tris碱和乙酸钠。在本发明的方法中，非离子型清净剂可以存在于任何所用缓冲液中，该非离子型清净剂尤其选自 Polysorbates (Polysorbate 20、40、60、80)和 Pluronic F68。在pH为6-9，优选pH为7. O的洗脱缓冲液中，精氨酸的量通常为O. I至2M，尤其是 O. 5M。在pH为6-9，优选pH为7. O的洗脱缓冲液中，所含氯化钠为O. I至4M，尤其为O. 05至 O. 3M。在pH为6-9，优选pH为7. O的洗脱缓冲液中，所含精氨酸和氯化钠为O. I至O. 5M，尤其为O. 3M至O. 7M。在pH为6-9，优选pH为7. O的洗涤缓冲液中，所含氯化钠为O. 01至O. 3M，尤其为O. 05 至 O. 15M。非离子型清净剂的量通常为O. 001至1%，在多峰层析的缓冲液中尤其为O. 02%。根据本发明可用的多峰层析树脂可以包含下列部分的至少一种a.带正电的N-苄基-N-甲基乙醇胺配体；b.带负电的2-(苯甲酰氨基)丁酸配体； c.苯丙基配体；d. N-己基配体；e. 4-巯基-乙基-吡啶配体；f. 3-((3-甲基-5-((四氢呋喃-2-基甲基)_氨基)_苯基)_氨基)_苯甲酸配体或其组合。特别地，根据本发明可用的多峰层析树脂选自下列可商购树脂HEP Hypercel ,PPA HyperceI 、Capto Adhere 、Capto MMC > MEP Hypercel 。在本发明方法的另一实施方案中，多峰层析树脂与维生素K依赖性蛋白如FIX亲和层析步骤组合，其中通过蛋白配体如抗体片段(例如在酵母中表达)提供亲和性。在本发明方法的另一实施方案中，纯化序列还可包括病原体除去/失活步骤，包括基于化学的失活步骤、基于尺寸的除去步骤、层析步骤或其组合，这些步骤基于涉及待除去的病原体的不同生理性质。文献中充分描述的病原体失活步骤的例子是基于化学的溶剂清净剂方法，例如EP-A-131740中公开的基于磷酸三正丁酯和Triton X-100，它们破坏所有脂质包封的病毒。基于尺寸的病原体除去步骤的例子是例如平均孔尺寸大约20nm的纳滤，如Planova 20过滤器。病原体除去的另一例子基于层析。例如，已知亲和层析一般利用病原体除去性质，例如酵母源维生素K依赖性蛋白如FIX亲和配体层析树脂。在本发明方法的特定实施方案中，纯化序列还包括下列步骤I.阳离子多峰树脂如Capto MMC ；2.用于脂质包封病毒的基于化学的失活步骤，特别是如EP-A-131740中公开的使用磷酸三正丁酯和Triton X-IOOa的溶剂/清净剂失活；3.基于在酵母中表达的配体的亲和树脂；4.阳离子交换剂如SP琼脂糖凝胶或Resource S ；5.平均孔尺寸大约20nm的病原体过滤除去步骤,如Planova 20N ；6.缓冲液交换和/或浓缩步骤如大致IOkDa截留分子量的超滤；7.尺寸排阻层析树脂如Superdex 200。在特定实施方案中，本发明方法包括下列步骤-将CaptoMMC 多峰树脂填充在柱中并用pH为7.0包含20mM柠檬酸钠、O. IMNaCUO. 02%Polysorbate 80 的缓冲液平衡；-施加包含维生素K依赖性蛋白如FIX的粗样品，包括与以上平衡缓冲液大致相同的条件，目标蛋白和一些其它杂质蛋白结合到柱上；-根据本发明将使用平衡缓冲液的洗涤步骤施用到柱上，以抑制蛋白水解活性并除去蛋白酶、DNA和其它污染物，而维生素K依赖性蛋白如FIX仍结合在柱上；-根据本发明使用其中添加O.5M精氨酸并调节至pH为7. O的平衡缓冲液洗脱维生素K依赖性蛋白如FIX，以获得低体积的稳定非团聚的维生素K依赖性蛋白如FIX部分。多峰(或混合模式)色谱是用于纯化蛋白的工具，例如描述在制造商数据表GEHealthcare (11-0035-45AA) Capto Adhere、制造商数据表 GE Healthcare (28-9078-88AA)Capto MMC 和 W0-A-2009/024620 “A process for the isolation and purification ofa target protein, free of prion proteins，，中。多峰色谱的上述缺点被在中性附近的pH范围的温和洗脱条件所避免，该范围保持维生素K依赖性蛋白如FIX分子的活性并有利于采用多峰色谱结合增加盐浓度的稳定效果，例如在EP-A-1707634中所述的。根据本发明的一种实施方案，多峰层析可以在色谱柱中进行。这可视为是第一捕集步骤。本发明方法还可间歇进行。本发明还有助于在不加入人或动物源的稳定添加剂和不使用(基于单克隆抗体的免疫亲和树脂)的纯化方法。使用多峰树脂尤其作为捕集步骤 相比常规离子交换剂还有助于更高的结合能力，这样的结果是从该步骤获得更浓的产物洗出液，这对产物稳定性是有利的。本发明的方法通常与重组维生素K依赖性蛋白如FIX (rFIX)的纯化有关。在本发明的另一实施方案中，多峰层析步骤与维生素K依赖性蛋白如FIX亲和层析步骤组合，其中亲和性由蛋白配体如在酵母中表达的抗体片段提供。因此物质组合物也是本发明的主题，该物质组合物包含可根据本发明方法(不加入或使用任何人或动物添加剂如白蛋白或基于单克隆抗体的免疫亲和配体)获得的经纯化的重组维生素K依赖性蛋白如FIX。通过下面非限制性实施例进一步描述本发明。
GE Healthcare的混合模式树脂Capto MMC (cat号17-5317)用作FIX分子的捕集步骤。Capto MMC是具有疏水和亲硫相互作用以及氢键的弱阳离子树脂。用Capto MMC树脂装填Tricorn 5/150柱至15. 7cm的床高。柱体积(CV)为3. 1ml。缓冲液平衡缓冲液:20mM柠檬酸钠、O. IM NaCUO. 02%Polysorbate 80，pH 为 7. O低盐洗涤缓冲液20mM柠檬酸钠、O. 2M NaCUO. 02%Polysorbate 80，pH 为 6. 5高盐洗涤缓冲液20mM柠檬酸钠、O. 7M NaCUO. 02%Polysorbate 80，pH 为 6. 5洗脱缓冲液20mM柠檬酸钠、O. 2M NaCl、0. 5M精氨酸盐酸盐、O.02%Polysorbate80, pH 为 6. 5实验设置用平衡缓冲液平衡该柱，随后以I毫升/分的流量负载原料。在这些缓冲条件过程中pdFIX结合到Capto MMC树脂上。如表I所示，流出物中没有pdFIX。该树脂随后经历如表I所述的不同洗涤条件，并且在任何经测试的洗涤缓冲液中都没有检测到PdFIX。通过向缓冲液中添加O. 5M精氨酸，FIX从树脂上释放，得到85%的收率。表I


一种在采用层析的纯化序列中制备无朊病毒的维生素K依赖性蛋白的方法，其特征在于使用多峰树脂进行至少一种层析步骤；以水性溶液提供含维生素K依赖性蛋白的部分；使含维生素K依赖性蛋白的部分与多峰树脂在pH为6-9下接触；在洗脱维生素K依赖性蛋白之前，任选用水性洗涤缓冲液洗涤具有所吸附的维生素K依赖性蛋白的多峰树脂，以洗去污染物并保留维生素K依赖性蛋白；-在含精氨酸的缓冲液中pH为6-9下从多峰树脂上洗脱维生素K依赖性蛋白；以及-任选收集纯化或富集形式的含维生素K依赖性蛋白的部分。