专利名称：利用半导体制冷片对温敏凝胶冷热调节的细胞片制备装置的制作方法组织工程细胞片通过组织工程方法使培养细胞从培养表面分离形成含有细胞外基质的完整片状结构，是组织工程中收获种子细胞和对种子细胞进行转移的一项新技术。组织工程细胞片含有离子通道、生长因子受体和连接蛋白等重要细胞表面蛋白，可避免因支架等载体的使用所带来的副作用，在皮肤、角膜、牙周膜、眼球表面、心肌和肺漏气等修复中得到广泛应用。早期，有学者将细胞均匀接种于玻璃培养皿中，待所有集落基本连接成片时，用机械方法将其从培养皿剥落获得细胞片(赵雄飞，张仕君，胡嘉念，路淑珍，王旭，黎鳌，培养的人表皮细胞片同种移植于烧伤创面，解放军医学杂志，1989，14(2) :82-85)，机械方法有时会损伤细胞，操作要求特别小心。近年来主要通过温敏培养皿、胶原凝胶、磁力组织工程、表面粗糙的颗粒单分子层和聚合电解质等方法制备组织工程细胞片(李海甲，王万鹏，史宏灿，组织工程细胞片构建方法，中国修复重建外科杂志，2011，25 (6)741-744)，其中温敏培养皿法通过降温来获得细胞片，方法简便可靠，得到了广泛的应用。利用温敏培养皿构建组织工程细胞片一般是将温敏性水凝胶共价嫁接至普通聚苯乙烯组织培养皿表面，利用其能感受外界环境温度的变化而发生溶胶-凝胶转变或者可逆体积转变的特性制备细胞片。可用于制备温敏性水凝胶的材料包括聚N-异丙基丙烯酰胺(poly-N-isopropylacrylamide,PNIPAAm)、甲基乙烯基醚(MVE)、丙烯酸-2-N-吗啉基乙酯(MPEMA)、N，N’ - 二甲胺基乙酯(DMAEMA)、甲基丙烯酸(MAAC)、泊洛沙姆(Poloxamer)、聚丙烯酸(PAA)、聚丙烯酰胺(PAAm)等合成高聚物，以及纤维素及其衍生物、壳聚糖及其衍生物等天然聚合物，其中聚N-异丙基丙烯酰胺温敏性水凝胶尤为引人关注。聚N-异丙基丙烯酰胺分子内具有一定比例的疏水性的异丙基(-CH(CH3)2-)和亲水性的酰胺基(-NHC0-)，而且亲水/疏水平衡受温度影响，在37°C时相对疏水，利于细胞粘附、伸展和增殖，当温度下降至聚合物的低临界溶液温度(Low critical solution temperature, LTCST, 32°C )时,聚合物表面变得亲水、膨胀，与培养细胞之间形成一水化层，使细胞自然与培养皿分离。利用温敏培养皿构建组织工程细胞片无需酶处理，保持了一些重要细胞表面蛋白质的完整，条件温和，收率高，而且能使从凝胶表面上解吸附下来的细胞保持较高的活性。然而，在细胞片制备过程中温度改变的实现和控制仍是一个难题，目前大多通过降低室内环境来实现，所需时间较长，也不容易准确控制温敏培养皿里温敏性水凝胶的温度，容易造成低温对细胞的损伤。发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种简单快速的细胞片制备装置，不仅可以快速实现温敏性水凝胶的温度改变，而且可以适时监控培养器皿温度。为解决上述技术问题，本发明的利用半导体制冷片对温敏凝胶冷热调节的细胞片制备装置包括一固定框，其上设有半导体制冷片，半导体制冷片上涂有导热油与培养器皿紧密连接，半导体制冷片通过导线连通接有电源的控制器，培养器皿内壁底覆有一层温敏凝胶，外壁底布置有温度传感器。所述培养器皿可为多种尺寸的培养皿、培养瓶或培养板(6孔、12孔、24孔、48孔、96孔等)等。所述温敏凝胶的低临界溶液温度低于37°C，可以选择聚N-异丙基丙烯酰胺、甲基乙烯基醚、丙烯酸-2-N-吗啉基乙酯、N，N’ - 二甲胺基乙酯、甲基丙烯酸、泊洛沙姆、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺等合成高聚物，以及纤维素及其衍生物、壳聚糖及其衍生物等天然聚合物，优选聚N-异丙基丙烯酰胺，可通过单体聚交联、聚合物交联或载体的接枝共聚等 方法获得，还可以制成膜、微球、块、胶乳等形状。可采用接枝共聚、相转变聚合、低温处理、引入无机纳米粒子和利用成孔剂等方法来提高水凝胶的响应速率，也可通过形成互穿网络结构和利用物理交联等方法提高水凝胶的响应速率和力学性能等。也可通过相分离法、乳液模板法、致孔剂法、聚合物互穿网络法等向水凝胶中引入多孔结构，以提高聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶的响应速率。在聚N-异丙基丙烯酰胺基础上引入壳聚糖，保留PNIPAAm温敏性的同时，改善其生物相容性。可将丙烯酸、丙烯酰胺等亲水性单体引入凝胶骨架结构可以提高其低临界溶液温度。半导体制冷片是实现温度改变调控细胞粘附/脱附的关键，其原理是利用半导体材料的Peltier效应，采用特殊半导体材料热电堆来制冷，能够将电能直接转换为热能，可同时实现制冷和加热，改变电源的正负级即可方便切换制冷和加热。所述半导体制冷片并联或串联，均匀对称间隔排列在固定框内，其数量为1-100枚，每枚尺寸为0. 5mmX 0. 5mmX 0. 5mm到10mm X 10mm X 10mm。所述半导体制冷片上刻有小槽安装I个温度传感器，或者半导体制冷片之间的空隙处装有1-200个温度传感器；各温度传感器与控制器的温度输入端相连接。所述控制器为温度可控的控制器，设有显示瞬态温度的显示屏和温度报警器。所述培养器皿通过弹簧和压板压紧在固定框内与半导体制冷片紧密接触。培养器皿上边缘高出固定框上边缘lmm-40mm，以利于方便取出培养器皿。3_12对弹簧和压板对称分布在固定框上边缘上。综上所述，本发明的细胞片制备装置通过半导体制冷片对温敏性水凝胶进行加热或冷却，利用温敏性水凝胶能感受外界环境温度的变化而发生溶胶-凝胶转变或者可逆体积转变的特性制备组织工程细胞片。半导体制冷片不需要任何制冷剂，可连续工作，没有污染源没有旋转部件，不会产生回转效应，没有滑动部件是一种固体片件，工作时没有震动、噪音、寿命长，安装容易。而且半导体制冷片热惯性非常小，制冷制热时间很快。安装在培养器皿的温度传感器可以适时监控温敏性水凝胶的温度。与现有组织工程细胞片制备装置相比，在温度改变速度和适时监控上都有了明显的提高，可减少温度对细胞的损伤，这也是本发明提出的关键之一。本发明提供的细胞片制备装置可根据细胞片培养的要求选择不同的温敏性水凝胶材料和半导体制冷片排列方式，所实现的制备装置简单可靠，有望在更多组织工程细胞片制备中发挥重要作用。所选择温敏性高分子材料不仅局限于聚N-异丙基丙烯酰胺，只要所选择的高分子材料的低临界溶液温度符合培养要求。为简洁起见，本发明主要以聚N-异丙基丙烯酰胺为例加以阐述，其他温敏性水凝胶可以采用相同的原理。图I是本发明提供的利用半导体 制冷片对温敏凝胶冷热调节的细胞片制备装置的结构不意图；图2是本发明提供的利用半导体制冷片对温敏凝胶冷热调节的细胞片制备装置的结构俯视图；图3是本发明提供的利用半导体制冷片对温敏凝胶冷热调节的细胞片制备装置的另一实施例的结构不意图；图4是本发明提供的利用半导体制冷片对温敏凝胶冷热调节的细胞片制备装置的第三实施例的结构示意图；图5是本发明提供的利用半导体制冷片对温敏凝胶冷热调节的细胞片制备装置的第四实施例的结构示意图。其中1、固定框；2、半导体制冷片；3、培养器皿；4、温敏凝胶；5、温度传感器；6、控制器；7、弹簧；8、压板；9、孔；10、散热片；11、导线；12、导线。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。图I是本发明提供的利用半导体制冷片对温敏凝胶冷热调节的细胞片制备装置的结构示意图，其结构俯视图如图2所示。图3、4和5是本发明另三个实施例的结构示意图。由图I和图2可知，本发明的利用半导体制冷片对温敏凝胶冷热调节的细胞片制备装置，包括一固定框(1)，其上设有半导体制冷片(2)，半导体制冷片(2)上涂有导热油与培养器皿(3)紧密连接，半导体制冷片(2)并联或串联，通过导线连通接有电源的控制器(6)，培养器皿(3)内壁底覆有一层温敏凝胶(4)，外壁底布置有温度传感器(5)。所述培养器皿(3)可为多种尺寸的培养皿、培养瓶或培养板出孔、12孔、24孔、48孔、96孔等)等，固定框(I)的外形尺寸根据培养器皿(3)的调整，固定框(I)和培养器皿(3)紧密结合。所述培养器皿(3)通过弹簧(7)和压板(8)压紧在固定框(I)内与半导体制冷片(2)紧密接触。培养器皿(3)上边缘高出固定框(I)上边缘lmm-40mm，以利于方便取出培养器皿(3)。3-12对弹簧(7)和压板(8)对称分布在固定框上边缘上。所述温敏凝胶(4)的低临界溶液温度应低于37°C，可以选择聚N-异丙基丙烯酰胺、甲基乙烯基醚、丙烯酸-2-N-吗啉基乙酯、N，N’_ 二甲胺基乙酯、甲基丙烯酸、泊洛沙姆、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺等合成高聚物，以及纤维素及其衍生物、壳聚糖及其衍生物等天然聚合物，优选聚N-异丙基丙烯酰胺，可通过单体聚交联、聚合物交联或载体的接枝共聚等方法获得。可采用接枝共聚、相转变聚合、低温处理、引入无机纳米粒子和利用成孔剂等方法来提高水凝胶的响应速率，也可通过形成互穿网络结构和利用物理交联等方法提高水凝胶的响应速率和力学性能等。也可通过相分离法、乳液模板法、致孔剂法、聚合物互穿网络法等向水凝胶中引入多孔结构，以提高聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶的响应速率。在聚N-异丙基丙烯酰胺基础上引入壳聚糖，保留聚N-异丙基丙烯酰胺温敏性的同时，改善其生物相容性。可将丙烯酸、丙烯酰胺等亲水性单体引入凝胶骨架结构可以提高其低临界溶液温度。[0019]所述半导体制冷片⑵均匀对称间隔排列在固定框⑴内，其数量为1-100枚，每枚尺寸为0. 5mmX 0. 5mmX 0. 5mm到10mmX 10mmX 10mm。半导体制冷片(2)可以单层布置也可以多层布置，多层布置时每层之间涂有导热油，减少接触热阻。根据培养器皿(3)的大小和底部厚度选择半导体制冷片(2)的布置方式和数量，获得足够的制冷和加热能力。当只布置一块半导体制冷片(2)时，在半导体制冷片(2)上刻有小槽安装I个温度传感器(5)(如热电偶或热电阻等)；当布置多块半导体制冷片⑵时，在半导体制冷片⑵之间的空隙处装有1-200个温度传感器(5)。各温度传感器(5)与控制器(6)的温度输入端相连接。所述控制器(6)为温度可控的控制器，设有显示瞬态温度的显示屏和温度报警器。在控制器(6)内安装已经编好程序的芯片，根据设定的温度和温度传感器(5)测量的温度产生不同形式的电流输出，实现不同的冷却或加热。当温度传感器(5)获得的温度过高或者过低时由控制器(6)里的温度报警器进行提示。[0020]实施例I由图I和2可知，本实施例中，固定框⑴和控制器(6)制作成一体，所有导线都集成在装置内，结构紧凑。当培养器皿(3)底面积较小，所需制冷量不大时，在固定框(I)底部设有镂空的孔(9)露出半导体制冷片(2)的底面，以利于利用空气散热。实施例2由图3可知，本实施例中，固定框(I)和控制器(6)制作成一体，所有导线都集成在装置内，结构紧凑。在培养器皿(3)底面积较大，所需制冷量较大时，在固定框(I)底部加工成散热片(10)，增加散热面积。实施例3由图4可知，本实施例中，固定框⑴和控制器(6)单独分开，半导体制冷⑵和温度传感器(5)分别通过导线(11)和导线(12)与控制器(6)连接，可以通过控制器(6)远距离控制半导体制冷片(2)的冷却和加热。固定框(I)不仅可以采用图I和图2所示的方形，在培养器皿(3)为圆形或者其他形状时也可以加工成圆形或者其他形状。在培养器M (3)底面积较小，所需制冷量不大时，在固定框(I)底部设有镂空的孔(9)露出半导体制冷片(2)的底面，以利于利用空气散热。实施例4由图5可知，本实施例中，固定框⑴和控制器(6)单独分开，半导体制冷⑵和温度传感器(5)分别通过导线(11)和导线(12)与控制器(6)连接，可以通过控制器(6)远距离控制半导体制冷片(2)的冷却和加热。固定框(I)不仅可以采用图I和图2所示的方形，在培养器皿(3)为圆形或者其他形状时也可以加工成圆形或者其他形状。在培养器皿(3)底面积较大，所需制冷量较大时，在固定框(I)底部加工成散热片(10)，增加散热面积。本发明提供的细胞片制备装置通过半导体制冷片对温敏性水凝胶进行加热或冷却，利用温敏性水凝胶能感受外界环境温度的变化而发生溶胶-凝胶转变或者可逆体积转变的特性制备组织工程细胞片。相比目前通过改变室内温度调节温敏性水凝胶温度的方法，本发明具有温度改变速度快，且可适时监控温度，结构紧凑等优点。正是由于这些综合因素，使得本发明提供的装置结构简单，可靠，相比以往的制备装置有很大的优势。