专利名称：：一种添加苯乙酸月桂醇酯制备l-丙氨酸的方法技术领域：。：L-丙氨酸(L-Alanine)亦称α-氨基丙酸，白色无臭结晶性粉末。是生命体内与糖代谢密切相关、需求量较多的氨基酸之一，已在医药、食品及化工等行业中得到广泛应用，是食品、化妆品、饲料生产的重要添加剂，也是维生素Β6、泛酸钙、氨基酸营养输液等药物合成中间体及其它有机合成产物的主要原料，如抗氧化剂、诱食剂、除草剂。其生产已成为继谷氨酸、赖氨酸之后的又一重要的氨基酸产业。在国外，日本的味之素公司最早开始规模化生产L-丙氨酸。方法也由提取法.化学合成法，发展到以L-天冬氨酸(L-Asp)为原料，采用L-天冬氨酸-β-脱羧酶转化的生物反应法生产。采用丙酸为原料的化学合成法收率低，产品纯度差，工艺落后，并且存在严重的污染性。生物反应法，以L-天冬氨酸为原料经酶促转化反应而得，全套设备主要由微生物菌体细胞培养、酶促转化反应、提取精制系统等部分组成。该法设备投资少，工艺路线短，无污染，成本低，易于操作，引起研究和投资者的关注并逐渐采用而成为主流。生物反应法中，制酶成本占据了生产成本的较大比重。而由于生产菌种的特性决定了有大量的L-天冬氨酸_β_脱羧酶是存在菌体内的，即这部份所谓的胞内酶，在生产中没有被利用而浪费。在实验室，如用超声波、高压勻浆破碎法等处理菌体细胞时，细胞壁被破坏，酶释放出来，酶活力显著提高。但现有生产技术条件无法采用此类破壁技术，因此如何改进制酶工艺，提高有效胞外酶活力，降低制酶和生产成本是现有生产工艺改进的重点方向。苯乙酸月桂醇酯是高碳醇、强疏水、弱亲水的线型分子，是一种非离子表面活性齐U，能显著降低溶剂表面张力和液-液界面张力，是一种良好的分散剂、乳化剂、组织改良剂和润滑剂。低温下溶于水，有良好的消泡、抑泡作用，且无毒、无刺激性。
本发明的目的是提供一种添加苯乙酸月桂醇酯制备L-丙氨酸的方法，能够提高L-天冬氨酸_脱羧酶有效酶活力及酶促转化反应的稳定性，增加单批次投料量。本发明通过如下技术方案达到上述目的一种添加苯乙酸月桂醇酯制备L-丙氨酸的方法，包括如下步骤1)菌种培养将从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买保藏号为20147的假单胞菌(Pseudomonasdacunhae)菌种，接入pH7.0的斜面培养基，30°C条件下培养24h，得到活化的菌种。所述斜面培养基为含蛋白胨2.0g、牛肉膏1.0g、酵母膏1.0g、氯化钠1.0g、琼脂4.Og以及水200ml。2)发酵产酶及酶促转化反应将上述活化的菌种接入pH7.0的发酵产酶培养基中，30°C条件下培养24h，得到发酵液，即酶液。所述发酵产酶培养基为含富马酸30g、葡萄糖30g、蛋白胨17g、玉米浆13g、KH2PO40.6g、MgS040.4g、苯乙酸月桂醇酯0.2-4.Oml以及水2000ml。在上述酶液中添加苯乙酸月桂醇酯0.2-4.0ml，底物L-天冬氨酸6000_9000g，pH值为5.0-7.5，温度为30-45°C的条件下进行酶促转化反应5_7天，生成L-丙氨酸粗品。在菌种产酶或酶促反应时添加一定量的苯乙酸月桂醇酯，可以显著提高L-天冬氨酸_脱羧酶胞外酶活力及酶促转化反应的稳定性，增加酶的实际使用效率，从而提高单批次投料量。3)提取精制将上述L-丙氨酸粗品加水6000ml，搅拌升温至80°C重溶，添加60g活性炭脱色，过滤，70°C减压浓缩，冷却析出结晶，离心分离，洗涤，干燥即得L-丙氨酸产品。所述苯乙酸月桂醇酯为分析纯试剂。本发明的有益效果是1、苯乙酸月桂醇酯用量少，价格低廉，可提高L-天冬氨酸_β_脱羧酶有效酶活力和酶促反应稳定性，增加单批次投料量。2、不需要改变原有工艺路线和设备，添加方式简单，易操作，易使用。具体实施例方式以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步描述对照例1)菌种培养将从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买保藏号为20147的假单胞菌(Pseudomonasdacunhae)菌种，接入pH7.0的斜面培养基，30°C条件下培养24h，得到活化的菌种。所述斜面培养基为含蛋白胨2.0g、牛肉膏1.0g、酵母膏1.0g、氯化钠1.0g、琼脂4.Og以及水200ml。2)发酵产酶及酶促转化反应将上述活化的菌种接入pH7.0的发酵产酶培养基中，30°C条件下培养24h，得到发酵液，即酶液。所述发酵产酶培养基为含富马酸30g、葡萄糖30g、蛋白胨17g、玉米浆13g、KH2PO40.6g、MgS040.4g、水2000ml。上述酶液中添加底物L-天冬氨酸5300g，pH值为5.0-7.5，温度为30°C的条件下进行酶促转化反应，搅拌反应5天，生成L-丙氨酸粗品。3)提取精制将上述L-丙氨酸粗品加水6000ml，搅拌升温至80°C重溶，添加60g活性炭脱色，过滤，70°C减压浓缩，冷却析出结晶，离心分离，洗涤，干燥即得L-丙氨酸产品。实施例11)菌种培养将从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买保藏号为20147的假单胞菌(Pseudomonasdacunhae)菌种，接入pH7.0的斜面培养基，30°C条件下培养24h，得到活化的菌种。所述斜面培养基为含蛋白胨2.Og、牛肉膏l.Og、酵母膏l.Og、氯化钠l.Og、琼脂4.Og以及水200ml。2)发酵产酶及酶促转化反应将上述活化的菌种接入pH7.0的发酵产酶培养基中，30°C条件下培养24h，得到发酵液，即酶液。所述发酵产酶培养基为含富马酸30g、葡萄糖30g、蛋白胨17g、玉米浆13g、KH2PO40.6g、MgS040.4g、苯乙酸月桂醇酯0.2ml以及水2000ml。在上述酶液中添加0.2ml的苯乙酸月桂醇酯、底物L-天冬氨酸6630g，pH值为5.0-7.5，温度为30°C的条件下进行酶促转化反应，搅拌反应5天，生成L-丙氨酸粗品。3)提取精制将上述L-丙氨酸粗品加水6000ml，搅拌升温至80°C重溶，添加60g活性炭脱色，过滤，70°C减压浓缩，冷却析出结晶，离心分离，洗涤，干燥即得L-丙氨酸产品。实施例21)菌种培养将从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买保藏号为20147的假单胞菌(Pseudomonasdacunhae)菌种，接入pH7.0的斜面培养基，30°C条件下培养24h，得到活化的菌种。所述斜面培养基含蛋白胨2.Og、牛肉膏1.0g、酵母膏1.0g、氯化钠1.0g、琼脂4.Og以及水200ml。2)发酵产酶及酶促转化反应将上述活化的菌种接入pH7.0的发酵产酶培养基中，30°C条件下培养24h，得到发酵液，即酶液。所述富马酸30g、葡萄糖30g、蛋白胨17g、玉米浆13g、KH2PO40.6g、MgSO40.4g、苯乙酸月桂醇酯1.Oml以及水2000ml。在上述酶液中添加1.0ml的苯乙酸月桂醇酯、底物L-天冬氨酸7720g，pH值为5.0-7.5，温度为37°C的条件下进行酶促转化反应，搅拌反应6天，生成L-丙氨酸粗品。3)提取精制将上述L-丙氨酸粗品加水6000ml，搅拌升温至80°C重溶，添加60g活性炭脱色，过滤，70°C减压浓缩，冷却析出结晶，离心分离，洗涤，干燥即得L-丙氨酸产品。实施例31)菌种培养将从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买保藏号为20147的假单胞菌(Pseudomonasdacunhae)菌种，接入pH7.0的斜面培养基，30°C条件下培养24h，得到活化的菌种。所述斜面培养基为含蛋白胨2.0g、牛肉膏1.0g、酵母膏1.0g、氯化钠1.0g、琼脂4.Og以及水200ml。2)发酵产酶及酶促转化反应将上述活化的菌种接入pH7.0的发酵产酶培养基中，30°C条件下培养24h，得到发酵液，即酶液。所述发酵产酶培养基为含富马酸30g、葡萄糖30g、蛋白胨17g、玉米浆13g、KH2PO40.6g、MgS040.4g、苯乙酸月桂醇酯4.0ml以及水2000ml。在上述酶液中添加苯乙酸月桂醇酯4.0ml、底物L-天冬氨酸8640g，pH值为5.0-7.5，温度为45°C的条件下进行酶促转化反应，搅拌反应7天，生成L-丙氨酸粗品。3)提取精制将上述L-丙氨酸粗品加水6000ml，搅拌升温至80°C重溶，添加60g活性炭脱色，过滤，70°C减压浓缩，冷却析出结晶，离心分离，洗涤，干燥即得L-丙氨酸产品。上述实施例中，底物L-天冬氨酸的投入、产物L-丙氨酸的产出、摩尔转化率、提取收率结果如表1所示表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>生成L-Ala量133.1(L-Asp分子量)1)摩尔转化率=--------------X-------------------X100%加入L-Asp量89(L-Ala分子量)实得L-Ala量2)提取收率=--------------X100%。生成L-Ala量权利要求一种添加苯乙酸月桂醇酯制备L-丙氨酸的方法，包括菌种培养、发酵产酶和酶促转化反应、产品提取和精制步骤，其特征在于，所述发酵产酶和酶促转化反应的具体条件为发酵产酶将活化的菌种接入pH7.0的发酵产酶培养基中，30℃条件下培养24h，得到发酵液，即酶液，所述发酵产酶培养基为含富马酸30g、葡萄糖30g、蛋白胨17g、玉米浆13g、KH2PO40.6g、MgSO40.4g、苯乙酸月桂醇酯0.2-4.0ml以及水2000ml，酶促转化反应在上述酶液中添加苯乙酸月桂醇酯0.2-4.0ml，底物L-天冬氨酸6000-9000g，pH值为5.0-7.5，温度为30-45℃的条件下进行酶促转化反应5-7天，生成L-丙氨酸粗品。全文摘要一种添加苯乙酸月桂醇酯制备L-丙氨酸的方法，包括菌种培养、发酵产酶和酶促转化反应、产品提取和精制步骤，所述发酵产酶是将活化菌种接入pH为7.0，体积百分数为0.01-0.2％的苯乙酸月桂醇酯的发酵产酶培养基中，30℃条件下培养24h，得到酶液；酶促转化反应是在酶液中添加体积百分数为0.01-0.2％的苯乙酸月桂醇酯，底物L-天冬氨酸，pH值为5.0-7.5，温度为30-45℃的条件下进行酶促转化反应，生成L-丙氨酸。该方法使用苯乙酸月桂醇酯能够提高L-天冬氨酸-β-脱羧酶有效酶活力和酶促反应稳定性，增加单批次投料量。文档编号C12P13/06GK101831467SQ20101015216公开日2010年9月15日申请日期2010年4月21日优先权日2010年4月21日发明者何鑫平,吴孔阳,夏小斌,康超,彭康,曹喜秀,曹普美,李湘萍,李灿民,李秋蓉,梁智群,梁耀星,汪晟,白山,黄时海申请人:广西大学