狂犬病病毒ctn-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法[0002]狂犬病病毒(Rabies virus, RV)是高度嗜神经病毒，为弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属(Lyssavirus genus)中不分节段的单股负链RNA病毒，能引起人兽共患的世界性传染病一狂犬病。据报道全世界每年因狂犬病的死亡人数约有5.5万例，实际死亡人数应明显高于该统计数字(http://www.worldrabiesday.0rg/)。目前除日本、英国、夏威夷等少数国家和地区没有狂犬病发生以外，该病呈世界性分布。亚洲和非洲是人狂犬病发生最严重的地区，占全世界死亡总人数的99%。在正式报告狂犬病的国家中，印度每年有3万人以上死于狂犬病，居首位；我国近20年每年统计到的死亡人数超过 3000 例，居第二位(Yunpeng wang et al., 2012.Journal of AppliedVirology.1:10-19)。目前尚无法医治狂犬病，疫苗接种免疫是预防狂犬病的唯一有效途径。[0003]狂犬病疫苗是由灭活或减毒的RV制备。由于RV是嗜神经性病毒，几乎对所有哺乳动物的神经组织都具有侵染性。世界上首次试用的狂犬病疫苗就是用RV感染兔脊髓研制的，以后经兔脑、小鼠脑、羊脑等动物神经组织培养，制备疫苗。但由于该类疫苗效力低且存在严重的变态反应而被WHO停用(林放涛等.1992.狂犬病学.203-221 ;Meslin F.X.et.al., 1996.Laboratory techniques in rabies.4th ed.WH0.223-313)。1958 年 Kissling等将RV街毒株和固定毒株在原代地鼠肾细胞中传代(Kissing P.E.et al., 1958.Proc.Soc Exp Biol Med.98:223-225)。20世纪60年代以后用细胞制备疫苗有了很大发展，人们开始利用各种细胞来大规模生产狂犬病疫苗，特别是人二倍体细胞培养疫苗(HDCV)的研制(Wiktor etal., 1964.J Immunol.93:353-366)。由于不存在神经元组织，与之前的脑组织疫苗相比，组织培养疫苗不仅更安全，而且更有效。目前已批准若干种组织培养疫苗，其具有与HDCV相当的疗效和安全性，例如`纯化鸡胚细胞疫苗(PCEC) (Barth et al., 1984.J BiolStand.12:29-64; Schgal et al.，1993.J.Commun.Dis.27:36-43)和纯化 vero 细胞狂犬病疫苗(PVRV) (Suntharasamal et al.，1986.Lancet.2:129-131)。[0004]RV CTN-1株是WHO和我国有关部门批准用于疫苗生产的毒株，由中国食品药品检定研究院建株和保存。20世纪80年代李宏玲等将RV CTN-1株在vero细胞中培养进行适应传代，得到较高滴度的CTN vero细胞适应株，可用于疫苗生产(李宏玲等.1989.生物制品学杂志.2:22-25)。董关木等进一步证实RV CTN-1株可在vero细胞内快速适应，滴度可到7.0logLD5cZml以上，并可多次收获病毒培养液(董关木等.1995.微生物学免疫学进展.23:82-85)。目前已有多家生产单位应用RV CTN-1株生产vero细胞疫苗并取得生产文号和投产(俞永新.2008.狂犬病和狂犬病疫苗.第二版:192-208)。但veix)细胞基质为永生性传代细胞系，因此有必要检测终产品中的细胞残留DNA (Ref.欧洲药典.2004.中国药典.2010)，因为其可能具有传递潜伏病毒和其他物质的风险。WHO也规定人用制品的残留 DNA 剂量应不超过 IOng (WHO Expert Committee on Biological Standardition.Recommendations inactivated rabies vaccine for human use produced in cellsubstrates andembryonated eggs.Genava.WH0.2005)。[0005]Rudolph Barth等人(US4115195)描述了生产狂犬病疫苗的过程，其中多种RV毒株均可利用鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast cells, CEC)制备狂犬病疫苗,如VPll株、Pasteur株、PM株、Flury LEP和Flury HEP。他们在专利中具体提供了利用 RV 固定株 VPl1、Flury LEP 和 Flury HEP 感染 CEC 的实例。PATEL Pradip Maganlal和 PATEL PankajRamanbhai (PCT/IN2008/000262)描述了 Pitman moore 株(Wistar 株PM-HDCS1503-3M)适应于CEC，所得到的RV毒株产量高且生产时间短，易于成规模生产。1984年底我国的陈道民和林放涛择用Flury (LEP)株68代鸡胚固定毒(兽用活疫苗株)适应到CEC培植人用狂犬病疫苗株，初步获得一株既能使用CEC又具有与a G株(3)免疫原性相仿的狂犬病鸡胚细胞适应株一武汉(Wuhan)34株(陈道民等.1988.中国人寿共患病杂志.4:28-30)。但未见到有关该适应毒株进一步的报道。王远征等人也尝试将RV aG株在CEC上进行传代适应，得到滴度可达7.0lgLD5tlAil的毒株，但该毒株是否已完全适应于CEC尚不确定(王远征等.2012.中国生物制品学杂志.25:669-671)。迄今为止，还没有文献提及使RV CTN-1株适应于CEC。
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种使狂犬病病毒CTN-1株适应于原代鸡胚成纤维细胞的方法以及利用方法得到的CTNCEC25株在制备狂犬病病毒灭活疫苗中的用途。[0007]本发明提供了狂犬病病毒CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，包括如下步骤:
[0008]步骤一:将RV CTN-1V5在vero细胞中连续传10代，得到CTN-1V15株。
[0009]步骤二:将CTN-1V15株毒种在鸡胚中传I代，获得的RV CTN鸡胚一代病毒。
[0010]步骤三:将RV CTN鸡胚一代病毒在鸡胚成纤维细胞中进行传代，使其逐渐适应鸡胚成纤维细胞。
[0011]所述步骤一中，是用PH7.4的PBS将RV CTN-1V5做10倍系列稀释，然后按照1: 100~1: 1000的比例接种vero单层细胞，37 °C吸附60分钟后补加细胞维持液，置于37°C、5%C02培养箱内静置培养，培养4~6天收获病毒上清液，如此连续传10代，得到CTN-1V15 株。
[0012]所述步骤二中，是将CTN-1V15株毒种经ρΗ7.4的PBS经1:10~1:1000稀释后，取病毒稀释液经卵黄囊接种6~7日龄的SPF鸡胚，每胚0.5ml，置于37~39°C、相对湿度40~80%的全自动孵蛋箱内进行孵育，孵育至72~144小时，收取濒临死亡但未死亡的胚胎，去除鸡胚的头后，将躯干研磨粉碎，并按照鸡胚重量加入病毒保护液制备成10%的病毒悬液，然后2000rpm、4°C离心10分钟，如此传一代获得CTNCE01。
[0013]所述步骤三中，是将CTNCE01用pH7.4的PBS以10°~10_4稀释后，按照接种比例1:10~1: 5X IO5与CEC悬液混合均匀，分装入细胞培养瓶内，置于35~37°C、5%C02培养箱内培养，培养至细胞出现病变收获病毒液，继续将病毒在CEC悬液上按照上述培养条件进行传代，适应并稳定后得到CTNCEC25株。
[0014]步骤三中传代所使用的培养基为以199培养基为基础，补充牛血清、HEPES和人血白蛋白，使牛血清的终含量为3~10%，HEPES终含量为20mmol/L，人血白蛋白的终含量为
0.3~3%，并用7.5%的碳酸氢钠溶液将pH调节至7.4~7.8。
[0015]步骤三中传代所使用的温度为33~36°C。
[0016]步骤三中传代病毒接种的最佳MOI为0.001~0.05FFU/细胞，收获病毒液的最佳时间为接种后72~96小时。
[0017]每一代毒种的病毒滴度均采用细胞荧光灶转化单位实验进行。
[0018]本发明还提供了 CTNCEC25株在制备狂犬病病毒灭活疫苗中的用途。
[0019]本发明具有以下有益效果:
[0020]第一方面，本发明提供了 RV CTN-1株对CEC的适应方法，通过该方法获得了一株RVCTN鸡胚细胞适应株一RV CTNCEC25株，该毒株能在CEC上稳定增殖，并具有良好的稳定性和免疫保护性。
[0021]第二方面，本发明提供了一种合适的培养工艺，可使得CTN株在CEC中快速、高效地增殖。
[0022]第三方面，本发明提供了一种利用RV鸡胚细胞适应株建立三级病毒种子库，制备的灭活疫苗，具有良好的免疫保护性，其浓缩纯化前原液效价即可到5IU/ml，可用于生产精制纯化人用狂犬病疫苗。



`[0023]图1RVCTNCEC25株的传代历史。
[0024]图2RVCTN-1株在CEC上的早期病变现象。
[0025]图3RVCTN-1株在CEC上的后期病变现象。
[0026]图4RVCTN-1株驯化过程中的病毒增殖趋势。
[0027]图5RVCTNCEC25株稳定性考察代次的细胞病变现象。

[0028]本发明提供了狂犬病病毒CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，如图1所示，包括以下步骤:
[0029]步骤一:将RV CTN-1V5在vero细胞中连续传10代，得到CTN-1V15株。
[0030]步骤二:将CTN-1V15株毒种在鸡胚中传I代，获得的RV CTN鸡胚一代病毒。
[0031]步骤三:将RV CTN鸡胚一代病毒在鸡胚成纤维细胞(CEC)中进行传代，使其逐渐适应CEC。
[0032]本发明涉及在CEC上适应RV CTN-1株，所采用的是SPF级白来航鸡种蛋(简称SPF级种蛋，来源:新兴大华农禽蛋有限公司，地址:中国广东省新兴县勒竹镇榄根温氏集团总部后山SPF场，下同)，驯化所采用的RV CTN-1株来源于中国食品药品检定研究院，为CTN-1株vero细胞5代毒种，即RV CTN-1V5株。SPF种蛋和RV CTN-1株是WHO批准用于制造人狂犬病疫苗的基质和病毒株。
[0033]本发明所涉及的CEC悬液的制备过程如下所示:[0034]选用产出一周以内、形态正常、蛋壳厚薄均匀一致、无裂纹、蛋白浓稠的SPF级白来航鸡种蛋(来源:新兴大华农禽蛋有限公司，地址:中国广东省新兴县勒竹镇榄根温氏集团总部后山SPF场，下同)，放入37~39°C、相对湿度40~80%的孵蛋器内进行孵育，用检卵灯观察是否为受精卵及其活力。选用9~11日龄、鸡胚发育正常、可见清晰的血管及活动的鸡胚。用0.2% (m/v)新洁尔灭溶液浸泡5分钟后捞出，气室向上置于蛋托上,然后用2% (m/v)碘酊和75% (v/v)酒精消毒后移入超净台内。用无菌镊子取出鸡胚，放入盛有I XHanks溶液的平皿内。去除鸡胚的头、内脏，放入灭菌广口瓶内，用无菌剪刀剪切成I~3mm3的组织块，按照每枚鸡胚5~8ml的量加入预热至37°C的0.1% (m/v)胰酶溶液，置于37°C水浴箱内消化15~30分钟。消化完毕，加入50~250ml细胞生长液(以199培养基为基础，添加终浓度为3~5% (v/v)的牛血清，199培养基可购自北京清大天一科技有限公司，型号为M199MD505，下同。为区别后面的培养基，该培养基最终溶液标记为MO)，用无菌细胞吹打管吹打分散细胞得到细胞悬液。取1.0ml细胞悬液经磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4，下同)10倍稀释后与等体积0.4% (m/v)台盼蓝混合均匀后，用血球计数板进行细胞计数，根据计数结果，调整细胞密度为0.8~1.4X IO6个细胞/ml的悬液，备用。
[0035]本发明所涉及的PBS (pH7.4)的制备方法如下所示:
[0036]称取8.0g氯化钠，0.2g氯化钾，0.27g磷酸氢二钾，1.42g磷酸二氢钠，加入800ml注射用水充分搅拌混匀，然后加入38%的浓盐酸调pH至7.4，最后定容至1000ml。经121 °C、15分钟灭菌后，室温保存备用。
[0037]以下将通过具体实施例进行详细说明:
[0038]实施例1
[0039]以CTN-1V5株为母毒株，通过多条传代途径和工艺的比较筛选，发现按下列工艺路线传代获得的毒株能逐渐适 应在鸡胚细胞中的生长，该狂犬病毒鸡胚细胞适应株被命名为 CTNCEC25 株。
[0040]步骤一:将CTN-1V5株在vero细胞上进行传代，以提高病毒滴度。
[0041]用PBS(pH7.4)将RV CTN_1V5(来源于中国食品药品检定研究院，为CTN-1株vero细胞5代毒种)做10倍系列稀释，然后按照1:100~1:1000的比例接种vero单层细胞(来源于中国食品药品检定研究院，121代)，37 °C吸附60分钟后补加细胞维持液(以199培养基为基础，添加终浓度10% (v/v)的牛血清，pH7.2~8.0)，置于37°C、5%C02培养箱内静置培养，培养4~6天收获病毒上清液，如此连续传10代，得到病毒滴度可达7.51gLD50/ml以上的 CTN-1V15 株。
[0042]步骤二:将CTN-1V15株毒种在鸡胚中传I代，获得的RV CTN鸡胚一代病毒。
[0043]随后将获得的CTN-1V15株毒种经PBS (ρΗ7.4) 1:10~1:1000稀释后，取病毒稀释液经卵黄囊接种6~7日龄的SPF鸡胚，每胚0.5ml，置于37~39°C、相对湿度40~80%的全自动孵蛋箱内进行孵育，逐日观察(24小时内死亡的接种胚记为非特异性死亡)，孵育至72~144小时，收取濒临死亡但未死亡的胚胎，去除鸡胚的头后，将躯干研磨粉碎，并按照鸡胚重量加入病毒保护液(以199培养基为基础，添加终浓度20% (v/v)牛血清，pH7.2~8.0)制备成 10% (m/v)的病毒悬液,然后 2000rpm (Revolutions Per Minute,rpm)、4°C离心10分钟，取上清按照1.0ml/支分装至专用冻存管，取样进行病毒滴度测定，如此传一代，获得RV CTN鸡胚一代病毒即CTNCEOI，检测其滴度为5.21gLD50/mL.[0044]步骤三:将RV CTN鸡胚一代病毒在鸡胚成纤维细胞(CEC)中进行传代，使其逐渐适应CEC。
[0045]将步骤二获得的RV CTN鸡胚一代病毒(CTNCE01)用PBS (pH7.4)适宜稀释后(10°~10_4)，按照不同的接种比例(1:10~1:5 X IO5)与前述制备好的CEC悬液(MO，细胞密度为0.8~1.4X IO6个细胞/ml)混合均匀，分装入细胞培养瓶内，置于35~37°C、5%C02培养箱内培养。培养至细胞出现病变(主要表现为病变细胞聚集，圆缩，更快老化与脱落，见图2)收获病毒液，继续将病毒在CEC上按照上述培养条件进行传代。
[0046]传代过程中采用倒置显微镜观察接种病毒后的细胞的形态变化，结果发现随着传代次数的增加，病毒在细胞上的病变渐渐增强，病变的细胞逐渐出现疏松、空泡、胞质浓缩、胞浆中细胞器大量破坏甚至溶解的现象(见图3)，有别于初期病变细胞只是聚集、圆缩的现象。
[0047]同时采用细胞突光灶转化单位实验(Fluorescence Focus Units Assay, FFU,具体操作如下)对每一代毒种均取样测定病毒滴度。结果表明，RV CTN开始不能良好复制，传四
[0048]代后，病毒滴度降至最低(4.51gFFU/ml)，但随后病毒滴度开始缓慢上升，传至20代后，
[0049]滴度升高并稳定至6.0lgFFU/ml (结果详见图4)。
[0050]细胞 突光灶转化单位实验(Fluorescence Focus Units Assay, FFU)测定病毒滴度:
[0051]①将待测病毒样品用PBS先进行10倍系列稀释，再进行3倍系列稀释。然后取50 μ I稀释后的病毒液接种50 μ I细胞密度为IXlO6个细胞/ml的BSR细胞(来源于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制研究所，25代)。混合均匀后置于37°C，5%C02培养24小时。
[0052]②丙酮固定及染色
[0053]a.上述培养24小时后，倒弃上清液，用PBS (pH7.4)洗涤一遍。
[0054]b.每孔加入50 μ 180% (v/v)冷丙酮，置于_20°C固定30分钟。
[0055]c.每孔加入50 μ I FITC标记的抗狂犬病病毒抗体(Millipore公司，Cat.N0.5100)，置于37°C孵育30分钟，倒去抗体溶液。
[0056]d.用PBS洗涤三遍，甩干，每孔加入50 μ 180% (v/v)甘油，直接置于荧光显微镜下观察每个稀释度的荧光灶数目。
[0057]e.取> 10个和< 10个荧光灶的相邻两孔稀释度的数据按照下列公式计算结果。
[0058]待测样品滴度(lg FFU/ml)=lg{[(高稀释度的荧光平均数X3+低稀释度的荧光平均数)1/2X低稀释倍数X 1000/50}
[0059]表1
[0060]