一种全自动细胞计数器的制造方法 [0002]由于细胞在培养时必须保持一定的密度才能有较好的活性，因此在细胞的复苏、培养、冻存过程中均需要根据实际情况多次进行细胞计数；细胞治疗临床应用中需要不同的细胞浓度，故需要细胞计数。 [0003]目前常用的方法包括图像识别法和电阻抗计数法。 [0004](一)图像识别法原理是:将细胞悬液经胎盘蓝染色后，加入玻璃的血细胞计数板，经显微放大光路将细胞图像放大，活细胞中心区域透亮周围有一圈蓝色，呈现为一透亮的圆环状；死细胞的图像为蓝色斑点(能与背景颜色区别开)。人工计数时，需要操作者在显微镜下逐个数出活细胞和死细胞的总数，推算出死细胞和活细胞的浓度；自动计数时，仪器应用特制的计算机图像识别软件通过图形抓取，分析图像的圆度、直径、颜色灰度等参数，能全自动计算出计数板中活细胞浓度(数量/毫升)、死细胞浓度(数量/毫升)、细胞总数(含死细胞和活细胞)值，活细胞比例等数据，并能存储到仪器内或通过U盘等转移到其他计算机存储介质。 [0005](二)目前图像识别法的缺点: [0006]1、此类方法中常用的染料均为核染料，对活细胞有一定的毒性； [0007]2、只能实现离线计数，细胞必须脱离培养体系方能计数，不能实现实时在线计数(不脱离培养体系);
[0008]3、对于胚胎干细胞等需要后续培养增值的细胞计数后不能再使用的。
[0009]4、无法判断具有内吞功能细胞的活性及数量，以及处于细胞凋亡过程中后期的细胞(此时细胞已经进入不可逆的死亡程序，但仍拒染台盼蓝)。
[0010]基于以上几点，传统的经染色再进行图像识别的细胞计数法存在较大的局限性。
[0011](三)电阻抗计数法:以检测电解质溶液中悬浮的细胞在通过计数通道时引起的电阻变化为基础，进行细胞计数和体积的测定，这种方法称为电阻抗法，也称为库尔特原理。
[0012](四)电阻抗法缺点:
[0013]1、由于电阻抗法中的小孔管的内径仅有25 μ m，因此目前采用电阻抗的仪器均无法对直径大于25 μ m的细胞(比如人类的卵细胞直径达100 μ m)进行计数。
[0014]2、细胞碎片形成的团块、稀释液中的杂质团块以及双联体细胞均会影响细胞计数的准确性。
[0015]3、细胞的计数信号和干扰信号在放大过程中同时被放大，极大的影响了结果的可靠性。
[0016]4、为了使仪器能准确甄别细胞，仪器需要进行经常性的质控，重设定阈值。
[0017]5、检测电场的存在对细胞的活性以及再培养也会产生不良影响。实用新型内容
[0018]本实用新型主要是解决现有技术所存在的技术问题；提供了一种可以自动识别非染色细胞，也可以自动识别染色细胞。克服了传统图像识别法需要染色的缺点的一种全自动细胞计数器；
[0019]本实用新型其次是解决现有技术所存在的技术问题；提供了一种使用图像识别的方法，避免了电阻抗计数法准确度低、应用范围窄、需要经常校正的缺点；经本实用新型计数的细胞可进行再培养(扩增)，保证了科研的连续性的一种全自动细胞计数器。
[0020]本实用新型的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的:
[0021]一种全自动细胞计数器，其特征在于，包括点光源、设置在点光源下方的凸透镜、设置在凸透镜下方用于放置待测细胞悬液的的计数片、设置在计数片下方的调焦物镜、设置在调焦物镜下方的滤光片、以及设置在滤光片下方用于将滤光片所获取的光信号转换为电信号后用于分析的分析系统。最终实现不需要染色(非染色)时准确判断死细胞或活细胞状态以及计数功能。
[0022]在上述的一种全自动细胞计数器，所述分析系统包括位于滤光片下方用于接收光信号并将光信号转换为电信号的感光芯片，一个控制器，一个连接控制器和感光芯片的数据线以及与控制器连接的显示器。
[0023]在上述的一种全自动细胞计数器，所述感光芯片采用镁光公司MT9T001芯片；所述控制器为计算机。
[0024]因此，本实用新型具有如下优点:可以自动识别非染色细胞，也可以自动识别染色细胞；本实用新型使用图像识别的方法，避免了电阻抗计数法准确度低、应用范围窄、需要经常校正的缺点；经本实用新型计数的细胞可进行再培养(扩增)，保证了科研的连续性。




[0025]附图1是本实用新型的一种结构原理示意图。


[0026]下面通过实施例，并结合附图，对本实用新型的技术方案作进一步具体的说明。
[0027]实施例:
[0028]首先，介绍本实用新型的结构本实用新型包括点光源1、设置在点光源I下方的凸透镜2、设置在凸透镜2下方用于放置待测细胞悬液的的计数片3、设置在计数片3下方的调焦物镜4、设置在调焦物镜4下方的滤光片5、以及设置在滤光片5下方用于将滤光片5所获取的光信号转换为电信号后用于分析的分析系统。
[0029]分析系统包括位于滤光片5下方用于接收光信号并将光信号转换为电信号的感光芯片6，一个控制器8，一个连接控制器8和感光芯片6的数据线7以及与控制器8连接的显不器10。
[0030]使用时，首先用移液器取待测细胞悬液10ul，不用染色，直接加入3计数片中并插入仪器；
[0031]打开感光芯片(图1第6)的参数设置；
[0032]先做白平衡，记录白平衡后的所有参数值:R (红光增益)、G (绿光增益)、B (蓝光增益)、伽马值、对比度、自动色彩增益、自动曝光值等，将这些参数值作为基本值(以下简称基本值);
[0033]降低RG(红绿)的增益，降为基本值的1/3至2/3之间。即降低了感光芯片(图1第6)对RG(红绿)光强的接收能力(仪器已经调至最佳值并设为默认值)；
[0034]增大B (蓝)的增益，增大为基本值的I至2倍。即增强了感光芯片(图1第6)对B (蓝)光强的接收能力(仪器已经调至最佳值并设为默认值)；
[0035]此时10显示器背景为浅蓝色:点光源(图1第I)发出的光经凸透镜(图1第2)、计数片(图1第3)、调焦物镜(图1第4)、滤色片(图1第5)、感光芯片(图1第6)将光信号转换成电信号，并经数据线(图1第7)传输到控制器(图1第8)，最终在显示器(图1第10)上显示的背景为浅蓝色(仪器已经调至最佳值并设为默认值)。
[0036]仪器光路中的滤光片(图1第5)阻止了 RG (红绿)光的干扰，只允许B (蓝)光通过，这时活细胞反射的B(蓝)光强大于死细胞反射的B(蓝)光强；
[0037]关掉自动曝光功能，手动调节曝光时间和曝光增益，不同种类和厂家生产的感光芯片(图1第6)需要调节的范围不同，以能将死细胞图像与背景明显区分开为准(仪器已经调至最佳值并设为默认值)。具体调节方法:活细胞反射的B (蓝)光因强度大，首先在感光芯片(图1第6)上成像，显示器(图1第10)能逐渐看到圆形蓝斑(比背景颜色深)；继续增加曝光时间，先出现的圆形蓝斑(比背景颜色深)变为圆形亮斑(因为曝光时间过长，出现过曝现象)，同时会有新的圆形蓝斑(比背景颜色深)出现。此时，显示器(图1第10)的背景是浅蓝色，圆形亮斑是活细胞的图像，而圆形蓝斑(比背景蓝色深)就是死细胞的图像。通过非染色细胞图像识别软件分析(图1第9)，区分死细胞和活细胞的数量、浓度、直径、面积、比率等。
[0038]该实用新型仪器经改造可实现非染色在线细胞计数。
[0039]下面是对比试验。
[0040]使用移液器分别取细胞悬液50ul，加入A管和B管；将B管加入50ul胎盘蓝(0.4%)后混匀；
[0041]从A管取1ul加入计数片的“I”位，更换新的移液头后从B管取1ul加入计数片的“2”位。
[0042]将计数片插入仪器中。
[0043]使用“非染”功能计数“ I”位。
[0044]使用“染色”功能计数“2”位。
[0045]两种方法计数结果误差在5%之内，通过进一步优化图像识别软件，可同时提高两种方法的准确性。
[0046]在本实施例中，控制器即计算机为公知技术，在本实用新型中不是重点，被实用新型主要保护光学系统的硬件结构。
[0047]本文中所描述的具体实施例仅仅是对本实用新型精神作举例说明。本实用新型所属【技术领域】的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本实用新型的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。