专利名称：由人多潜能干细胞制备人黑色素细胞的方法黑色素细胞是色素产生细胞，其负责皮肤、眼睛和毛发的着色。在脊椎动物的发育中，黑色素细胞源于神经嵴，并且经历命运特化、増殖、迁移、存活(survival)和分化的复杂过程后最终存在于表皮中。色素沉着(pigmentation)由在被称为黑色素体的特定细胞器中高度受控的黑色素生产而获得。通过被称为黑素生成这ー过程，黑色素体沿着所述树突进行运输并被转移至生长的毛发，或被转移至周围的角质形成细胞以在保护人组织抵抗导致DNA损伤和组织癌症的阳光紫外线(UV)辐射的有害影响中发挥重要作用。在过去10年中，几种基因已被关联于涉及黑色素细胞的色素性疾病。这些疾病可分为三种类型。第 ー种，影响黑色素细胞从神经嵴中发育的疾病(斑驳病、瓦尔登布尔氏(Waardenburg)综合征和遗传性对称性色素异常症)，第二种，具有黑色素合成缺陷的疾病(白化病)以及第三种，黑色素体成熟或转移疾病(赫曼斯基-普德拉克(Hermansky-Pudlak)综合征、契-东(Chediak-Higashi)综合征和格里塞利(Griscelli)综合征)(Rose PT等)。有趣的是,尽管为更好地了解成熟黑色素细胞的功能和调控已经进行了大量的努力，但是对人体内涉及黑色素细胞从胚胎前体的发育和分化的分子和细胞机理仍然所知甚乏。用ー组胚胎转化因子转化体细胞产生了具有胚胎干细胞(hESC)的多潜能特性的细胞。这些诱导的多潜能干细胞(hiPSC)具有分化成为任意细胞类型的潜能，这使其成为潜在来源，从其中产生细胞以作为治疗平台用于广泛疾病的治疗。作为这些细胞治疗效益的概念验证(proof of concept),据表明源于hiPSC的骨髓细胞可在适当的人源化小鼠模型中逆转铼刀型细胞贫血症表型。黑色素细胞的体外诱导最初由Yamane等(1999)所报道，他们在21天期间在包含干细胞因子(SCF)、内皮素3 (EDN3)、12_0_十四烷酰-佛波醇13-こ酸酯(TPA)和地塞米松的培养基中将小鼠胚胎干细胞共培养于单层基质细胞系ST2之上。更近期间，Herlyn实验室(Fang等,2006)已经表明通过使用人拟胚体,在不存在滋养细胞的情况下使用蛋白质诱导物的組合，即Wnt3a、内皮素-3和SCF，可从hESC产生黑色素细胞。但是，在先前领域中并无使用2D方案从人多潜能干细胞中产生人黑色素细胞的方法的报道。因此，该领域中仍然存在从人多潜能干细胞中产生人黑色素细胞的新方法的需求。发明简述本发明涉及用于获得源自人多潜能干细胞的人黑色素细胞群的离体方法，所述方法包括步骤a)在刺激表皮诱导的试剂和刺激角质形成细胞的終末分化的试剂存在下共培养人多潜能干细胞与支持外胚层分化的细胞。本发明还涉及可通过上述方法获得的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群。本发明还涉及药物组合物，其包含上文所述的源自人多潜能干细胞的基本上纯的同质人黑色素细胞群以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在进ー步方面，本发明还涉及用于治疗方法的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群或上文所述的药物组合物。本发明还涉及制备人皮肤替代品的方法，其包括提供本发明的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群的步骤和提供人角质形成细胞群的步骤。此外，本发明涉及可通过上文所述的方法获得的人皮肤替代品并且涉及其在治疗方法中的应用。在另ー个方面，本发明涉及用于筛选对人黑色素细胞具有给定生物效应的化合物 的方法，其包括以下步骤i)在测试化合物存在或不存在的情况下培养根据上文所述的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群；ii)比较在所述测试化合物存在或不存在的情况下黑色素细胞群中的所述给定生物效应。本发明还涉及根据上文定义的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群或人皮肤替代品用于筛选化合物的应用。发明详述本发明涉及用于获得源自人多潜能干细胞的人黑色素细胞群的离体方法，所述方法包括步骤a)在刺激表皮诱导的试剂和刺激角质形成细胞的終末分化的试剂存在的情况下将人多潜能干细胞与支持外胚层分化的细胞共培养。所述术语“黑色素细胞”具有其在本领域中的通常含义。它是指上皮和毛发中有色的黑色素分泌细胞，其负责所述皮肤和毛发的着色。有利地，本发明的离体方法是ー种2D方法，其实现了对所述人多潜能干细胞分化成人黑色素细胞的不同阶段的监控。因此，本发明方法可用于筛选干预(正性或负性)该分化过程的化合物。“细胞培养表面”或“细胞培养基质”的表述是指适用于细胞培养的各种类型的表面或基质。所述术语“细胞培养表面”包括但不限于组织培养平板、碟、孔或瓶。在ー个特定的实施方案中，所述培养表面是所述培养平板、碟、孔或瓶的塑料表面。所述细胞培养表面与真皮成纤维细胞的包被相客。本文所使用的表述“支持外胚层分化的细胞”是指提供适当的底物并且分泌适当的因子以支持人多潜能干细胞的生长和分化的细胞。在ー个特定的实施方案中，支持外胚层分化的细胞选自成纤维细胞，更特别地选自人和小鼠成纤维细胞，并且更特别地选自真皮成纤维细胞。在ー个特定的实施方案中，支持外胚层分化的细胞是丝裂霉素灭活的或放射灭活的人真皮成纤维细胞。在本发明的一个实施方案中，支持外胚层分化的所述细胞是滋养成纤维细胞。本文所使用的表述“滋养成纤维细胞”是指作为多潜能干细胞的基底层使用并且为将干细胞维持在未分化状态而不丢失多潜能性而提供分泌因子、细胞外基质和细胞接触的细胞。滋养细胞可通过Y射线照射或丝裂霉素进行灭活。根据本发明的一个实施方案，所述滋养成纤维细胞可来自成纤维细胞，更特别地来自人和小鼠成纤维细胞，并且更特别地来自真皮成纤维细胞，其包括真皮成纤维细胞系。真皮成纤维细胞系的实例包括但不限于 CCD-1112SK (Hovatta O 等，2003)和 3T3-J2 (Rheinwald JG 等，1975)。在ー个具体的实施方案中，在被包被于所述培养表面之前，预先处理真皮成纤维细胞以终止其増殖。因此，可使用放射线照射或使用细胞周期阻断剂如丝裂霉素处理真皮成纤维细胞。本文所使用的术语“真皮成纤维细胞”是指合成和維持真皮细胞外基质的细胞群。真皮成纤维细胞的特异性标记物包括波形蛋白和FAP(成纤维细胞活化蛋白)。根据本发明的一个实施方案，以真皮成纤维细胞可天然粘附其上的方式选择所述细胞培养表面。可选择各种材料的细胞培养表面。这些材料的实例包括但不限于塑料组织培养皿或以明胶包被的培养皿。本文所使用的表述“刺激表皮诱导的试剂”是指能够诱导表皮标记物如角蛋白8和角蛋白18表达的试剂。刺激表皮诱导的试剂一般抑制滋养层和中胚层诱导。在ー个特定的实施方案中，所述刺激表皮诱导的试剂选自骨形态发生蛋白(如BMP-2、BMP-4 和 BMP-7)、受体调控的 Smad 蛋白(如 Smad I、Smad 5 和 Smad 9)和 TGF-β家族配体(如生长和分化因子6 GFD-6) (Moreau等，2004)。在一个优选的实施方案中，所述刺激表皮诱导的试剂选自BMP-2、BMP-4、BMP-7、SmadU Smad5、Smad7和GFD-6。在ー个优选的实施方案中，所述刺激表皮诱导的试剂是BMP-4。所述术语“BMP-4”是指骨形态发生蛋白4。BMP-4是属于TGF-β超家族蛋白质的多肽。示例性的天然ΒΜΡ-4氨基酸序列在GenPept数据库中以登录号AAC72278提供。在一个实施方案中，所述刺激表皮诱导的试剂选自BMP-2、BMP-4、BMP_7、SmadUSmad5、Smad7 和 GFD-6。在一个优选的实施方案中，所述刺激表皮诱导的试剂是BMP-4。BMP-4的浓度可介于O. 02nM至77nM或介于O. 3ng/mL至1000ng/mL。在ー个特定的实施方案中，BMP-4的浓度是O. 5nM。本文所使用的表述“刺激角质形成细胞的終末分化的试剂”是指刺激角蛋白5和角蛋白14表达的试剂。实际上，角蛋白5和角蛋白14是能够在3D培养物中終末分化的基底角质形成细胞的标记物。在ー个特定的实施方案中，所述刺激角质形成细胞的終末分化的试剂选自抗坏血酸和视黄酸。在一个优选的实施方案中，所述刺激角质形成细胞的终末分化的试剂是抗坏血酸。所述术语“抗坏血酸”是指(R) _3,4_ ニ轻基_5_ ((S) -1, 2_ ニ轻こ基)咲喃_2 (5H)-酮，其具有以下结构式本发明涉及用于获得源自人多潜能干细胞的人黑色素细胞群的离体方法，所述方法包括在刺激表皮诱导的试剂和刺激角质形成细胞的终末分化的试剂存在下共培养人多潜能干细胞与支持外胚层分化的细胞的步骤。本发明还涉及可通过所述方法获得的人黑色素细胞以及其在细胞治疗和筛选试验中的用途。