交替假单胞菌生态菌剂的制备及在海水养殖上的应用制作方法

陈刚, 包振民, 李振玲

2003年7月9日

2002年5月20日

2001年12月27日

青岛海洋大学

A61K35/74GK1428148SQ0211954

菌剂 单胞菌 制备 交替 生态

1.一种交替假单胞菌生态菌剂的制备方法，其特征是首先分离纯化出交替假单胞菌落，即捕获健康的对虾个体(50～100g)，迅速将其放置于盛有灭菌海水的无菌容器中进行如下操作，用无菌海水冲洗其表面3次，每次不超过30秒，然后再将其放置在无菌海水中，剧烈震荡2～5分钟，用无菌器械将养殖动物取出后，从中吸取50～100ml海水无菌操作涂布在以灭菌海水配置的灭菌的固体培养基(2216E)上，在25～30℃进行培养48小时，选取其中呈桔黄色的菌落，通过革兰氏染色和鞭毛染色，以选其中具有革兰氏阴性和极生单鞭毛的直杆状特征的菌落，然后再进行对常见海水养殖动物致病菌的拮抗性检验，再将纯化后的具有拮抗作用的菌株进行筛选，将获取的交替假单胞菌进行细菌的培养和发酵，即以2216E溶液进行0倍～6倍稀释后的液体培养液均可作为发酵液，用1M盐酸和1M的NaOH调节pH在7.2～8.5之间，发酵条件接种量以发酵体积的10％～20％，接种后细菌浓度106～107Cfu/ml为宜，在温度25～30℃以100～260rpm频率震动培养24～36小时，将发酵后的菌液通过4～10℃下以3000g～10000g的离心力进行离心，除去培养液，收集菌体，用灭菌海水进行稀释成不同浓度待使用2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是上述发酵步骤中以灭菌海水配置的pH在7.2～8.5之间的蛋白胨浓度0.2％～1％，含有0.01％FePO4或柠檬酸铁的液体培养基进行发酵3.交替假单胞菌生态菌剂制的应用方法，其特征是本发明制备的菌剂按养殖水体积折算为103-105cfu/ml剂量，用养殖海水稀释后泼洒全池或进行搅拌保证均匀使用，一般预防病害的使用频率为7～14天一次，剂量为103-104cfu/ml，在高密度养殖，或有疫情时可增加使用频率4～5天施用一次4.如权利要求3所述的交替假单胞菌生态菌剂制的应用方法，其特征是以107-108cfu/kg的比例拌食投喂，均匀混拌，阴干后投喂，一日三次，连续投喂或间隔一天投喂

本发明涉及一种交替假单胞菌生态菌剂的制备及在海水养殖上的应用长期以来对于水产养殖病害的防治以使用抗生素和其它化学药物为主要措施，但化学治疗有许多弊端，破坏水体的微生态环境，存在药物残留，影响水产品品质以及对环境造成污染等问题据不完全统计，全国每年海洋水产养殖病害发病率达60％以上，损失率20％左右，直接经济损失就达百亿元之巨，并且还有上升的趋势如何通过改善整个养殖水体生态环境，抑制病原微生物生长，减少疾病的发生已成为世界各国水产养殖业所共同关注的焦点问题近年来，人们开始尝试在养殖水体中施用益生微生物来改善养殖微生态环境本发明的目的是提供一种用于改善海水养殖动物水体的微生态环境，预防养殖病害，提高养殖动物成活率的一种有益菌制剂一交替假单胞菌生态菌剂的制备及在海水养殖上的应用以减少抗生素和其他化学药物的使用，降低养殖费用，减少污染，维护生态平衡本发明的另一个目的是将可规模发酵生产的该有益菌剂合理使用本发明的制备方法是先从健康对虾扇贝等海水养殖动物的体表分离出对常见致病菌有拮抗作用的菌落纯化后进行对海水养殖动物的安全性检验以及对增强海水动物抗病能力方面的检验，并对该菌的保存和发酵条件优化，以发酵罐中按照优化的条件进行大量的生产，最后通过离心浓缩后制备成一定浓度的菌剂，进行合理使用本发明是一种微生物控制技术，是利用微生物普遍存在的拮抗现象，即利用在同一生态位中微生物通过营养竞争、空间竞争或分泌抗生素、细菌素等毒素抑制其他微生物的生长这一原理，将具有拮抗特性的益生菌施入养殖水体，杀死或抑制病原微生物，为养殖动物营造良好的生存环境通过使用该菌剂可改善养殖水体的生态环境，抑制病原微生物的生长，减少病害的发生，降低养殖成本和提高养殖动物的成活率并且该菌剂具有不污染环境等环保特点这种效益将是潜在的，长期的，这将成为未来水产养殖业中的一个重要研究和发展方向下面通过具体实施例进一步说明本发明本发明的菌剂制备方法分为四大步骤，其中分离纯化及检验和筛选，即步骤A、B、C在于得到有效菌株，最后步骤D是培养和发酵，以利规模化生产该菌剂，下面详细叙述，以方便实施A、首先分离纯化出交替假单胞菌落，即捕获健康的对虾个体(50～100g)等养殖动物，迅速将其放置于盛有灭菌海水的无菌容器中进行如下操作用无菌海水冲洗其表面3次，每次不超过30秒，然后再将其放置在无菌海水中，剧烈震荡2～5分钟，用无菌器械将养殖动物取出后，从中吸取50～100ml海水无菌操作涂布在以灭菌海水配置的灭菌的固体培养基(2216E)上，在25～30℃进行培养48小时，选取其中呈桔黄色的菌落分别通过革兰氏染色和鞭毛染色，以选其中具有革兰氏阴性和极生单鞭毛的直杆状特征的菌落B、然后再进行对常见海水养殖动物致病菌的拮抗性检验检验的方法是首先选取可在海水培养基2216E上生长的海水养殖常见的细菌性病害病原菌如鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、霍乱弧菌非O1型、创伤弧菌、漂浮弧菌，河弧菌，最小弧菌，杀鲑弧菌，病害鱼弧菌，迟钝爱德华氏菌，海水屈挠杆菌，变异微球菌，分支杆菌以及肠杆菌等作为指示菌，再采用十字交叉划线法，将待检测菌和指示菌相互垂直交叉划线接种于2216E平板上，25～30℃下培养24～36小时选取对大多数菌都有拮抗活性的菌株，即得到交替假单胞菌C、再将纯化后的具有拮抗作用的菌株按下列方法进行进一步筛选a、安全性检测.以筛选的菌株进行对海水养殖动物的安全性实验可选取海水养殖动物不同时期的个体分组进行(例如对虾不同时期的幼虾，稚虾或成虾)施用不同剂量103-105cfu/ml筛选菌株于养殖水体，以不加任何菌剂的组为对照，从中选取在各种剂量组(103-105cfu/ml)施用后养殖动物存活率较高的菌株b、提高抗病力检测各种对养殖动物施用该菌，以剂量在103-105Cfu/ml，同时在养殖动物水体中加入已经被证实为病原的细菌(例如哈维氏弧菌，鳗弧菌等)105cfu/ml，共同培养一定的时间后检察对养殖动物的保护作用即成活率的高低在生产过程中需要菌种保存，通常分中、长期菌种保存长期保存在2216E固体斜面划线培养24小时后用无菌的生理盐水冲洗到无菌的安培瓶，无菌冷冻干燥，密封长期保存5～10年中长期保存在2216E斜面划线培养24小时后用无菌的生理盐水冲洗到无菌的无菌容器中，加入13％～20％的无菌甘油和一定量的生理盐水稀释为大约106～107Cfu/ml浓度在-70℃以下的低温冰箱或液氮中保纯可保存1～2年左右上述菌种保存都应严格无菌操作，以免污染在以上分离纯化和筛选的基础上得到该菌株，再将该菌株通过规模发酵制备成菌剂，其菌剂的制备方法是D、将获取的交替假单胞菌进行细菌的培养和发酵细菌的发酵液配方可任选下列之一发酵液配方一以灭菌后海水，按2216E配方为基础配制的，对2216E溶液进行0倍～6倍稀释后的液体培养液均可作为发酵液，用1M盐酸和1M的NaOH调节pH在7.2～8.5之间发酵液配方二以灭菌海水配置的pH在7.2～8.5之间的蛋白胨浓度0.2％～1％，含有0.01％FePO4或柠檬酸铁的液体培养基进行发酵发酵条件接种量以发酵体积的10％～20％，接种后细菌浓度106～107Cfu/ml为宜，在温度25～30℃以100～260rpm频率震动培养24～36小时发酵结束后立即进行细菌活菌计数，培养液活菌浓度都可达到108～109cfu/ml将发酵后的菌液通过4～10℃下以3000g～10000g的离心力进行离心，除去培养液，收集菌体，用灭菌海水进行稀释成不同浓度待使用为改善水体中微生态环境，抑制病原菌细菌生长，提高养殖动物的成活率和抗病能力作为应用，可将制备的菌剂以103～105cfu/ml，直接施于养殖水体，或以107-108cfu/kg的比例拌食投喂两种方法下面给出详细使用方法和具体实施例方法1直接施用于养殖水体，例如对虾、扇贝、蟹和鱼的育苗期或养成期的水体将发酵后离心洗涤浓缩后的菌液，按养殖水体积折算为103-105cfu/ml剂量，用养殖海水稀释后泼洒全池或进行搅拌保证均匀使用一般预防病害的使用频率为7～14天一次，剂量为103-104cfu/ml施用该生态菌剂前后严禁与抗生素同时使用在高密度养殖，或有疫情时可增加使用频率4～5天施用一次应用实例1在海湾扇贝育苗中的应用在扇贝育苗中将103～105Cfu/ml交替假单胞生态菌剂加入到养殖实验水体，经正常育苗管理后，可降低水体中细菌总数，和弧菌数并且明显提高了扇贝幼苗的变态率成活率应用实例2在日本对虾育苗期的应用在日本对虾无节幼体养殖水体中施加交替假单胞生态菌剂104cfu/ml，五天后，施用交替假单胞生态菌剂可明显提高日本对虾无节幼体的成活率，并且具有明显的抑制病原菌生长的作用应用实例3在斑节对虾籽虾期(PL-15期；500尾/组，每个处理三组平行组)在养殖的水体中施加104cfu/ml剂量交替假单胞生态菌剂5天后计算成活率结果交替假单胞生态菌剂处理的籽虾成活率41.2％比未使用菌剂的对照组30.47％有明显提高说明施用了有益菌后改善了养殖水体的微生态环境，提高养殖成活率方法2拌食投喂以107-108cfu/kg的比例，将交替假单胞生态菌剂与商品饵料(例如山东牟平鱼虾饲料厂的大乐牌商品饵料)均匀混拌，阴干后投喂一日三次，连续投喂或间隔一天投喂，在整个生长期都可投喂，注意不可与抗生素以及其他化学药品同时投喂应用实例4以108cfu/kg拌菌饵料投喂日本对虾稚虾连续投喂50天后平均体长/体重为8.16cm/5.26g高于对照组7.86cm/4.67g另外的实验表明拌有该菌剂的饵料投喂对虾的免疫力增强，对虾血清的抗菌(副溶血弧菌)活力明显高于未拌该菌的对照组对拌菌饵料组对虾用致病菌细菌人工感染实验结果表明对虾的成活率92.5％高于对照组成活率77.2％以上方法制备的交替假单胞细菌菌剂在海水养殖上的应用具有使用简单和无污染的环保特点，还具有杀菌、抑菌的广普性，并且可通过发酵规模化生产，使用费用低，节省育苗成本